高科技組織培養(yǎng)技術(shù)及草莓組織培養(yǎng)研究

邢小英

草莓為多年生草本植物，利用細(xì)胞工程技術(shù)，使用草莓莖尖、花藥、葉片等進(jìn)行組織培養(yǎng)，能實(shí)現(xiàn)草莓的快速繁殖。所培育出來的幼苗，產(chǎn)量也比一般繁殖方法多一成以上。筆者在概述植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，梳理了草莓組織培養(yǎng)的常用途徑和常見問題及對策。

1 植物組織培養(yǎng)概述

1.1 植物組織培養(yǎng)的概念

植物組織培養(yǎng)是利用植物細(xì)胞全能性原理，在無菌條件下，將離體莖或葉的表皮、葉脈、幼嫩莖或芽組織（如芽、胚軸等）用無菌水清洗，然后接種到培養(yǎng)基上，利用細(xì)胞分裂增殖、組織分化和器官形成等機(jī)制來生產(chǎn)植株的過程。植物組織培養(yǎng)是20世紀(jì)60年代中期在生物技術(shù)領(lǐng)域中發(fā)展起來的一項新興技術(shù)，是生物技術(shù)與現(xiàn)代生物學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物。在植物組織培養(yǎng)過程中，離體培養(yǎng)可以得到大量的變異植株，獲得大量優(yōu)良品種，進(jìn)行遺傳育種和細(xì)胞工程研究。組織培養(yǎng)也可用于植物轉(zhuǎn)基因、基因轉(zhuǎn)移、細(xì)胞融合等研究，并已成為一種重要的基因工程手段（圖1）。

1.2 植物組織培養(yǎng)過程中的基本要素

植物組織培養(yǎng)的基本要素主要包括外植體的選擇與消毒、培養(yǎng)基的配制、生長調(diào)節(jié)劑的選擇與使用以及無菌操作等。外植體選擇是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素。應(yīng)根據(jù)植物的種類、組織或器官、胚狀體或種子、器官的大小等，從生理狀態(tài)和形態(tài)結(jié)構(gòu)上進(jìn)行選擇。無菌操作是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)程進(jìn)行組織培養(yǎng)是成功的前提。培養(yǎng)基配制也是關(guān)鍵要素之一。根據(jù)外植體選擇相應(yīng)類型的培養(yǎng)基，同時要注意培養(yǎng)基中各種成分的配比，其中糖、無機(jī)鹽、有機(jī)化合物、水是基本培養(yǎng)基。還要注意選擇合適的激素濃度。生長調(diào)節(jié)劑使用也是影響植物組織培養(yǎng)的重要方面。要根據(jù)外植體和培養(yǎng)基類型正確使用生長調(diào)節(jié)劑。

1.3 影響植物組織培養(yǎng)的因素

一是培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是由基本培養(yǎng)基、附加成分組成?；九囵B(yǎng)基包括基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)和基本生長因子，基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)有無機(jī)鹽類，如 NaCl、 KCl；有機(jī)成分主要為糖類或氨基酸等，如蔗糖、麥芽糖等。輔助因子主要包括植物激素和生長調(diào)節(jié)劑，常用的輔助因子有：6- BA和 IAA，常用的基本培養(yǎng)基為 MS和B5。

二是滅菌方法。常用的滅菌方法有高溫滅菌法、高壓滅菌法及微波滅菌法等（圖2）。

三是接種材料。不同的材料生長狀態(tài)也不同，通常以愈傷組織為主，而植物材料的種類也影響到植物組織的類型，如水稻葉、水稻莖等；此外，接種材料對植物組織培養(yǎng)結(jié)果也有一定影響，如接種材料是莖，則莖段能發(fā)育成愈傷組織；接種材料是根，則根能發(fā)育成植株等。

四是溫度和光照。不同植物對溫度的要求不同，一般在25～28 ℃最為適宜；光強(qiáng)度對植物的影響較大，在光照度大于3000 勒克斯時，植物生長良好；在低光照度下，植物生長慢；在弱光下，植物生長快。因此在組織培養(yǎng)中應(yīng)盡量提高光照度。

五是碳源和氮源。碳源通常包括蔗糖、葡萄糖、乳糖等；氮源有尿素和硝酸銨等。培養(yǎng)基中的碳源和氮源的比例也很重要。一般是碳水化合物占80%～90%，氮源占10%～20%；培養(yǎng)基中蔗糖含量不低于30克/升。

六是細(xì)胞分裂素和生長素。他們對芽的形成有很大影響，因此在組織培養(yǎng)過程中必須注意這些因素對細(xì)胞分裂的影響。

此外，其他因素如培養(yǎng)基 pH值、鹽濃度等也會影響植物組織培養(yǎng)的效果。

1.4 植物組織培養(yǎng)的技術(shù)要點(diǎn)

植物組織培養(yǎng)是一個復(fù)雜又精細(xì)的過程，在整個過程中存在著一系列技術(shù)問題需要解決，主要包括植物材料的選擇與處理、接種培養(yǎng)基的配制與滅菌、腋芽誘導(dǎo)與增殖、生根培養(yǎng)、移栽和管理方法等。

1.4.1 植物材料的選擇與處理 植物組織培養(yǎng)所使用的外植體必須是新鮮、完整、沒有病蟲危害及死亡、沒有損傷和發(fā)育異常的植株。通常將帶有腋芽或剛長出腋芽不久的莖段剪下，作為外植體。

1.4.2 培養(yǎng)基的配制 必須使用無菌手術(shù)操作時所用的無菌材料，如無菌操作器械、剪刀、手術(shù)刀等。滅菌要嚴(yán)格按照無菌操作原則進(jìn)行，以保證所使用培養(yǎng)基中不帶有細(xì)菌和其他微生物。

1.4.3 腋芽誘導(dǎo) 腋芽是莖頂端分生組織中新生出來的一種小芽。這種芽可以在離體條件下分化成完整植株，而不會受到其他外界條件和內(nèi)源激素的影響。將植物材料（外植體）在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)時，往往會產(chǎn)生大量不定芽，如不定根、不定莖等，這些不定芽稱為腋芽。在培養(yǎng)基中進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)時，要注意盡量少用激素，這樣才能誘導(dǎo)出較多的腋芽。腋芽誘導(dǎo)一般需要6～7天。

1.4.4 生根培養(yǎng) 當(dāng)腋芽增殖到一定數(shù)量時，就可以把這些腋芽從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中。

2 草莓的組織培養(yǎng)技術(shù)

通過莖尖、花藥等部分的培養(yǎng)，可以有效地去除大部分植物體內(nèi)的病毒、真菌和細(xì)菌，從而促進(jìn)生長勢、豐富花色多樣性、增強(qiáng)抗逆性和提高產(chǎn)量[1]。按照采集、接種、培養(yǎng)、生根、移栽的流程，實(shí)現(xiàn)了工廠化生產(chǎn)，該技術(shù)在反季節(jié)生產(chǎn)中發(fā)揮了獨(dú)特的作用。草莓的組織培養(yǎng)有利于草莓優(yōu)良性狀的保持，促進(jìn)產(chǎn)量和品質(zhì)的提高等（圖3）[2]。

2.1 草莓組織培養(yǎng)影響因素

2.1.1 外植體材料的選擇 組織器官的不同，組培后代的變異程度也不同。草莓的子葉是草莓最重要的器官，草莓的生長、發(fā)育和花芽分化都與子葉密切相關(guān)，同時也是草莓繁殖的主要器官。匍匐莖是草莓植株基部萌發(fā)并生長出來的一段莖，在組織培養(yǎng)中，一般把它作為外植體，因為它很容易長出根，且生出的根多為匍匐莖。匍匐莖頂端一般有一對葉片和一朵小花。當(dāng)它產(chǎn)生不定芽時，將它從植株基部切下，成為外植體，并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根尖是草莓根部的一個小分支，位于植物中央的最深部分，是草莓組織培養(yǎng)中的重要外植體。莖尖是在莖基或芽上方0.5～1.0 厘米處剪取的一段，常用來作為草莓組織培養(yǎng)的外植體。通常認(rèn)為，在一定濃度的激素作用下，高度分化的組織或細(xì)胞可以獲得愈傷組織，并通過繼代培養(yǎng)獲得再生植株。含有分生組織的外植體，如莖尖、腋芽等，其分化率比葉片、根段、莖等的要低[3]。

2.1.2 培養(yǎng)基成分 在草莓的組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中激素的種類、濃度和組合與無性系變異有關(guān)，尤其是細(xì)胞分裂素的濃度過高是組培苗發(fā)生變異的重要原因之一。細(xì)胞分裂素可以通過誘導(dǎo)和抑制植株的生長，影響植株的形態(tài)和發(fā)育，從而影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。另外，細(xì)胞分裂素也可以影響植物的抗氧化能力、抗病蟲害能力以及抗環(huán)境脅迫能力等，從而影響植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量。

2.1.3 繼代次數(shù)和增殖率 無性系變異與繼代次數(shù)有著密切的關(guān)系，繼代次數(shù)越多，發(fā)生變異的頻率就越高。這是因為在一般情況下，遺傳變異是由多個基因突變而引起的，而基因突變又可以通過不斷地繼代來積累。在草莓組織培養(yǎng)實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)將繼代次數(shù)控制在10以內(nèi)，以達(dá)到生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，繼代次數(shù)超過30將嚴(yán)重影響草莓果實(shí)的產(chǎn)量與品質(zhì)。

2.2 草莓組織培養(yǎng)的常用途徑

2.2.1 草莓莖尖組織培養(yǎng)[5] 有以下技術(shù)環(huán)節(jié)：

（1）取材：以匍匐莖為外植體，將其剪成5～10 厘米長的小段，要求盡量取嫩的小段，并保證莖尖在培養(yǎng)基上分布均勻，且生長良好。取材可在植株開始發(fā)生匍匐莖時進(jìn)行。

（2）接種：將莖尖從基部剪下后，在無菌條件下進(jìn)行處理，切成5～10 厘米長的小段，消毒2～3次，接種在 MS+0.5 毫克/升6-BA+ 0.2 毫克/升NAA培養(yǎng)基上（圖4）。

（3）培養(yǎng)：將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)室或溫室內(nèi)，注意室內(nèi)溫度保持在18～25 ℃，相對濕度保持在90%以上。利用該設(shè)備對莖尖進(jìn)行繼代培養(yǎng)。一般1個月后形成愈傷組織，再30天后分化出不定芽，再約2周后分化出小苗。

（4）煉苗：將不定芽接種到生根培養(yǎng)基上后進(jìn)行煉苗。將試管苗轉(zhuǎn)移到暗室內(nèi)3～5天，然后轉(zhuǎn)入露地中煉苗3～5天。當(dāng)試管苗在0.5 毫克/升6-BA+0.1 毫克/升 NAA培養(yǎng)基上生長良好后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行移栽。

（5）移栽：將試管苗移栽到營養(yǎng)土中，并澆透水。

（6）定植：在溫室內(nèi)定植。定植前需對溫室內(nèi)進(jìn)行消毒處理，可用5%的次氯酸鈉溶液或0.2%的高錳酸鉀溶液消毒15 ～30 分鐘；或用75%酒精浸泡10～15秒；也可用1毫克/升的升汞溶液浸泡10 ～15 分鐘；也可用0.5%過氧乙酸溶液消毒30 ～45 分鐘。

（7）采集時間一般在12月中下旬，可從匍匐莖上剪取莖尖。

2.2.2 草莓花藥組織培養(yǎng)[6] 有以下技術(shù)環(huán)節(jié)：

（1）材料：選取當(dāng)年新抽發(fā)的花芽，要求無病蟲害，花瓣均勻，花藥飽滿。

（2）采集：將花序從植株上剪下，注意剪去花梗處的腋芽和果實(shí)。把花瓣取下來，用酒精浸泡消毒20 ～30 分鐘。然后在無菌條件下用鑷子將花藥夾出，放在超凈工作臺的載物臺上，用鑷子取下花藥。

（3）接種：將處理好的花藥置于 MS培養(yǎng)基上，并添加2～3毫克/升的6- BA和0.2毫克/升的NAA。培養(yǎng)室溫度為25～28 ℃，相對濕度為90%左右。

（4）培養(yǎng)：將花藥放入接種瓶中，每隔2～3天更換1次培養(yǎng)基。一般每30天左右便可形成愈傷組織并分化出不定芽。在愈傷組織分化過程中，需要適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充水分和養(yǎng)分，培養(yǎng)室溫度為18～25 ℃。

（5）煉苗：將愈傷組織轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，當(dāng)有1～2片新葉長出時即可移栽到大棚內(nèi)進(jìn)行煉苗。

（6）移栽：在溫室內(nèi)煉苗3～5天后便可移栽到露地中。當(dāng)秧苗生長健壯后便可移栽到營養(yǎng)土中進(jìn)行大田管理。

2.2.3 草莓葉片組織培養(yǎng) 有以下技術(shù)環(huán)節(jié)：

（1）取材：從植株上剪下健康無病蟲害的新葉，將其在無菌條件下進(jìn)行處理，并切成1厘米左右的小段。

（2）接種：將處理好的花藥放在適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

（3）培養(yǎng)：將花藥接種到葉片再生培養(yǎng)基上后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，30天左右便可形成愈傷組織；隨后在不添加任何激素的情況下進(jìn)行生根培養(yǎng)，30天左右便可形成不定芽；然后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行移栽[7]。

2.3 草莓組織培養(yǎng)中常見的問題與對策

2.3.1 褐化問題 在草莓組織培養(yǎng)中，褐化是常見問題之一。接種后7天內(nèi)草莓葉柄褐變不明顯，7天后，部分較弱的外植體可能發(fā)生褐變。隨著時間的推移，會有一些外植體出現(xiàn)死亡，而死亡的外植體會出現(xiàn)更加嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象[8]。研究表明，褐變主要是由酚類物質(zhì)氧化導(dǎo)致，酚類物質(zhì)在酚類物質(zhì)氧化酶的催化下生成喹諾酮類物質(zhì)。通過添加抗氧化劑和吸收劑，可以有效地抑制喹諾酮類化合物的形成。維生素C在植物組培苗中也被廣泛應(yīng)用，是一種抗褐變的物質(zhì)。采用過濾法向培養(yǎng)基中添加維生素C，可顯著抑制莖尖褐變，但操作費(fèi)時費(fèi)力[9]。用維生素C溶液浸泡草莓芽，300 毫克/升維生素C溶液可明顯抑制莖尖褐變，促進(jìn)外植體形成愈傷組織，并顯著提高萌發(fā)率。用維生素C浸泡9 分鐘后，褐變率較對照組明顯降低，說明褐變只會在一定時間內(nèi)被浸泡后停止。另外，PVV-抗氧化劑能顯著降低草莓莖尖褐變率，并能促進(jìn)愈傷組織生長，其萌發(fā)率可達(dá)100%。而添加活性炭則不會對褐變產(chǎn)生顯著影響。已有研究表明，用維生素C浸泡草莓芽苗，中間添加抗氧化劑 PVP，能顯著抑制芽苗褐變，并促進(jìn)愈傷組織的萌發(fā)[10]。

2.3.2 玻璃化問題 在組織培養(yǎng)過程中，玻璃化種苗保存是另一項很難完成的任務(wù)，王桂榮[11]的研究表明，玻璃化種苗保存與培養(yǎng)基種類及實(shí)驗室通氣性有關(guān)。在組織培養(yǎng)時，愈傷組織吸水較少，提高光照度，有利于葉綠素的合成，盡量使用固體培養(yǎng)基。玻璃化程度較高的植物，細(xì)胞分裂速度較快，可加入適量的赤霉素，以減緩細(xì)胞分裂速度。王愛勤等[12]對玻璃化幼苗進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：隨著外植體滅菌和培養(yǎng)時間的延長，糖、瓊脂濃度下降，細(xì)胞分裂素濃度提高，進(jìn)而使玻璃化幼苗的數(shù)量增加。

2.3.3 污染問題 在組織培養(yǎng)中，如果不能采取有效的防治措施，很容易造成污染問題。造成污染的原因有：真菌、霉菌、細(xì)菌和病毒等微生物，它們的繁殖速度很快，分布很廣，很難處理。操作人員應(yīng)注意工作臺、培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)箱的衛(wèi)生狀況，應(yīng)經(jīng)常擦拭，并及時保持干燥。各種真菌和孢子隨風(fēng)飄散，也是大氣污染的一個重要污染源。要經(jīng)常通風(fēng)，減少室內(nèi)真菌的積聚。在操作開始之前，一定要做好消毒工作，消毒之后，不能與任何東西接觸，要馬上去無菌區(qū)，進(jìn)行相關(guān)的操作。

3 結(jié) 語

植物組織培養(yǎng)是一項在生物技術(shù)領(lǐng)域中發(fā)展起來的新型技術(shù)，它在花卉、蔬菜、果樹、林木、藥材及牧草等植物育種和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用。開展草莓組織培養(yǎng)，可以有效地實(shí)現(xiàn)草莓品種的優(yōu)良性狀保持，防止品種退化，從而提高繁殖系數(shù)，緩解草莓種苗供需矛盾，促進(jìn)草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

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