淫羊藿中山柰酚防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制的研究進(jìn)展

郝慶飛 袁普衛(wèi) 孟慶豪 趙怡凡 劉德玉 王占魁 余紅超

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，陜西咸陽(yáng) 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨病科，陜西咸陽(yáng) 712000

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量減少、隨著年齡增長(zhǎng)而骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的骨骼系統(tǒng)疾病。隨著人口老齡化發(fā)展，2018 年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)調(diào)查顯示，我國(guó)＞65 歲的患者OP 患病率高達(dá)32.0%，且每年穩(wěn)定逐步上升[1]。嚴(yán)重影響患者生活水平，已成為世界首要的公共衛(wèi)生問題之一。目前臨床上治療OP 采用雙膦酸鹽、激素代替療法和降鈣素等藥物治療。雖然療效顯著，但副作用大，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量[2]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)中將OP 歸為“骨痿”，又名“腎痿”“骨痹”等。中醫(yī)認(rèn)為OP 的病因病機(jī)大多因腎精虧虛所致。淫羊藿具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋健骨等功效，可有效治療OP，且副作用小[3]。

山柰酚（kaempferol，KAE）是生物類黃酮，廣泛存在于水果、蔬菜和中草藥中。有研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿中活性成分KAE 能有效地促進(jìn)成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）分化，抑制破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）分化，保護(hù)骨密度（bone mineral density，BMD），或許其可成為治療OP 的潛在藥物[4]。因此，本文對(duì)近年來KAE在細(xì)胞、炎癥因子、信號(hào)通路等方面對(duì)OP 的影響進(jìn)行綜述，為臨床上OP 的治療提供新的思路。

1 KAE 防治OP 細(xì)胞水平的研究

1.1 KAE 對(duì)OB 的作用

OB 是骨修復(fù)的重要細(xì)胞，在骨修復(fù)過程中OB 大量增殖分化，作用到修復(fù)部位，再經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)分泌骨基質(zhì)，引起基質(zhì)礦化，從而提高BMD[5]。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是由OB 分泌和合成的蛋白，是OB 成熟分化的主要標(biāo)志。Xie等[6]研究證明，KAE 通過p53 抑制糖皮質(zhì)激素受體，改善地塞米松在MC3T3-E1 細(xì)胞中的作用，且呈劑量依賴性地提高ALP 活性，提示KAE 可以通過調(diào)控激素水平來調(diào)節(jié)OB 的形成，提高BMD。戴燚等[7]發(fā)現(xiàn)，KAE 通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)β-catenin、Wnt 蛋白表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)ALP、前列腺素E2、一氧化氮的含量，同時(shí)調(diào)節(jié)骨保護(hù)素重組蛋白與核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）受體激活蛋白配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）的表達(dá)水平，從而防治OP。說明KAE可能通過提高ALP，從而提高骨鈣素水平，影響骨代謝。以上研究表明，KAE 可能通過調(diào)控下游因子和信號(hào)通路的表達(dá)提高ALP 的活性，提高骨鈣素水平，從而刺激成骨細(xì)胞分化，預(yù)防骨質(zhì)疏松。因此更深入地研究KAE 對(duì)ALP 的調(diào)控機(jī)制具有重大臨床意義，還需要進(jìn)一步探索討論。

1.2 KAE 對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）的影響

BMMSC 是一群非造血的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，可增加成骨細(xì)胞中骨基因的含量，促進(jìn)骨的形成[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，BMMSC 可以促進(jìn)促分裂原活化的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制BMMSC 分化為成脂細(xì)胞來改善OP[9]。王文麗等[10]發(fā)現(xiàn)，KAE 呈劑量依賴性提高BMMSC 向成骨分化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ALP 的活性也呈濃度依賴性提高。說明KAE 可能通過ALP 的活性提高BMMSC 的分化對(duì)防治OP 有重大的臨床指導(dǎo)意義。崔琳娜[11]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KAE 可通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號(hào)通路提高RUNX 和Osterix 相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)BMMSC 向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。表明mTORC1 信號(hào)通路參與KAE 誘導(dǎo)BMMSC 的成骨潛力。綜上所述，可推測(cè)KAE 能通過提高M(jìn)APK 和MTORC1 通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，提高ALP 活性，促進(jìn)BMMSC 向成骨細(xì)胞分化，并抑制BMMSC 分化為成脂細(xì)胞，減少OB 凋亡，提高BMD 水平。MTORC1 和MAPK 可能會(huì)成為治療骨質(zhì)疏松的潛在通路，但尚需實(shí)驗(yàn)支撐。

1.3 KAE 對(duì)OC 的作用

OC 是由巨噬細(xì)胞增殖分化而來的一種具有骨吸收功能的多核細(xì)胞，是主要的骨吸收細(xì)胞，在人體骨骼發(fā)育中的作用至關(guān)重要。OC 中含有參與骨吸收過程的水解酶-抗酒石酸鹽酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP），是OC 分化的主要標(biāo)志。阿吾提·卡斯木[12]發(fā)現(xiàn)，KAE 可以呈劑量依賴性抑制TRAP 的活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)KAE 可以提高M(jìn)APK 信號(hào)通路使MC3T3-E1 細(xì)胞增加。因此KAE 可以通過調(diào)控下游因子促進(jìn)OB 增殖抑制OC 分化，從而防治OP，但其最優(yōu)劑量還不確定。Kim 等[13]通過TRAP 染色發(fā)現(xiàn)，KAE 能抑制小鼠巨噬細(xì)胞自噬并通過降解p62/SQSTM1 促進(jìn)OC 分化，表明KAE 可能通過調(diào)控細(xì)胞自噬來抑制P62/SQSTM1 的表達(dá)，調(diào)控OC。說明p62/SQSTM1 蛋白可能作為KAE 治療OP 的靶點(diǎn)。Akbar 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，KAE 可抑制RANKL/RANK 信號(hào)通路的激活與表達(dá)，抑制OC 的分化與成熟，調(diào)節(jié)骨代謝平衡。綜上所述，KAE對(duì)OC 的作用可能是通過抑制細(xì)胞自噬、誘導(dǎo)OC 凋亡、調(diào)控RAN KL/ RANK/MAPK 等下游信號(hào)通路預(yù)防骨質(zhì)疏松。但關(guān)于OC 的自噬與凋亡機(jī)制十分復(fù)雜，仍需進(jìn)一步研究。

2 KAE 通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子對(duì)OP 的影響

2.1 促炎性細(xì)胞因子Jun

Jun是一種促炎性細(xì)胞因子，與FOS 一起形成AP-1 的二聚體復(fù)合物，通過多種機(jī)制促進(jìn)骨生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而調(diào)節(jié)骨代謝[15]。張泉龍等[16]發(fā)現(xiàn)，淫羊藿能夠能提高下丘腦FoxO1 蛋白的活性，抑制AP-1 活性，從而降低破骨細(xì)胞分化水平，并改善BMD、骨小梁參數(shù)。因此推斷淫羊藿抗OP 機(jī)制可能與AP-1 活性有關(guān)。Behl 等[17]發(fā)現(xiàn)KAE 通過抑制c-Jun N 末端激酶發(fā)揮抗氧化、抗炎作用，抑制OC 的形成。因此推斷KAE 通過下丘腦抑制Jun 的表達(dá)，減少炎癥反應(yīng)，提高交感神經(jīng)興奮，從內(nèi)分泌途徑改善骨代謝，來抑制OC 的形成，從而抑制OP 的發(fā)生與進(jìn)展。因此研究KAE 對(duì)炎癥因子的影響對(duì)抗OP 有重大意義，細(xì)胞抗氧化機(jī)制有可能成為防治OP的重要環(huán)節(jié)，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

2.2 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）

氧化應(yīng)激反應(yīng)可以刺激OC 的成熟和分化導(dǎo)致OP[18]。TNF-α 通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，在OP 中起著維持骨量和重塑骨質(zhì)的重要作用，TNF 還可通過激活NF-κB 通路、促進(jìn)RANKL、抑制OC 分化和增加骨吸收來影響OP[19]。Palacz-Wrobel 等[20]通過細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，30 μmol/L 的KAE 可降低TNF 的表達(dá)，并且通過增加抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6 的分泌來降低炎癥強(qiáng)度。鑒于TNF 在OC 中的作用說明KAE 可能通過減輕炎癥反應(yīng)來維持骨代謝平衡。Wang 等[21]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，淫羊藿等中草藥中KAE 等有效成分能降低大鼠血清中IL-6 和TNF-α 水平，使BMD 指數(shù)明顯提高，且實(shí)驗(yàn)組中骨形態(tài)生成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）表達(dá)顯著升高，從而促進(jìn)OB 活性。說明KAE 抗OP 的機(jī)制可能與BMP-2、Runx2 信號(hào)通路有關(guān)。綜上所述，KAE 能刺激BMP-2、Runx2 信號(hào)通路，降低IL-6 和TNF-α 表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)來刺激OB 成熟，防止骨結(jié)構(gòu)的破壞，維持骨代謝平衡。

2.3 IL 因子

IL-6、IL-8 等是參與骨關(guān)節(jié)病生理學(xué)的主要促炎性細(xì)胞因子。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-8 可以通過刺激OB 的BMMSC 表達(dá)從而刺激成軟骨細(xì)胞成熟分化，其鈣化后再重塑成骨，增強(qiáng)BMP2 的骨誘導(dǎo)性，從而抑制OC 分化[22]。Lee 等[23]研究證明，KAE 可以調(diào)節(jié)IL-1β 水平，抑制RANKL 介導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白酶和重組蛋白激酶磷酸化，以及c-Fos 和NFATc1 的表達(dá)，從而抑制OC 分化與成熟。綜上所述，KAE 可以通過抑制IL，發(fā)揮抗炎作用，刺激BMMSC 表達(dá)激活BMP2 信號(hào)通路，從而促進(jìn)OB，抑制OC，預(yù)示IL 在防治OP 發(fā)生的治療中具有巨大的發(fā)展前景。

3 KAE 防治OP 相關(guān)通路的研究

3.1 核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路

NF-κB 信號(hào)通路在OC 的形成中起著非常重要的作用。NF-κB 信號(hào)通路受到RANKL 細(xì)胞因子和相關(guān)蛋白的嚴(yán)格調(diào)控，最終誘導(dǎo)OC 的形成和分化[24]。Zhu 等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)，KAE 呈劑量依賴性提高骨標(biāo)志物水平。同時(shí)發(fā)現(xiàn)KAE 通過NF-κB 信號(hào)通路來降低IL-10 的釋放和增加IL-6 的釋放來緩解炎癥，同時(shí)發(fā)現(xiàn)KAE 可以抑制BMMSC 的成脂分化。鑒于BMMSC 的作用，KAE 可以通過NF-κB 信號(hào)通路抑制OC。Li等[26]發(fā)現(xiàn)，有效成分KAE 可呈劑量依賴性抑制NF-κB 通路及下游因子TRAP 活性，從而抑制OC 的生成。綜上所述，KAE 可以抑制NF-κB 信號(hào)通路，減少炎癥反應(yīng)，從而預(yù)防OP。NF-κB信號(hào)通路可能會(huì)作為抗OP 的重要靶點(diǎn)，但其機(jī)制復(fù)雜，還需要大量的研究證明。

3.2 雌激素受體（estrogen receptor，ER）信號(hào)通路

ER 主要是刺激成骨細(xì)胞分泌膠原酶，促進(jìn)骨重建，抑制OC活性，減少骨吸收[27]。Guo 等[28]發(fā)現(xiàn)，50 μmol/L 濃度KAE 可呈濃度依賴性提高ER 轉(zhuǎn)錄活性來促進(jìn)OB 分化與成熟。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)KAE 誘導(dǎo)大鼠OB 的ALP 活性增加。鑒于ALP 在OB 中的作用，可以得出KAE 通過刺激ER 信號(hào)傳導(dǎo)作用，使得成骨分化，但其最優(yōu)劑量還需進(jìn)一步完善。Sharma 等[29]發(fā)現(xiàn)，KAE通過刺激ER 信號(hào)傳導(dǎo)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)OB細(xì)胞中ALP、Runx2 等活性增強(qiáng)。說明KAE 可作用于ER，促進(jìn)OB 的分化，減少骨量，抑制OC，使得OB、OC 達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，從而抑制OP。因此，KAE 可以成為雌激素代替療法的中藥治療藥物，但其涉及的信號(hào)通路較多，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.3 KAE 參與激活發(fā)生蛋白BMP/Smads 信號(hào)通路

骨形態(tài)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和BMP2 對(duì)促進(jìn)骨折愈合和骨再生發(fā)揮著巨大的作用，在臨床上可用于治療OP 患者[30]。有研究發(fā)現(xiàn)在TGF-β 通路中，Smad 受體與TGF-β 結(jié)合，促進(jìn)Smad 的C 端磷酸化，形成復(fù)合物并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，從而促進(jìn)OB，抑制OC；在BMP 信號(hào)傳導(dǎo)過程中，磷酸化的R-Smad 受體可調(diào)節(jié)Runx2 的表達(dá)，再經(jīng)過BMP-Smad 信號(hào)傳導(dǎo)從而參與OB 分化和骨形成[31]。說明Smads 參與TGF-β 和BMP 通路的調(diào)節(jié)，同時(shí)刺激成骨細(xì)胞分化，因此研究TGF-β 通路和BMP2 通路對(duì)預(yù)防OP 有指導(dǎo)意義。Kim 等[32]發(fā)現(xiàn)，KAE 處理后的MC3T3-E1 細(xì)胞呈劑量依賴性增長(zhǎng)，并發(fā)現(xiàn)ALP、Runx2、BMP-2 的活性也顯著增加。說明KAE 可以通過Runx2、BMP-2 信號(hào)通路，增加ALP 活性，促進(jìn)OB 分化。綜上所述，KAE 可以通過BMP/TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)，使OB 和OC 達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，從而治療OP。因此，在研究防治OP的藥物機(jī)制時(shí)，通過抑制OC 的同時(shí)促進(jìn)OB 將會(huì)是未來研究的熱點(diǎn)。

3.4 轉(zhuǎn)錄因子Runx2 相關(guān)通路

Runx2 是一種刺激成骨作用的基本轉(zhuǎn)錄因子，有研究發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)錄激活劑刺激Runx2 的活性來調(diào)節(jié)BMMSC 的OB和成脂細(xì)胞分化[33]。趙晶[34]研究發(fā)現(xiàn)，采用KAE 干預(yù)小鼠BMMSC 后，Runx2和Osterix 的蛋白水平明顯上升，同時(shí)ALP活性提高。說明KAE 可以提高Runx2水平，促進(jìn)成骨，抑制OP。Qiu 等[35]通過KAE 作用于BMMSC 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)KAE 可通過激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，提高Runx2、osterix/Sp-7、β-catenin 等相關(guān)蛋白的表達(dá)，增加成骨形成。證明KAE 可以通過刺激轉(zhuǎn)錄激活劑誘導(dǎo)Runx2來調(diào)節(jié)BMMSC 的成骨分化和成脂分化來預(yù)防OP。綜上所述，Runx2是調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)錄因子，鑒于Runx2在BMMSC 中的作用，Runx2可能通過BMD 發(fā)揮作用，在開發(fā)治療骨質(zhì)疏松的新藥研究中具有巨大潛力，有待更深入的研究。

4 小結(jié)和展望

隨著中國(guó)老齡化進(jìn)程越發(fā)加快的社會(huì)態(tài)勢(shì)，現(xiàn)代臨床治療OP 的策略雖然起效快，但亦存在副作用大，價(jià)格高等弊端。為減輕社會(huì)壓力，中醫(yī)藥防治OP 已經(jīng)成為開發(fā)新藥的必然選擇。KAE 作為抗OP 的天然藥物比人工合成藥物具有明顯優(yōu)勢(shì)：①不良反應(yīng)小，可以通過一些膳食來補(bǔ)充。②來源方便，易于獲得。③花費(fèi)少，患者易于接受。由此可見未來中醫(yī)藥防治OP將會(huì)成為大趨勢(shì)。

本文探討KAE 分別通過調(diào)節(jié)TNF、IL、Jun 等炎癥因子和影響B(tài)MP2、Runx2、NF-κB、MAPK、RANKL/RANK、ER 等相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)OB 分化、抑制OC 分化來防治OP。目前對(duì)于KAE 的研究?jī)H限于體內(nèi)外研究，臨床研究較少。因此，還需要大量臨床研究作為依據(jù)證明KAE 對(duì)OB 和OC 的影響。最后KAE 作為具有巨大潛力防治OP 的有效成分，其治療OP 的作用靶點(diǎn)尚不明確、具體作用機(jī)制及保證效果的用藥劑量相關(guān)研究還不夠全面。因此還需要進(jìn)行大量的臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為防治OP 提供更為安全有效的臨床方案。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。