基于去卵巢大鼠開展針灸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的實驗研究進展

李自如,鄭 瓊,遲振海,熊 鵬,毛強健

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江西 南昌 330000)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是隨著年齡的增長女性絕經(jīng)后,骨吸收超過骨形成,導(dǎo)致骨量減少、骨脆性升高、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化,臨床表現(xiàn)為易發(fā)生骨折的一種代謝疾病[1-2]。以往研究表明PMOP主要是由于雌激素水平的下降導(dǎo)致[3-4],但近年來已有越來越多的研究發(fā)現(xiàn)PMOP的發(fā)病涉及骨免疫異常、慢性炎性反應(yīng)、骨髓微循環(huán)障礙等多方面、多通道因素調(diào)控[5]。目前,在國內(nèi)外治療PMOP方面,藥物治療仍是最常用的方法。然而,長期持續(xù)使用這些藥物往往會產(chǎn)生一定的毒副作用[6]。針灸作為一種高效的、無毒副作用的療法已大量應(yīng)用于臨床治療PMOP,且取得較佳療效[7-9]。一項納入16項研究涉及1 585例PMOP患者在內(nèi)的系統(tǒng)評價表明針灸治療在改善PMOP骨痛、提高臨床有效率等方面具有較好療效[10],為針灸治療PMOP提供臨床證據(jù)。

為了深入了解針灸治療PMOP機制,越來越多的學(xué)者采用動物模型進行實驗研究。通過動物實驗進行PMOP研究時,合理選擇實驗動物極其重要,去卵巢大鼠是美國食品與藥品管理局和世界衛(wèi)生組織推薦PMOP的模型,這種模型已被廣泛應(yīng)用于研究絕經(jīng)后婦女發(fā)生PMOP的病理過程,并已得到公認[11]。切除雙側(cè)卵巢的大鼠體內(nèi)雌激素分泌水平、骨代謝情況與絕經(jīng)后婦女相似,骨轉(zhuǎn)換率高,主要導(dǎo)致松質(zhì)骨骨量減少,具有價格低廉、重復(fù)性較好的優(yōu)點[12]。本文梳理了近年來基于去卵巢大鼠為模型開展的針灸治療PMOP的實驗研究,總結(jié)了學(xué)者們從多個角度探討出的實驗結(jié)論,為針灸治療PMOP向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供實驗證據(jù)。

1 針灸對去卵巢大鼠相關(guān)骨細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

1.1針灸對去卵巢大鼠Wnt/β-catenin信號通路的影響 Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一種復(fù)雜的信號傳遞系統(tǒng),涉及多條下游通路。其主要由外源性配體蛋白Wnt和細胞膜上的蛋白質(zhì)受體結(jié)合激活,并引起一系列的細胞反應(yīng)。其中Wnt/β-catenin信號通路是該系統(tǒng)中的核心通路,對骨代謝具有至關(guān)重要的作用。該信號通路中各種因子的水平變化會直接影響成骨細胞的生成和分化,加速骨祖細胞產(chǎn)生并抑制其成脂分化的過程,導(dǎo)致破骨細胞凋亡,從而促進骨量增加[13-14]。β-catenin是一種多功能的蛋白質(zhì),可調(diào)節(jié)細胞-細胞黏附和基因轉(zhuǎn)錄的協(xié)調(diào),游離的β-catenin可從細胞膜移行細胞核,在Wnt信號傳導(dǎo)途徑中充當(dāng)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物,被認為是Wnt信號通路被激活的標志[15]。當(dāng)細胞質(zhì)中的β-catenin累積一定量時則移行細胞核,與T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)結(jié)合,促進下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,進一步提高成骨細胞的數(shù)量和分化程度[16-18]。Dickkopf相關(guān)蛋白1(dickkopf-related protein 1,DKK1) 是介導(dǎo)骨形成的關(guān)鍵蛋白質(zhì)之一,表現(xiàn)為抑制間充質(zhì)干細胞和成骨細胞的正常功能,同時促進成骨細胞凋亡[19]。

實驗研究顯示,通過對去卵巢大鼠腎腧穴施以針刺刺激后,可明顯下調(diào)細胞因子DKK1的表達水平,從而影響Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控機制,進而發(fā)揮調(diào)節(jié)骨代謝的作用,減緩骨質(zhì)下降[20]。Wnt3a蛋白是Wnt/β-catenin信號通路的起始因子,當(dāng)Wnt3a蛋白激活時,與細胞膜上的跨膜受體LRP5/6,Frizzle蛋白結(jié)合,阻止胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin降解[21]。王亞軍等[22]用電針去卵巢大鼠腎俞、脾俞、三陰交、足三里,電針強度為斷續(xù)波,2 Hz,1.0 mA,每天1次,每次15 min,20 d為1個療程,共治療3個療程,結(jié)果表明電針可顯著升高去卵巢大鼠Wnt3a和β-catenin 基因及蛋白表達水平。

髓間充質(zhì)干細胞( bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)是骨髓中含量最豐富的細胞,對骨穩(wěn)態(tài)維持有重要作用[23]。BMSCs還具有分化為多種干細胞的潛能,如成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等[24]。Wnt/β-catenin信號通路作為經(jīng)典Wnt轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,與BMSCs的增殖和成骨分化、成骨細胞和破骨細胞的增殖分化及功能密切相關(guān)[25]。姚長風(fēng)等[26]研究發(fā)現(xiàn),艾灸去卵巢大鼠三陰交、關(guān)元穴可上調(diào)BMSC中Wnt3a、LRP5/6、β-catenin mRNA的表達,調(diào)控Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制Dkk1的表達,升高骨鈣素水平,促使BMSCs轉(zhuǎn)化為成骨細胞,恢復(fù)骨代謝平衡。

1.2針灸對去卵巢大鼠OPG/RANK/RANKL信號通路的影響 破骨細胞是PMOP發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細胞,而OPG/RANK/RANKL信號通路在破骨細胞的產(chǎn)生分化過程中發(fā)揮重要作用。骨保護素(OPG)主要由成骨細胞產(chǎn)生,且隨著細胞的分化成熟進一步增加,對破骨細胞有直接負向調(diào)控作用[27]。RANKL是TNF家族Ⅱ型同源三聚體蛋白,實驗研究發(fā)現(xiàn), RANKL表達增多,會增加骨組織的吸收,導(dǎo)致骨組織的密度降低及其他PMOP的表現(xiàn)[28]。RANK是一種Ⅰ型同源三聚體跨膜蛋白,是RANKL的受體激活劑[29]。OPG/RANK/RANKL信號通路對骨破壞機制的影響主要是通過RANKL與RANK結(jié)合,從而誘導(dǎo)破骨前體細胞接收信號分子并促進其向破骨細胞分化成熟[30]。OPG可與RANKL相結(jié)合,從而減少RANK與RANKL結(jié)合,延緩破骨細胞的分化,維持骨代謝平衡[31]。去卵巢會導(dǎo)致大鼠OPG水平下降, RANKL蛋白表達下降、RANK蛋白表達量升高,電針干預(yù)可上調(diào)去卵巢大鼠OPG的表達,提高去卵巢大鼠RANKL、抑制RANK的表達[32-33]。 然而,在一些學(xué)者的研究中,卵巢切除對RANKL表達的影響并不具備一致性,這種不一致性可能與樣本選取、檢測部位、檢測方法等因素有關(guān)[34]。尹秦等[35]研究發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠下丘腦及股骨遠端組織中,OPG的表達水平呈下降趨勢,而RANKL的表達水平則呈上升趨勢。這一結(jié)果提示下丘腦在股骨組織的RANKL/OPG信號通路表達方面發(fā)揮著協(xié)同調(diào)控的作用。針刺干預(yù)后,大鼠下丘腦及股骨組織中OPG mRNA和蛋白表達量均有顯著升高,而RANKL mRNA和蛋白表達量則明顯下降,說明針灸可調(diào)節(jié)OPG/RANKL信號通路表達,促進骨吸收作用,提高骨密度。

1.3針灸對去卵巢大鼠TGF-β/Smad信號通路的影響 轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) 是一種由結(jié)構(gòu)相似的多功能細胞因子組成的超家族,在骨代謝過程中發(fā)揮著重要作用。TGF-β能夠介導(dǎo)骨形成和骨吸收之間的偶聯(lián),并增強成骨細胞的數(shù)量和活性,同時刺激其增殖和分化,調(diào)控骨重建的過程,并維持骨代謝平衡[36]。研究發(fā)現(xiàn)PMOP患者的骨小梁內(nèi)TGF-β水平下降,補充外源性TGF-β可弱化破骨細胞作用,促進骨形成[37]。TGF-β1是TGF-β超家族的多肽成員,能夠調(diào)控細胞生長、增殖、分化和凋亡。Smad蛋白家族是TGF-β家族受體下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,能夠通過與細胞核內(nèi)其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或直接調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄而介導(dǎo)TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[38]。研究結(jié)果表明,大鼠去除卵巢后股骨遠端骨組織中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ的表達含量發(fā)生了明顯變化。然而,在進行了針刺干預(yù)后,這些指標在骨組織中趨向于好轉(zhuǎn)。因此,可以推測針刺能夠調(diào)節(jié)大鼠TGF-β1/Smad4信號通路的表達[39]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)是TGF-β超家族成員之一,可促進多種細胞的生長、分化和抑制細胞的凋亡。鮑圣涌等[40]發(fā)現(xiàn)電針治療可上調(diào)去卵巢大鼠TGF-β1、BMP-2的蛋白表達水平,這一作用機制可能與同配體結(jié)合后啟動Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、激活TGF-β1/Smads、BMP-2/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、促進成骨細胞增殖分化有關(guān)。秦瑋等[41]研究認為電針命門穴可調(diào)節(jié)去卵巢模型大鼠下丘腦BMP-2及Smad1/5的表達。

2 針灸對去卵巢大鼠激素的影響

2.1針灸對去卵巢大鼠性激素的影響 女性絕經(jīng)后雌激素迅速下降是PMOP發(fā)生發(fā)展的主要原因。研究認為,雌激素可以通過調(diào)節(jié)胰島素生長因子、腫瘤壞死因子、白細胞介素等因子的表達,從而增強成骨細胞活性、減少成骨細胞凋亡,還可以穩(wěn)定免疫系統(tǒng)、抑制細胞因子的炎癥狀態(tài)來減少對破骨細胞的刺激[42]。通過以上途徑,雌激素可以達到刺激骨形成、緩解骨吸收、降低骨量流失、保持骨密度等作用。實驗研究顯示,去卵巢后大鼠的內(nèi)分泌環(huán)境發(fā)生變化,這種變化與人類絕經(jīng)期激素水平變化相吻合[43]。具體而言,去卵巢大鼠血清中卵泡刺激激素(FSH)水平呈上升趨勢,而雌二醇(E2)水平則呈下降趨勢,經(jīng)針刺及穴位注射干預(yù)后大鼠血清FSH水平下降、E2水平升高。也有研究選取腎俞穴針刺,于去卵巢大鼠11周齡開始,每周進行3次針刺,直至26周齡,檢測發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠血清E2明顯升高,且提升了假手術(shù)大鼠的血漿睪酮水平[44]。胡靖等[45]采用麥粒灸干預(yù)去卵巢大鼠,發(fā)現(xiàn)麥粒灸治療后去卵巢大鼠腰椎骨密度和血清E2的水平上升,血清堿性磷酸酶的水平降低。BMSCs是E2的特異性靶細胞,研究發(fā)現(xiàn)大鼠在去除卵巢后,其BMSCs中核受體-雌激素受體(estrogen receptor,ER)mRNA的表達下調(diào)明顯,艾灸干預(yù)后ERαmRNA上調(diào),并推測骨髓間充質(zhì)干細胞中ERαmRNA表達的相對上調(diào)和血液中E2濃度增加有密切關(guān)系,可能直接對BMSCs的成骨轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響[46]。

2.2針灸對去卵巢大鼠其他激素的影響 生長激素(GH)和胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)是兩種重要的內(nèi)分泌因子,對骨代謝具有調(diào)控作用。GH能夠直接刺激成骨細胞的增殖和分化,同時也可以促進破骨細胞的分化,從而對骨重吸收產(chǎn)生影響[47]。然而,GH的大部分作用,如促進骨骼生長等,需要IGF-1的介導(dǎo)。兩者之間的平衡是促進骨量增加的一個重要條件。此外,在機體內(nèi),GH會被肝臟合成并釋放IGF-1。這表明GH和IGF-1在骨代謝過程中緊密相關(guān),二者的協(xié)同作用對于骨健康至關(guān)重要[48-49]。研究表明,電針聯(lián)合滋腎強骨湯可改善去卵巢大鼠骨組織和血清中GH/IGF-1系統(tǒng)的動態(tài)平衡,增強去卵巢大鼠的骨密度[50]。瘦素(leptin,LP)是調(diào)節(jié)體重與進食的重要激素, 與瘦素受體(OB-R)結(jié)合時對骨代謝具有調(diào)節(jié)作用[51]。研究發(fā)現(xiàn)電針腎俞、足三里、關(guān)元、三陰交能夠抑制去卵巢后大鼠血清及下丘腦中LP及、OB-R含量的升高,降低其骨形成中樞抑制作用,并認為LP在外周以促進骨代謝為主[52]。

3 針灸對去卵巢大鼠基因表觀遺傳修飾的影響

近年來,表觀遺傳學(xué)是PMOP發(fā)病機制的研究熱點之一。表觀遺傳修飾是指在基因序列不變的情況下,通過改變DNA和組蛋白等結(jié)構(gòu)上的化學(xué)修飾,對基因表達進行調(diào)控的過程。其范圍涉及DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、微小RNA等多個方面。前期研究表明,表觀遺傳因素對骨細胞的分化和活性有很大的影響,并與PMOP的發(fā)病相關(guān)[53]。

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾方式,它通過改變DNA分子的化學(xué)結(jié)構(gòu),從而對基因表達進行調(diào)控。這種修飾在生物體中廣泛存在,包括在哺乳動物體內(nèi)。DNA甲基化會發(fā)生在CpG二核苷酸上,同時也涉及多個甲基轉(zhuǎn)移酶及相關(guān)輔助蛋白[54]。Runx2作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,能夠?qū)趋腊l(fā)育過程中的多個關(guān)鍵基因進行調(diào)節(jié)。這些基因包括骨鈣、骨橋蛋白、骨唾液蛋白以及Ⅰ型膠原等成骨細胞表型相關(guān)基因[55-56]。研究發(fā)現(xiàn),切除卵巢后大鼠骨組織中DNA甲基化水平增高,特別是在Runx2啟動子區(qū)域。這種高甲基化狀態(tài)抑制了Runx2的轉(zhuǎn)錄和表達,從而降低了骨組織中多種成骨細胞表型相關(guān)基因,如堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原等的表達水平[57]。Fan等[58]采用電針去卵巢大鼠關(guān)元穴發(fā)現(xiàn)電針可提高Runx2的表達水平,激活A(yù)LP,提升BGP水平,從而促進BMSCs的增殖和向成骨細胞方向分化,增加骨密度。另有研究表明,電針腎俞、足三里穴位可通過降低骨組織Runx2啟動子甲基化水平,上調(diào)Runx2的表達,促進成骨細胞表型基因表達,從而增加骨密度[59]。

組蛋白是一類結(jié)構(gòu)和功能多樣的小分子堿性蛋白,作為DNA纏繞的線軸參與構(gòu)成染色質(zhì)。除了組成染色體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)外,組蛋白還能通過其尾部氨基酸殘基上的化學(xué)修飾來調(diào)控基因表達。組蛋白末端常見的化學(xué)修飾包括甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化等。組蛋白的修飾方式和程度會受到一系列結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的蛋白質(zhì)因子的調(diào)控。一些具有特定功能的蛋白質(zhì)因子,如染色體去乙?；负徒M蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶等,通過與細胞核內(nèi)的特定位點相互作用,來調(diào)節(jié)組蛋白修飾的狀態(tài),以達到對基因表達的調(diào)控[60]。組蛋白去乙酰化酶2(Histone deacetylase2,HDAC2)通過調(diào)控組蛋白的乙?；癄顟B(tài)對骨代謝產(chǎn)生一定的影響[61]。 相關(guān)研究表明,電針療法可以促進成骨細胞增殖和分化,從而有助于改善骨質(zhì)疏松癥。具體機制可能電針治療抑制HDAC2的表達,使得乙酰化組蛋白H3表達水平升高,這進一步上調(diào)了Runx2基因及蛋白的表達,并促進了下游的成骨基因ALP的表達[62]。

此外,PMOP與鈣調(diào)節(jié)激素(降鈣素、甲狀旁腺激素)、鈣離子轉(zhuǎn)運、免疫細胞因子有關(guān)。研究表明,電針能增強參與鈣離子吸收跨細胞途徑的TRPV5,PMCAlb的mRNA和蛋白表達以及細胞旁途徑ZO-1,occludin的mRNA和蛋白表達,提高去卵巢大鼠的骨密度[63]。

4 小 結(jié)

以往的研究中,針灸治療PMOP主要集中在激素和骨形態(tài)學(xué)方面。然而,近年來學(xué)者們開始從不同的角度出發(fā),包括信號通路、細胞因子以及基因表觀遺傳等多個領(lǐng)域,探討該病的發(fā)病機制。這種多角度的探索方式有利于更深入地了解該疾病,從而為針灸治療的實驗研究提供更加豐富的證據(jù)支持。

盡管研究已經(jīng)在不斷進展,但是目前仍存在一些問題。例如:在激素方面,研究主要集中在性激素上,缺乏對于鈣調(diào)節(jié)激素的研究,而鈣調(diào)節(jié)激素是PMOP發(fā)病的關(guān)鍵。因此,為了更好地理解該疾病,未來需要加強相關(guān)研究,包括鈣激素相關(guān)受體、調(diào)節(jié)基因、調(diào)節(jié)信號通路等。

當(dāng)前,針灸干預(yù)手段主要采用毫針針刺和電針,但是關(guān)于刺激參數(shù)的研究較少。完善刺激強度、時間、頻率等方面的研究,有助于我們更好地理解針灸對于PMOP的影響。此外,盡管少量實驗采用艾灸干預(yù),但是針灸治療手段非常豐富,未來可以選用如熱敏灸、穴位貼敷等多種干預(yù)手段進行研究。

在選穴方面,中醫(yī)理論認為PMOP屬于“骨痿”范疇,而腎主骨和脾腎虛是其發(fā)生的根本機制[64]。因此,基于這一原則,可以選擇補益脾腎穴位如腎俞、脾腎、太溪、命門以及三陰交等進行研究,并驗證穴位特異性,或者通過多穴配伍方式觀察聯(lián)合效果,最終促進實驗研究向臨床轉(zhuǎn)化。

綜上所述,去卵巢大鼠的病程演變和病理變化與PMOP患者十分相似。基于去卵巢大鼠開展的針灸治療PMOP的研究結(jié)果顯示,針灸可以多靶點、多途徑干預(yù)PMOP。然而,目前仍存在一些問題,例如今后的相關(guān)實驗應(yīng)該基于臨床進行,豐富干預(yù)手段,針對選穴、刺激參數(shù)、干預(yù)時長等方面開展標準化的針灸干預(yù)PMOP研究,以確定高效的規(guī)范化治療方案;PMOP有明顯的時間性,與絕經(jīng)關(guān)系密切,因此可利用針灸具有預(yù)處理的機制特點,將針灸治未病應(yīng)用到PMOP的研究中,探索針灸提早介入PMOP的療效;針灸發(fā)揮作用具有多層面、多靶點、多通路的特性,還應(yīng)加強相關(guān)信號通道、受體途徑以及基因修飾等機制的研究?？傊?針灸治療PMOP的實驗研究面臨著多個挑戰(zhàn)和機遇,需要我們以更加全面、深入的方式來理解該疾病及其治療方法。未來的研究方向應(yīng)包括但不限于從激素到其他關(guān)鍵因素的研究,優(yōu)化干預(yù)手段并系統(tǒng)評估效果,探索治未病的新思路,并加強對于針灸在分子機制層面上的解釋與研究。通過深入研究,我們相信將會有更多的突破和進展,為針灸干預(yù)PMOP提供更加有效和可靠的證據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。