miR-10b 通過激活 KLF4/Notch-1/STAT3 信號(hào)途徑加速腹主動(dòng)脈瘤的進(jìn)展

郭 暢，劉 欣，李妍潔，張明明

（1.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063210；2.河北省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，河北 石家莊 050057；3.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊 050011）

腹主動(dòng)脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是病變血管形成的永久性異常擴(kuò)張或膨出，其血管直徑超過正常直徑的50%，多由于動(dòng)脈壁先天性結(jié)構(gòu)異?；蚝筇煨圆±砀淖儯鹧鼙诰植勘∪?、張力減退，在血流的不斷沖擊下形成該種異常結(jié)構(gòu)［1］。研究表明，血管壁慢性炎癥、平滑肌細(xì)胞的異常增殖、凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）表達(dá)水平升高、細(xì)胞外基質(zhì)的降解等均促進(jìn)AAA 病程，這些病理過程之間相互作用，共同加速AAA 的發(fā)展［2］。當(dāng)前對(duì)動(dòng)脈瘤的主要治療手段局限于外科手術(shù)，對(duì)于AAA 的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，因此探究AAA 發(fā)病機(jī)理以尋找臨床潛在治療靶點(diǎn)，對(duì)預(yù)防AAA 破裂、降低致死率具有重要意義［3］。

微小RNA（microRNA，miRNA）作為一類內(nèi)源性、小分子非編碼RNA 在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中起到重要作用［4］。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miRNA已成為動(dòng)脈粥樣硬化、腹主動(dòng)脈瘤等心血管疾病的新的生物學(xué)標(biāo)志物，與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［5］。miR-10b 在多種類型的惡性腫瘤中的作用機(jī)制被廣泛研究［6，7］，但其對(duì)AAA 的影響與致病機(jī)理鮮少研究，W?gs?ter 等［8］發(fā)現(xiàn)miR-10b 在AAA 患者血漿內(nèi)表達(dá)明顯升高，進(jìn)而在動(dòng)脈瘤模型小鼠中發(fā)現(xiàn)miR-10b 促進(jìn)血管壁彈性蛋白降解和中性粒細(xì)胞募集進(jìn)而增加主動(dòng)脈破裂的風(fēng)險(xiǎn)。目前尚缺乏對(duì)miR-10b 促進(jìn)AAA 惡化的分子機(jī)制的深入研究，本文通過動(dòng)物及細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)，探討miR-10b 在AAA病理過程中的分子機(jī)制，以期為AAA 的靶向治療提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

水合氯醛（ST1002，華北制藥廠）；Thermo turbofect 轉(zhuǎn)染試劑（R0531）、雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（16161）、胎 牛 血 清（16140071）、1640 培 養(yǎng) 基（11875176）購自賽默飛世爾公司；雙熒光素酶載體psi-CHECK-2 由河北省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。血管 緊 張 素Ang Ⅱ（A9290）、Masson 染 色 試 劑 盒（G1340）、BCA 試劑盒（PC0020）、SDS-PAGE 凝膠試劑（P1200）、ECL 化學(xué)發(fā)光液（PE0010）購自美國索萊寶公司；佛波酯PMA（524400）購自美國Sigma公司；miR-10b mimics 及其陰性Nc 對(duì)照（杭州啟晨生物公司）；巨噬細(xì)胞CD68 多克隆抗體（BA3638）、a-SMA 抗體（BM002）以及SABC 免疫組化試劑盒（SA1055）、DAB 顯色試劑盒（AR1000）購自武漢博士德生物工程有限公司；抗體Notch1（ab52627）、MMP-2 （ab92536） 、MMP-9 （76003） 、KLF4（ab215036）、p-STAT3（ab267373）購 自Abcam 公司 ；DAPI（G1012-100 毫 升） 、BSA 試 劑（GC305006-100g）購自武漢塞維爾生物公司；KLF4抑制劑（HY12302，杭州昊鑫生物）；Notch-1 抑制劑（M04536-RVN，北京百奧萊博科技公司）；STAT3抑制劑（52926ES10，翌圣生物科技公司）；光學(xué)顯微鏡（CX21）、熒光倒置顯微鏡（型號(hào)IX71）購自日本Olympus 公司；慢病毒載體構(gòu)建相關(guān)化學(xué)物質(zhì)購自上海漢恒生物公司；凝膠成像系統(tǒng)（884-S 型，美國Bio-rad 公司）。

1.2 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

1.2.1 miR-10b 靶基因預(yù)測(cè) 利用生物學(xué)信息預(yù)測(cè)軟 件targetscan（http：//www.Targetscan.org）分 析結(jié)果顯示KLF4為miR-10b 的靶基因之一，miR-10b與KLF4-3′UTR 有靶向結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。

圖1 miR-10b 靶向結(jié)合KLF4-3'UTR 位點(diǎn)Fig 1 miR-10b targets binding to the KLF4-3'UTR site

1.2.2 構(gòu)建野生型及突變型雙熒光素酶載體 從基因庫中獲取KLF4的基因序列，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成KLF4-3′UTR 結(jié)合位點(diǎn)的野生型與突變型基因序列的正反鏈，并行PCR 擴(kuò)增。純化PCR 產(chǎn)物后，用限制性內(nèi)切酶Xh0I.和NotI.酶切37 ℃過夜，再將雙酶切后的片段用連接酶連接到psi CHECK-2 載體特異位點(diǎn)，野生型標(biāo)記為psi CHECK-2-KLF4-3′UTR-wt，突 變 型 標(biāo) 記 為psi CHECK-2-KLF4-3′UTR-mut。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶活性檢測(cè) 自上海細(xì)胞庫購入人單核THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清+1640 培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃、5%CO2。向?qū)?shù)期生長(zhǎng)的THP-1 單核細(xì)胞內(nèi)加入PMA 24 小時(shí)將其誘導(dǎo)為人THP-1 巨噬細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)于配置的1640 完全細(xì)胞培養(yǎng)基中。根據(jù)Thermo turbofect 轉(zhuǎn)染試劑操作說明將雙熒光素酶 載 體 與miR-10b mimic、miRNA-Nc 共 同 轉(zhuǎn) 染至THP-1 巨 噬 細(xì) 胞，細(xì) 胞 分 組 為：（1）psi CHECK-2-KLF4-3′UTR-wt+miR-10b Nc；（2）psi CHECK-2-KLF4-3′UTR-wt+miR-10b mimic；（3）psi CHECK-2-KLF4 -3′UTR-mut+miR-10b Nc；（4）psi CHECK -2-KLF4-3′UTR-mut+miR-10b mimic。轉(zhuǎn)染完成后繼續(xù)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2環(huán)境，48 h 后收集細(xì)胞并裂解、離心，按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒操作說明規(guī)范進(jìn)行，最后測(cè)定相對(duì)熒光活性。

1.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.3.1 AAA 動(dòng)物模型構(gòu)建 采用經(jīng)典血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）［9］灌注法造模：20 只apoE-/-小鼠隨機(jī)分為miR-10b 組：Ang Ⅱ（1 000 ng/kg/min）皮下緩慢泵入+含miR-10b 過表達(dá)慢病毒（1×108TU）基因尾靜脈注射，和模型組：Ang Ⅱ（1 000 ng/kg/min）皮下緩慢泵入，Ang Ⅱ持續(xù)皮下泵入28 d，另取10只同品系假手術(shù)小鼠同等劑量生理鹽水皮下泵入作空白對(duì)照。所有小鼠均從河北伊維沃生物科技有限公司購買，品系為apoE-/-雄鼠（生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（冀）2020-002），平均重量（23±1）g，8～10 周齡，給予同等飼養(yǎng)條件（光照/黑暗時(shí)間每日各連續(xù)12 h，相對(duì)溫度19～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由飲水和進(jìn)食），飼養(yǎng)地點(diǎn)為河北省人民醫(yī)院臨床研究中心SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)已通過河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查，編號(hào)：（2020）科研倫審第（291）號(hào)。

1.3.2 病理學(xué)染色 所有小鼠在3%水合氯醛腹腔注射麻醉狀態(tài)下實(shí)施解剖，打開胸腔及腹腔，暴露心臟及其相連血管，將4 ℃生理鹽水勻速灌注左心室，剝離血管周圍脂肪組織及結(jié)締組織，分離出腎下腹主動(dòng)脈，然后將瘤體組織及正常腹主動(dòng)脈組織用4%多聚甲醛固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后制作成5 μm 厚病理切片，分別行Mssson 染色、CD68+與α-SMA 免疫組化染色、MMP-2與MMP-9 熒光雙染，鏡下觀察病理學(xué)形態(tài)并拍照記錄。

1.3.3 Western-blot 檢測(cè) 將3 組小鼠的血管組織研磨成組織勻漿，離心提取蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白然后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜上，依次進(jìn)行5% 脫脂奶粉2 h 封閉、滴加一抗4 ℃過夜、TBST 洗滌、滴加酶標(biāo)二抗37 ℃孕育2 h，最后經(jīng)電化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)掃描顯影，顯示小鼠血管組織 中 蛋 白KLF4、Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9 的表達(dá)量。

1.4 體外實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化與轉(zhuǎn)染［10］THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化步驟同1.2.3。利用慢病毒轉(zhuǎn)染miR-10b mimic 及其陰性Nc 對(duì)照，分別為miR-10b過表達(dá)、miR-10b 正常表達(dá)的THP-1 巨噬細(xì)胞，并用100 μmol/L 的Ang Ⅱ與轉(zhuǎn)染后的THP-1 巨噬細(xì)胞作用1 h，以備藥物分組實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 THP-1 巨噬細(xì)胞分組 應(yīng)用KLF4 抑制劑、Notch-1 抑制劑、STAT3 抑制劑將細(xì)胞隨機(jī)分為：（1）Nc 組；（2）miR-10b mimic 組；（3）Nc+ KLF4 抑制 組；（4）miR-10b mimic+ KLF4 抑 制 組；（5）Nc+Notch-1 抑 制 組；（6）miR-10b mimic+ Notch-1 抑 制組；（7）Nc+STAT3 抑 制 組；（8）miR-10b mimic+STAT3 抑制組。

1.4.3 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白量檢測(cè) 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液并用PBS 溶液沖洗兩次，用細(xì)胞裂解液將上述8組細(xì)胞充分裂解，用刮刀及移液槍迅速將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL 離心管，離心后留取上清液-20℃保存，而后提取蛋白等步驟同1.2.3，比較各組蛋白表達(dá)水平的差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 27.0 處理數(shù)據(jù)，定量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為P＜0.05。GrapgPad Prism 9.0 繪圖。

2 結(jié)果

2.1 雙熒光素酶活性

兩組攜帶KLF4 野生型（wt）3′UTR 載體的相對(duì)熒光活性，轉(zhuǎn)染miR-10b mimic 組的顯著低于miR-10b Nc 組（P＜0.05）；而兩組攜帶KLF4 突變型（mut）3′UTR 載體的相對(duì)熒光活性無明顯差異（P＞0.05）；同樣共轉(zhuǎn)染miR-10b mimic，轉(zhuǎn)染KLF4 突變型（mut）3′UTR 載體組細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性明顯高于轉(zhuǎn)染KLF4 野生型（wt）3′UTR 載體組（圖2）。以上結(jié)果說明miR-10b 可靶向作用于基因KLF4。

圖2 雙熒光素酶相對(duì)活性分析Fig 2 Analysis of relative activities of dual luciferase enzymes

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 病理學(xué)染色結(jié)果 Masson 染色發(fā)現(xiàn)，3 組小鼠間血管或瘤體直徑差異顯著（P＜0.05），其中miR-10b 組最寬，模型組次之，血管外壁膠原沉積量也呈上升趨勢(shì)，主動(dòng)脈纖維化加重。見圖3A。

圖3 小鼠血管組織病理學(xué)染色Fig 3 Histopathologic staining of mouse blood vessels

免疫組化實(shí)驗(yàn)可見，CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量在正常主動(dòng)脈壁中較少，而動(dòng)脈瘤血管壁有大量炎癥細(xì)胞積聚并浸潤，與模型組相比，miR-10b 組的這種現(xiàn)象加強(qiáng)了。見表1，圖3B。血管平滑肌細(xì)胞是組成動(dòng)脈血管的重要成分，分為收縮型和增殖型兩種表型，正常血管以收縮型為主，維持血管的彈性與順應(yīng)性，在動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，會(huì)發(fā)生兩種表型的相互轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致以α-SMA 為標(biāo)志物的收縮表型平滑肌細(xì)胞數(shù)量大幅減少，繼而增加瘤體破裂的風(fēng)險(xiǎn)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)α-SMA 染色陽性在假手術(shù)組最高，miR-10b 組明顯減少甚至部分區(qū)域?yàn)榱惚磉_(dá)，模型組雖較miR-10b 組表達(dá)顯著性增多，但仍遠(yuǎn)少于假手術(shù)對(duì)照組，可見miR-10b 會(huì)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡。見表1、圖3C。

表1 3 組小鼠血管組織中物質(zhì)表達(dá)水平比較（±s）Tab 1 Comparison of substance expression levels in vascular tissues of three groups of mice（±s）

表1 3 組小鼠血管組織中物質(zhì)表達(dá)水平比較（±s）Tab 1 Comparison of substance expression levels in vascular tissues of three groups of mice（±s）

注：與假手術(shù)組比，aP＜0.001；與模型組比，bP＜0.001。

組別假手術(shù)組MMP-2 相對(duì)熒光強(qiáng)度0.21±0.04 MMP-9 相對(duì)熒光強(qiáng)度0.16±0.04模型組巨噬細(xì)胞陽性面積（μM2）28 667±18 031 99 001±17 652a平滑肌細(xì)胞陽性面積（μM2）176 000±13 446 86 999±9 818 a 0.62±0.03 a 0.69±0.04 a miR-10b 組176 333±15 782b 32 667±10 820 b 1.22±0.04 b 1.32±0.05 b F P 184.8 398.4 2 007 1 613＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

雙熒光染色中，MMP-2 與MMP-9 分別顯示綠色熒光和紅色熒光，熒光強(qiáng)度在假手術(shù)組血管中最弱，在動(dòng)脈瘤組織中明顯增強(qiáng)，miR-10b 組最強(qiáng)。見表1、圖3D、3E。

2.2.2 血管組中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 蛋白KLF4 在假手術(shù)組、模型組、miR-10b 組表達(dá)逐漸減少，蛋白Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9 在3 組中呈升高趨勢(shì)，且各組間變化顯著（P＜0.001）。見圖4。

圖4 小鼠血管組織中蛋白表達(dá)水平比較Fig 4 Comparison of protein expression levels in vascular tissues of mice

2.3 各組THP-1 巨噬細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平

（1）、（2）兩組細(xì)胞間，后者KLF4 表達(dá)較少、而Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9 表 達(dá) 顯 著 偏多，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），這與2.2.2 的結(jié)果相符，說明miR-10b 對(duì)動(dòng)脈瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)有影響。見圖5。

圖5 各組THP-1 巨噬細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平比較Fig 5 Comparison of protein expression levels in THP-1 macrophages in each group

（3）（4）組細(xì)胞與（1）（2）組細(xì)胞相比，KLF4 抑制劑抑制KLF4 表達(dá)，而Notch-1 顯著增多，間接說明KLF4 靶向下調(diào)Notch-1 的功能。見圖5A1、A2；（5）（6）組細(xì)胞與（1）（2）組細(xì)胞相比，Notch-1 被抑制而減少表達(dá)，p-STAT3 也隨之降低表達(dá)，證明Notch-1 可靶向上調(diào)p-STAT3 表達(dá)。見圖5B、B2；（7）（8）組細(xì)胞與（1）（2）組細(xì)胞相比，p-STAT3 被抑制表達(dá)，MMP-2 與MMP-9 表達(dá)量也明顯降低，可知p-STAT3 直接促進(jìn)蛋白MMP-2、MMP-9 的表 達(dá)。見圖5C1，C2。

3 討論

腹主動(dòng)脈進(jìn)行性局部擴(kuò)張超過3 cm 容易導(dǎo)致腹主動(dòng)脈破裂，當(dāng)前主要治療手段為手術(shù)修復(fù)，尚缺乏有效治療的藥物。雖然修復(fù)技術(shù)愈來愈成熟，但由于AAA 破裂的突發(fā)性和嚴(yán)重性，常導(dǎo)致?lián)尵葻o效而死亡［12，13］。為此，本文旨在研究動(dòng)脈瘤發(fā)病的分子機(jī)制，尋找預(yù)防高風(fēng)險(xiǎn)人群發(fā)病、延緩動(dòng)脈瘤進(jìn)展的藥物靶點(diǎn)。

AAA 發(fā)病的分子機(jī)制尚不完全清楚，炎癥被認(rèn)為是 AAA 發(fā)展的核心因素，貫穿AAA 的整個(gè)病程［14］。以巨噬細(xì)胞為主的多種炎癥細(xì)胞浸潤至主動(dòng)脈壁，通過細(xì)胞直接接觸或分泌細(xì)胞因子及蛋白酶，使細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管平滑肌細(xì)胞凋亡減少，進(jìn)而發(fā)生病理性血管重塑，啟動(dòng)或促進(jìn)AAA 的擴(kuò)增［15］。miRNA 是一類高度保守的組織特異性小分子非蛋白質(zhì)編碼RNA，廣泛存在于人體各器官與組織中，參與氧化應(yīng)激和細(xì)胞自噬、增殖、凋亡等病理、生理過程［16］。相關(guān)研究表明［17］，miRNA 參與了調(diào)控AAA 的病理過程，通過靶向調(diào)節(jié)下游基因，激活內(nèi)皮和血管平滑肌細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)炎癥，影響動(dòng)脈瘤形成。有研究人員發(fā)現(xiàn)miR-10b對(duì)動(dòng)脈瘤病情發(fā)展有促進(jìn)作用，本文通過生物學(xué)信息預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)miR-10b 與KLF4-3′UTR 有靶向結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定KLF4是miR-10b 的靶基因。本研究結(jié)果顯示，患有動(dòng)脈瘤的小鼠動(dòng)脈組織中KLF4較正常小鼠顯著減少，且隨著miR-10b 的高表達(dá)，KLF4表達(dá)下降，血管CD68+巨噬細(xì)胞浸潤增多及病變程度加重，側(cè)面說明缺乏KLF4 可能為動(dòng)脈瘤惡化的危險(xiǎn)因素。本文使用Ang Ⅱ誘導(dǎo)建立動(dòng)物模型，Ang Ⅱ能募集并刺激巨噬細(xì)胞活化，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)MMP 表達(dá)，引起巨噬細(xì)胞的趨化反應(yīng)，最終導(dǎo)致腹主動(dòng)脈瘤形成［18］。KLF4在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化方面起著關(guān)鍵作用，巨噬細(xì)胞KLF4 會(huì)增加其向促炎M1 樣表型極化，加重炎癥反應(yīng)和組織損傷，KLF4 對(duì)動(dòng)脈瘤患者有正向保護(hù)功能［19］。

Notch-1 信號(hào)通路可通過影響血管平滑肌細(xì)胞凋亡增加收縮分化，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)參與AAA 疾病進(jìn)程［20，21］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)IL-6 可上調(diào)STAT3 活性以影響蛋白水解活性巨噬細(xì)胞的積累以及MMPs 的表達(dá)，STAT3 轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)傳導(dǎo)可 誘 發(fā) 動(dòng) 脈 基 質(zhì) 蛋 白 水 解［22］。另 外，p-STAT3 是STAT3 的活化形式，在組織和細(xì)胞內(nèi)多以此種形式發(fā)揮生物學(xué)功能［23］。KLF4、Notch-1、STAT3 之間存在信號(hào)傳導(dǎo)通路的交匯［24，25］。

MMP-2 和MMP-9 作 為MMPs 家 族 中 的 重 要成員，具有水解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞血管壁結(jié)構(gòu)完整性的能力，能導(dǎo)致血管順應(yīng)度減退、彈性降低，最終在血流沖擊下血管壁局部膨出、動(dòng)脈瘤形成［26］。大動(dòng)脈中膜主要由彈性膜、平滑肌和彈性纖維構(gòu)成，外膜主要是由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，包含豐富的細(xì)胞外基質(zhì)，其中主要成分是彈性纖維和膠原蛋白，免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)MMP-2 蛋白主要聚集于血管中膜，MMP-9 蛋白主要在血管外膜累積，二者降解血管壁重要支撐成分，造成主動(dòng)脈壁逐漸變薄和過度基質(zhì)重塑，是形成病理性血管擴(kuò)張的必要條件。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)Ang Ⅱ灌注后的腹主動(dòng)脈瘤小鼠動(dòng)脈組織內(nèi)MMP-2 和MMP-9 蛋白顯著增多，轉(zhuǎn)染miR-10b 過表達(dá)后，表達(dá)水平較模型組更高，同樣，用Ang Ⅱ刺激作用后miR-10b 組THP-1 巨噬細(xì)胞，較未轉(zhuǎn)染Nc 組的MMP-2 和MMP-9 表達(dá)量也顯著偏高，Notch-1、p-STAT3 蛋白在各組小鼠和巨噬細(xì)胞的表達(dá)趨勢(shì)與MMP-2、MMP-9 相一致，但KLF4表達(dá)趨勢(shì)則與之相反，本文研究亦證實(shí)miR-10b 對(duì)KLF4 基因具有靶向抑制作用，說明miR-10b 可能通過下調(diào)KLF4 繼而上調(diào)下游分子Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9 的表達(dá)，促進(jìn)動(dòng)脈瘤的惡化。

但上述分子在AAA 組織中的上下游作用關(guān)系尚不明確，故本研究增加體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制KLF4 表達(dá)后，Notch-1 表達(dá)量顯著上升；抑制Notch-1 表達(dá)后，p-STAT3 表達(dá)隨之顯著減少；抑制p-STAT3 的 表 達(dá)，MMP-2 與MMP-9 表 達(dá) 水 平 也 明顯減少，提示信號(hào)通路可能為KLF4/ Notch-1/STAT3，其 中KLF4 對(duì)Notch-1 靶 向 抑 制，Notch-1對(duì)STAT3 是正向促進(jìn)作用，STAT3 對(duì)下游靶蛋白MMP-2 和MMP-9 亦為正向調(diào)節(jié)。動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，除本文信號(hào)途徑傳導(dǎo)兩種MMPs 表達(dá)外，ERK1/2 也是其上游信號(hào)分子［27］，同時(shí)，氧化應(yīng)激也被認(rèn)為是動(dòng)脈瘤的發(fā)生機(jī)制之一［28］，并可作為輔助AAA 管理的新的生物學(xué)標(biāo)志物［29］。

綜上所述，miR-10b 通過影響KLF4/Notch-1/STAT3 信號(hào)通路，引起動(dòng)脈瘤組織中MMP-2、MMP-9 表達(dá)增加，從而加速AAA 的進(jìn)程。

作者貢獻(xiàn)度說明：

郭暢：調(diào)研整理文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)研究方案及論文框架，起草論文；劉欣、李妍潔：參與研究，實(shí)施研究過程，采集整理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析；張明明：提出研究選題，獲取技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)性支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。