薰衣草醇?；D(zhuǎn)移酶基因（AAT）的克隆和表達(dá)分析

廖燕 尹松松 龔林濤 閆博文 孫明輝 蘇秀娟 王愛(ài)凡

摘要：醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）可以催化乙酰輔酶A與萜烯醇類(lèi)物質(zhì)的結(jié)合，生成各類(lèi)乙酸酯類(lèi)化合物。為探明薰衣草AAT基因在酯類(lèi)化合物合成中的調(diào)控作用，本研究以薰衣草品系雜花葉片為供試材料，利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆薰衣草AAT基因的cDNA序列，該cDNA序列長(zhǎng)度為1 344 bp，其編碼蛋白質(zhì)由447個(gè)氨基酸組成，是非跨膜親水性蛋白質(zhì)，屬于PLN02481超級(jí)家族；薰衣草AAT與黃色猴面花EgAAT親緣關(guān)系最近，相似度為60.87%。AAT基因在苞葉中的表達(dá)量最低，在花瓣中的表達(dá)量最高；在花冠不同發(fā)育時(shí)期，該基因在盛開(kāi)期表達(dá)量到達(dá)峰值。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-AAT，篩選了重組蛋白在大腸桿菌Transetta（DE3）中的最適誘導(dǎo)表達(dá)條件，誘導(dǎo)后獲得的重組蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為5.026×104，重組蛋白以包涵體形式存在，具有將芳樟醇催化合成乙酸芳樟酯的生物活性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步驗(yàn)證薰衣草AAT基因在酯類(lèi)化合物合成過(guò)程中的功能提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：薰衣草；醇?；D(zhuǎn)移酶基因（AAT）；克隆；表達(dá)模式；酶活性鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S184文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2024）04-0599-08

Cloning and expression analysis of lavender alcohol acyltransferase gene （AAT）

LIAO Yan1，YIN Song-song1，GONG Lin-tao1，YAN Bo-wen1，SUN Ming-hui1，SU Xiu-juan1，2，WANG Ai-fan1，2

（1.College of Agronomy， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China;2.Lavender Research Institute of Xinjiang Agricultural University/Xinjiang Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement， Urumqi 830052， China）

Abstract：Alcohol acyltransferase （AAT） can catalyze the combination of acetyl coenzyme A and terpene alcohols to produce various types of acetate compounds.?In order to explore the regulatory role of lavender AAT gene in the synthesis of ester compounds， the cDNA sequence of lavender AAT gene was cloned by reverse transcription PCR using the leaves of lavender strain Zahua as the test material.?The length of the cDNA sequence was 1 344 bp， and the encoded protein was composed of 447 amino acids， which was a non-transmembrane hydrophilic protein and belonged to the PLN02481 superfamily.?The AAT in lavender was closely related to the EgAAT in yellow monkey-faced flower， with a similarity of 60.87%.?The expression level of AAT gene was lowest in bracts and highest in petals.?At different developmental stages of corolla， the expression of this gene reached the peak at the full-bloom stage.?Prokaryotic expression vector pET-28a-AAT was constructed.?The optimal expression conditions of the recombinant protein in Escherichia coli Transetta （DE3） were screened.?The relative molecular weight of the recombinant protein was about 5.026×104.?The recombinant protein existed in the form of inclusion bodies and had the biological activity of catalyzing the synthesis of linalyl acetate from linalool.?The results of this study provide a basis for further verifying the function of lavender AAT gene in the synthesis of ester compounds.

Key words：lavender;alcohol acyltransferase gene （AAT）;cloning;expression pattern;enzyme activity identification

薰衣草為唇形科薰衣草屬，是一種珍貴的天然香料植物 [1]，不僅具有良好的觀賞價(jià)值，其花穗中提取的精油也被廣泛用于美容、烹飪和香料工業(yè)以及醫(yī)藥保健領(lǐng)域[2]。薰衣草精油主要由乙酸芳樟酯、芳樟醇等萜類(lèi)物質(zhì)組成[3-4]，乙酸芳樟酯是一種揮發(fā)性的芳香族單萜類(lèi)化合物，具有清新、芳香的香氣以及抗菌鎮(zhèn)靜等功效，是多種名貴植物精油的主要成分之一[5-6]。高等植物中大部分萜類(lèi)物質(zhì)來(lái)源于異戊烯二磷酸（Isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲丙烯二磷酸（Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）兩個(gè)前體物質(zhì)，它們主要通過(guò)細(xì)胞質(zhì)途徑（Mevalonic pathway，MVA）和質(zhì)體途徑（2-C-Methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP）合成[7]。IPP和DMAPP可以在醇酰基轉(zhuǎn)移酶（AAT）的催化作用下合成各種類(lèi)型的萜類(lèi)化合物。醇?；D(zhuǎn)移酶不僅可以催化異戊二烯和異戊烯醇的轉(zhuǎn)化以及乙酰輔酶A與萜烯醇類(lèi)物質(zhì)的結(jié)合，還可以催化萜類(lèi)化合物中的羥基和羧基等官能團(tuán)的轉(zhuǎn)化，從而生成異戊烯醇酯和各類(lèi)乙酸酯類(lèi)化合物，并調(diào)節(jié)萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)和生物活性[8-11]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)植物AAT基因展開(kāi)了廣泛研究，例如已從月季[12-13]、山木瓜[14]、草莓[15]、蘋(píng)果[16]等植物中獲得了AAT基因，并對(duì)其調(diào)控功能開(kāi)展了大量研究。Shalit 等[12]從月季中獲得的第一個(gè)AAT基因，可將月季中香葉醇、香茅醇等不同醇類(lèi)底物催化合成對(duì)應(yīng)的酯類(lèi)化合物，該基因在月季花器官及盛開(kāi)前期的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高峰值。李晉華[13]驗(yàn)證了月季RcAAT基因主要參與了乙酸香葉酯的合成。Cristian等[14]確定了山木瓜VpAAT1基因參與了木瓜香氣的形成。董靜等[15]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)草莓FvAATW2基因的煙草可在發(fā)育早期合成酯類(lèi)物質(zhì)，轉(zhuǎn)基因草莓果實(shí)中揮發(fā)酯含量顯著提高。Li等[16]發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果MdAAT2基因參與了蘋(píng)果酯類(lèi)物質(zhì)的合成。因此，AAT基因?qū)χ参锵銡獬煞值暮铣删哂幸欢ǖ恼{(diào)控作用。

目前關(guān)于薰衣草醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究以高油薰衣草品系雜花葉片為材料，克隆并分析了薰衣草醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因AAT的脫氧核糖核酸（Complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）序列，分析了該基因在薰衣草花器官中不同組織以及花冠不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)情況，篩選了目的基因的原核表達(dá)條件，并進(jìn)行了蛋白質(zhì)的體外酶活性檢測(cè)，以期為進(jìn)一步研究AAT基因在薰衣草酯類(lèi)物質(zhì)合成中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1植物材料

以新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院薰衣草試驗(yàn)地的雜花品系葉片為克隆模板材料，以新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克族自治州伊寧縣薰衣草品系雜花為表達(dá)分析材料，花香檢測(cè)用新鮮樣品，其余樣品于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)試劑

pET-28a載體由本實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，TransZol Up，pEASY-T5載體，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，膠回收試劑盒，肉湯培養(yǎng)基（Luria-Bertani，LB），酵母提取物牛肉提取物（Yeast extract beef extract，YEB）液體培養(yǎng)基，LB、YEB固體培養(yǎng)基，卡那霉素，利福平，乙醇，三氯甲烷，異丙醇，限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind Ⅲ，ProteinRuler I，ProteinRuler II，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（變性）粉末，10%SurePAGETM ，Ni-NTA蛋白純化試劑盒，T4 DNA連接酶，乙酰輔酶A和芳樟醇，磷酸緩沖鹽水（Phosphate-buffered saline，PBS）緩沖液粉末，大腸桿菌Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，氯霉素，質(zhì)粒小提試劑盒。

1.3薰衣草AAT基因的克隆

采用TransZol Up試劑盒提取薰衣草總核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA），用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成cDNA。根據(jù)NCBI上公布的薰衣草醇酰基轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列（登錄號(hào)：KM275343.1）設(shè)計(jì)特異性引物AAT-F和AAT-R（表1）。以cDNA為模板，擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)體系：上游引物1 μl，下游引物1 μl，2.5 mmol/L dNTPs 5 μl，10×EasyPfu Buffer 5 μl，EasyPfu DNA Polymerase 1 μl，cDNA 1 μl，水 36 μl[17]。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將回收的目的DNA片段連接到pEASY-T5載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌液PCR鑒定后的陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.4生物信息學(xué)分析

使用NCBI上的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）工具分析基因序列的ORF，確定克隆得到的薰衣草AAT基因序列是否具有編碼蛋白質(zhì)的潛力。使用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）對(duì)薰衣草AAT進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。使用COILS（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）預(yù)測(cè)薰衣草AAT的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）分析薰衣草AAT的可能跨膜區(qū)。使用MEGA5對(duì)薰衣草AAT氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，使用DNAMAN構(gòu)建薰衣草AAT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5表達(dá)模式分析

提取薰衣草品系雜花花器官不同發(fā)育時(shí)期以及不同組織部位總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)AAT基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物qAAT-F和qAAT-R，內(nèi)參基因使用β-actin-F和β-actin-R[17]（表1），以提取的薰衣草cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，用2-△△Ct法分析熒光定量數(shù)據(jù)[18]。

1.6AAT重組蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化

載體使用本實(shí)驗(yàn)室保存的pET-28a。以從薰衣草葉片中克隆的pEASY-T5-AAT重組質(zhì)粒為模板選擇EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物pAAT-F和pAAT-R引物進(jìn)行擴(kuò)增（表1）。對(duì)酶切產(chǎn)物所需片段進(jìn)行膠回收，純化目的基因及線性載體，用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將測(cè)序正確的菌液進(jìn)行pET-28a-AAT質(zhì)粒提取，轉(zhuǎn)化Transetta（DE3），菌液培養(yǎng)至光密度（Optical density，OD）600值為0.4～0.6，異丙基β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)濃度分別為0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間分別為0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，誘導(dǎo)溫度分別為25 ℃、28 ℃、37 ℃，篩選最佳誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和培養(yǎng)溫度[19]。

1.7AAT重組蛋白體外酶活性檢測(cè)

采用篩選獲得的最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)薰衣草AAT蛋白表達(dá)。按照Ni-NTA瓊酯糖純化樹(shù)脂說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白純化。蛋白體外酶活性測(cè)定參照曹香梅[20]應(yīng)用的方法，在含5 mmol/L乙酰輔酶A和10 mmol/L芳樟醇的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液[100 mmol/L Tris，pH 7.5，2 mmol/L 二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）]中，添加重組蛋白（500 ng/μl），30 ℃水浴 1 h，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS）檢測(cè)生成的產(chǎn)物。

2結(jié)果與分析

2.1薰衣草醇?；D(zhuǎn)移酶基因AAT的克隆和序列分析

以薰衣草品系雜花的葉片cDNA為模板，擴(kuò)增獲得AAT基因（圖1）。利用NCBI的ORF Finder分析AAT基因序列，該基因堿基序列長(zhǎng)度為1 344 bp，其編碼的蛋白質(zhì)由447個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為5.026×104，等電點(diǎn)為8.61。

在線程序預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，AAT蛋白無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域，多肽鏈位于細(xì)胞膜外，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域存在，屬于PLN02481蛋白超級(jí)家族，410位甘氨酸（Glycine，Gly）分值最小，為-2.989，親水性最強(qiáng)；309位脯氨酸（Proline，Pro）分值最大，為2.111，親水性最弱，預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。AAT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含12個(gè)α-螺旋、16個(gè)β-折疊和29個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲；蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲較多，其結(jié)構(gòu)與PLN02481-2super家族蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，推測(cè)該蛋白質(zhì)和PLN02481-2super家族蛋白質(zhì)的功能相似。

2.2薰衣草AAT蛋白氨基酸序列的多重比較和進(jìn)化樹(shù)分析

薰衣草AAT蛋白與克萊門(mén)氏小柑橘、甜橙、旋蒴苣苔、黃色猴面花、山荊子、蘋(píng)果、楊梅、荷花、煙草、芝麻等10個(gè)物種AAT同源蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，這些序列均具有植物酰基轉(zhuǎn)移酶（BAHD）家族特有的高度保守結(jié)構(gòu)域HXXXD（165-169氨基酸殘基）活性位點(diǎn)和附加的DFGWG（378-382氨基酸殘基）結(jié)構(gòu)域，同時(shí)也具有BAHD家族的保守結(jié)構(gòu)域LXXYYPLAGR（74-83氨基酸殘基）（圖2）。因此，薰衣草AAT基因?qū)儆贐AHD基因家族。

構(gòu)建薰衣草（Lavandula x intermedia）與10個(gè)物種AAT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)薰衣草AAT與黃色猴面花、旋蒴苣苔、芝麻、甜橙、克萊門(mén)氏小柑橘、楊梅、荷花、煙草、蘋(píng)果、山荊子AAT的同源性分別為60.87%、60.05%、59.64%、59.49%、59.72%、59.77%、57.37%、57.4%、54.71%、56.01%，其中薰衣草AAT蛋白與黃色猴面花的蛋白相似性最高，為60.87%（圖3），推測(cè)兩者具有相似的分子功能。

2.3薰衣草AAT基因的表達(dá)模式分析

分析AAT基因在不同組織和花冠不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量（圖4），該基因在花瓣中的表達(dá)量最高，其次是花萼、雄蕊、葉片、雌蕊、苞葉；該基因在花冠花蕾期和初開(kāi)期的表達(dá)量較低，半開(kāi)期其表達(dá)量迅速上升，盛開(kāi)期其表達(dá)量達(dá)到峰值，衰敗期其表達(dá)量降低。

2.4薰衣草AAT基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切pET-28a載體和AAT基因，將回收的AAT基因片段與載體DNA片段連接構(gòu)建重組載體pET-28a-AAT。雙酶切電泳結(jié)果表明，酶切獲取的小片段與AAT基因大小一致，大片段與pET-28a載體大小一致（圖5），表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.5薰衣草AAT重組蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化及可溶性鑒定

將重組表達(dá)載體pET-28a-AAT進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。重組蛋白在0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L5個(gè)IPTG濃度下均能表達(dá)，當(dāng)IPTG終濃度為0.6～0.8 mmol/L時(shí)重組蛋白表達(dá)量最高（圖6A）；在2 h、4 h、6 h、8 h、10 h的誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)下均能表達(dá)，并且AAT蛋白的表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)（誘導(dǎo)時(shí)間越長(zhǎng)，表達(dá)量越低），當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為2 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高（圖6B）；在25 ℃、28 ℃、37 ℃不同溫度下均能誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)，當(dāng)溫度為37 ℃，在0.6～0.8mmol/L的IPTG和2 h條件下重組蛋白表達(dá)量最高（圖6C）；因此，選擇IPTG濃度為0.6～0.8 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為2 h、培養(yǎng)溫度為37 ℃作為該重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。采用以上條件誘導(dǎo)獲得的重組蛋白與目標(biāo)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小一致（5.026×104，圖7），該蛋白質(zhì)以包涵體形式存在。

2.6薰衣草AAT蛋白的酶活性驗(yàn)證

將純化后的AAT蛋白和芳樟醇混合后進(jìn)行酶活性檢測(cè)，當(dāng)酶促反應(yīng)進(jìn)行至25.583 min時(shí)檢測(cè)到了乙酸芳樟酯（圖8），表明薰衣草AAT蛋白具有催化芳樟醇合成乙酸芳樟酯的生物活性。

3討論

揮發(fā)性酯類(lèi)化合物作為貢獻(xiàn)薰衣草香氣的重要組分，在薰衣草發(fā)育過(guò)程中不斷積累，對(duì)于薰衣草精油的品質(zhì)以及薰衣草相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本研究采用RT-PCR技術(shù)首次克隆了薰衣草AAT基因的全長(zhǎng)cDNA。BAHD?；D(zhuǎn)移酶家族中特有的HXXXD基序直接參與酶活性位點(diǎn)的催化作用，而DFGWG基序與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、互動(dòng)能力和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程相關(guān)[21-22]，推測(cè)薰衣草AAT蛋白也具有類(lèi)似功能。AAT基因在植物中具有組織表達(dá)差異性。薰衣草AAT基因在花瓣中表達(dá)量最高，該結(jié)果與月季RhAAT1[12]、桂花OfAAT1及柿子DKAAT1的表達(dá)情況相似[23-24]。AAT基因在薰衣草花冠各個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量也不同。梅花PmCFAT1基因表達(dá)量隨開(kāi)花進(jìn)程逐漸上升，在盛花期其表達(dá)量達(dá)到最高[25]。玫瑰RrAAT基因在半開(kāi)期的表達(dá)量達(dá)到最高，自盛花期逐漸下降[26]。薰衣草AAT基因在盛開(kāi)期其表達(dá)量達(dá)到峰值。薰衣草AAT基因在花器官不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)趨勢(shì)與梅花PmCFAT1[25]的表達(dá)趨勢(shì)一致，均為在盛開(kāi)期表達(dá)量達(dá)到最高，和玫瑰RrAAT[26]自盛開(kāi)期后下降的趨勢(shì)一致。

通過(guò)體外酶活性試驗(yàn)鑒定目標(biāo)蛋白的生物學(xué)功能，是確定相關(guān)基因是否參與調(diào)控酯類(lèi)化合物合成的有效途徑，而建立高效誘導(dǎo)表達(dá)體系則是該途徑的前提條件。曹穎等[27]采用優(yōu)化后的表達(dá)條件在大腸桿菌中高效表達(dá)了番茄SlAAT1，體外酶活性試驗(yàn)結(jié)果表明該蛋白質(zhì)具有醇?；D(zhuǎn)移酶活性。在細(xì)胞裂解過(guò)程中蛋白質(zhì)很容易降解，但采用本身缺少蛋白質(zhì)水解酶的Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞作為表達(dá)受體，則可保證重組蛋白不會(huì)被降解[28]。本研究采用優(yōu)化后的表達(dá)條件在Transetta（DE3）細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)了以包涵體形式存在目的蛋白，出現(xiàn)表達(dá)的目的蛋白以包涵體形式存在的原因可能是大腸桿菌作為一種原核生物缺乏真核生物所具有的許多復(fù)雜的折疊和翻譯后的加工機(jī)制，這些機(jī)制包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、拆分和修復(fù)錯(cuò)誤的二硫鍵等，由于缺乏這些機(jī)制，大腸桿菌中表達(dá)的目標(biāo)蛋白常常會(huì)有錯(cuò)配的二硫鍵產(chǎn)生，而這種二硫鍵可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)無(wú)法正確定位或功能失調(diào)，從而導(dǎo)致目的蛋白形成包涵體[29-30]。對(duì)純化后的目標(biāo)蛋白進(jìn)行體外酶活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AAT蛋白具有催化芳樟醇合成乙酸芳樟酯的生物活性。

4結(jié)論

本研究從薰衣草雜花品系葉片中克隆得到醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因AAT，全長(zhǎng)1 344 bp，編碼447個(gè)氨基酸；對(duì)AAT蛋白氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)結(jié)果顯示，該序列屬于BAHD家族，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明AAT蛋白與黃色猴面花AAT親緣關(guān)系最近。AAT基因在苞葉中的表達(dá)量較低，在花瓣中的表達(dá)量相對(duì)較高，在花器官不同發(fā)育時(shí)期，AAT基因的表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)。重組蛋白表達(dá)最適誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度0.6～0.8 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間2 h、培養(yǎng)溫度37 ℃，對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行純化復(fù)性發(fā)現(xiàn)其具有催化芳樟醇合成乙酸芳樟酯的生物活性。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步驗(yàn)證AAT基因在薰衣草酯類(lèi)物質(zhì)合成中的作用奠定了基礎(chǔ)，為今后利用基因工程手段培育精油產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)的薰衣草新品種提供了候選基因。

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（責(zé)任編輯：蔣永忠）

收稿日期：2023-04-27

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專(zhuān)項(xiàng)（2022B02036-1）；國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31760429）；新疆維吾爾自治區(qū)科學(xué)技術(shù)廳“天山青年計(jì)劃”優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2020Q016）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810758003）；作物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科發(fā)展基金項(xiàng)目（XNCDKY2021015）

作者簡(jiǎn)介：廖燕（2000-），女，重慶人，碩士研究生，主要從事薰衣草遺傳育種研究。（E-mail）1642101080@qq.com

通訊作者：蘇秀娟，（E-mail）smm1980@yeah.net;王愛(ài)凡，（E-mail）wangaifantop@163.com