液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)在骨關(guān)節(jié)炎局部組織樣本檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

劉德仁 廖太陽 吳 鵬 茆 軍

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，江蘇南京 210029

代謝組學(xué)是檢測小分子代謝物的先進(jìn)分析技術(shù)，是篩選疾病生物標(biāo)志物和了解代謝途徑的有效工具[1]。液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）作為代謝組學(xué)中最常用的分析檢測技術(shù)，具備高通量定性和定量分析的優(yōu)勢[2-3]。因其所需樣本量小、高靈敏度和可靠的定量分析等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于描述代謝途徑的特征、疾病生物標(biāo)志物的鑒定及藥代動(dòng)力學(xué)的追蹤[4-7]。LC-MS 技術(shù)通過靶向或非靶向途徑確定代謝表型，深刻地闡述疾病的代謝特征[8]。但應(yīng)用LC-MS 技術(shù)揭示骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）發(fā)生、發(fā)展過程中代謝產(chǎn)物和代謝途徑的變化還處于基礎(chǔ)階段，且部分研究著重利用LC-MS 技術(shù)檢測血清或滑液中代謝物的特征[9-12]。盡管人們運(yùn)用LC-MS 技術(shù)探究OA 生理、病理代謝過程的興趣愈加熱烈，但采用OA 中關(guān)節(jié)軟骨、滑膜和脂肪墊等局部組織作為LC-MS 檢測的樣本仍處于探索階段，并且關(guān)節(jié)軟骨、滑膜和脂肪墊等作為OA 病理過程中最直接、最根本的病理改變，更能反映出OA 發(fā)生、發(fā)展的本質(zhì)。本文就LC-MS 技術(shù)在OA局部組織樣本檢測中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 LC-MS 研究及OA 通用的局部組織樣本

1.1 LC-MS 研究

當(dāng)前，LC-MS、氣相色譜-質(zhì)譜和磁共振波譜是代謝組學(xué)中常見的檢測技術(shù)，前兩者占已發(fā)表的代謝組學(xué)研究的極大部分[13]。LC-MS 技術(shù)把具備高分離能力的液相色譜系統(tǒng)作為分離系統(tǒng)，把具備高靈敏度和高選擇性的質(zhì)譜系統(tǒng)作為檢測系統(tǒng)，結(jié)合二者的優(yōu)勢來檢測樣本中代謝物和代謝途徑的作用[14]。

1.2 常用的局部組織樣本

OA 中發(fā)生病理改變的局部組織主要涉及關(guān)節(jié)軟骨、滑膜和脂肪墊。微環(huán)境變化會(huì)引發(fā)軟骨細(xì)胞代謝異常，軟骨細(xì)胞為了適應(yīng)該環(huán)境，會(huì)從一種代謝途徑轉(zhuǎn)向另一種代謝途徑[15]。OA中關(guān)節(jié)軟骨代謝的整體改變能通過代謝組學(xué)檢測分析[16]?；ぱ卓赡苁荗A 的初始病理改變，而滑膜在軟骨新陳代謝和物質(zhì)交換中起到關(guān)鍵作用[17]。膝關(guān)節(jié)局部脂肪組織——髕下脂肪墊可與鄰近組織相互作用，能分泌各種細(xì)胞因子，可能在OA 中產(chǎn)生雙向效應(yīng)[18]。OA 中針對脂肪墊的分析較少，脂肪墊信號強(qiáng)度的改變與OA 相關(guān)生物標(biāo)志物存在關(guān)聯(lián)[19]。種種證據(jù)都指明OA 的發(fā)生和發(fā)展與關(guān)節(jié)軟骨、滑膜和脂肪墊的代謝改變有著極強(qiáng)的相關(guān)性，應(yīng)用LC-MS 技術(shù)分析OA 局部組織樣本中代謝物和代謝途徑的改變，揭示OA 的潛在病理特征具有豐富前景。

2 LC-MS 技術(shù)在OA 局部組織樣本檢測中的應(yīng)用

2.1 LC-MS 技術(shù)在關(guān)節(jié)軟骨檢測中的應(yīng)用

關(guān)節(jié)軟骨在一定程度反映了關(guān)節(jié)生理學(xué)與病理學(xué)，常被選為檢測關(guān)節(jié)疾病的樣本。Southan 等[20]對小鼠和豬損傷后關(guān)節(jié)軟骨的LC-MS 非靶向代謝組學(xué)進(jìn)行交叉分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨損傷后精氨酸和脯氨酸代謝及精氨酸生物合成途徑顯著富集，調(diào)節(jié)的還有糖酵解、糖異生和維生素B6代謝途徑。Fredrikson等[21]應(yīng)用LC-MS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)，包裹在微凝膠中的軟骨細(xì)胞在氨基酸合成和中樞能量代謝相關(guān)途徑明顯上調(diào)。這兩項(xiàng)研究著重提及關(guān)節(jié)軟骨受影響后主要涉及氨基酸代謝和能量代謝途徑的變化。并且值得注意的是，LC-MS 技術(shù)是多組學(xué)研究中的一環(huán)，Southan 等[20]綜合代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究關(guān)節(jié)軟骨損傷機(jī)制；Anderson 等[22]綜合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究馬體外OA 軟骨模型，確定一組OA 模型早期差異豐富的代謝物和蛋白質(zhì)。這映射出將代謝組學(xué)與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等相結(jié)合更具說服力，多組學(xué)相結(jié)合是一種更全面、更科學(xué)的拓展OA 研究領(lǐng)域的方法[23-24]。此外，F(xiàn)redrikson 等[21]將LC-MS 技術(shù)作為驗(yàn)證單細(xì)胞軟骨微凝膠和組織工程的一環(huán)，應(yīng)用LC-MS 技術(shù)說明單細(xì)胞軟骨微凝膠的代謝證據(jù)?？梢姡琇C-MS 技術(shù)在關(guān)節(jié)軟骨中的應(yīng)用不能僅限于檢測關(guān)節(jié)軟骨中差異代謝物和代謝途徑。

2.2 LC-MS 技術(shù)在滑膜檢測中的應(yīng)用

Kim 等[25]對OA 和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的滑膜行LC-MS 檢測發(fā)現(xiàn)，相比于RA 滑膜，OA 滑膜主要有脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等13 種代謝物上調(diào)；相比于OA滑膜，RA 滑膜主要有煙酰胺、溶血磷脂酰膽堿（20∶4）、腺嘌呤和單磷酸腺苷等13 種代謝物上調(diào)。Li 等[26]檢測不同濃度枸杞水提物對OA 模型大鼠滑膜代謝物的影響，鑒定出13 種差異代謝物。近年來，對OA 中滑膜炎和滑膜纖維化的研究眾多，但LC-MS 技術(shù)中選取滑膜作為樣本還需要豐富[27]。研究表明，高速泳動(dòng)族蛋白B1 和金屬蛋白酶等可來源于滑膜，會(huì)促進(jìn)炎癥和關(guān)節(jié)基質(zhì)降解[28]?？梢娀ぷ鳛榫植拷M織樣本能有效反映OA 病理發(fā)生、發(fā)展中代謝改變，選取滑膜作為局部組織樣本應(yīng)用于LC-MS 研究有著很大的研究前景。

2.3 LC-MS 技術(shù)在脂肪墊檢測中的應(yīng)用

當(dāng)前，LC-MS 技術(shù)選取脂肪墊作為檢測樣本的研究較少。Nieminen 等[29]對非炎癥性創(chuàng)傷對照、OA 和RA 患者的髕下脂肪墊行LC-MS 非靶向分析，檢測到13 種差異代謝物，主要涉及硫酸睪酮、硫酸雄酮、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿（18∶0）、精氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和胍乙酸，分別與雄激素、膽汁酸和脂質(zhì)代謝途徑相關(guān)?？梢钥闯?，LC-MS 技術(shù)檢測脂肪墊差異代謝物可用于OA 與RA 的鑒別，脂質(zhì)代謝途徑在OA與RA 患者中差異顯著；雄激素、膽汁酸代謝是OA 與RA 鑒別的前瞻性代謝通路。此外，OA 和RA 患者在髕骨下脂肪墊的脂肪酸特征也存在明顯差異[30]。但臨床采用脂肪墊作為LC-MS局部組織樣本面臨侵入性操作問題。因此，OA 局部組織樣本的采集是患者在接受手術(shù)過程中進(jìn)行，部分是從患者遺體中采樣，例如Carlson 等[31]收集人死后滑液樣本。從OA 早期患者中收集局部組織樣本面臨創(chuàng)傷和患者拒絕等因素，但使用動(dòng)物模型不能完全復(fù)制真實(shí)的人類生物環(huán)境，從OA 早期患者收集局部組織樣本用作LC-MS 研究仍面臨困難。

綜上，OA 中關(guān)節(jié)軟骨、滑膜和脂肪墊等局部組織代謝紊亂主要是精氨酸、脯氨酸、谷氨酸和溶血磷脂膽堿等代謝物，涉及氨基酸、脂質(zhì)代謝等代謝途徑。精氨酸、脯氨酸和谷氨酸是膠原蛋白的重要組成成分，OA 誘導(dǎo)的纖維化與其含量升高相關(guān)[32]。溶血磷脂酰膽堿是一種與疼痛相關(guān)的脂質(zhì)，與OA 患者的慢性疼痛相關(guān)[33]；研究還發(fā)現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射溶血磷脂酰膽堿會(huì)產(chǎn)生持續(xù)數(shù)天的繼發(fā)性機(jī)械痛覺[34]。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，LC-MS 技術(shù)在OA 局部組織樣本檢測的應(yīng)用正在豐富，OA 的發(fā)生、發(fā)展涉及代謝物和代謝途徑變化，精氨酸、脯氨酸、谷氨酸和溶血磷脂酰膽堿等代謝物及氨基酸、脂質(zhì)代謝等多種代謝途徑可作為OA 潛在的治療靶點(diǎn)。但仍需要注意的是，LC-MS 技術(shù)所能鑒定出的代謝物數(shù)量受限，難以全面闡述機(jī)體代謝的全貌，需要克服LC-MS 自身技術(shù)局限性，加強(qiáng)樣本處理、分析的規(guī)范性，盡最大可能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可信性。必要時(shí)，可多組學(xué)綜合分析。并且，要對LC-MS 技術(shù)已識(shí)別的OA 局部組織代謝物進(jìn)行有針對性的研究，不能僅停留在發(fā)現(xiàn)差異代謝產(chǎn)物上，需要關(guān)聯(lián)調(diào)控這些代謝物的上游蛋白和基因，通過追蹤檢測、整體分析來了解其在OA 病理、生理中怎樣發(fā)揮作用；需要進(jìn)一步的研究來量化和驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，考慮更大的研究規(guī)模，以及更規(guī)范、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。相信LC-MS 技術(shù)在OA 局部組織樣本的應(yīng)用研究在不久的將來必定有所突破創(chuàng)新。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。