miR-155 靶向SMAD2 在小鼠狼瘡腎炎足細(xì)胞損傷和炎性反應(yīng)中的影響

張 潔，徐璐瑤，吳昱升，王 蓉，楊嵐茵，藍(lán)夢麟，林雨倩，黃艷琴，林 栩

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西 百色 533000；2.廣西免疫相關(guān)性疾病醫(yī)學(xué)科研基礎(chǔ)保障重點實驗室，廣西 百色533000）

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中較常見的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致SLE 患者死亡率增加的主要危險因素[2]。LN 直接影響腎臟的功能，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的腎損害和衰竭[3]，因此針對LN 展開相關(guān)研究至關(guān)重要。 MicroRNA-155 是微小RNA(miRNA)超家族的成員，在調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成、炎癥和免疫應(yīng)答中起重要作用[4]。miR-155 是LN 的重要危險因素[4,5]，有研究表明，miR-155 對足細(xì)胞損傷有影響[6,7]。SMAD 家族成員2（SMAD2）作為TGF-β 的下游分子，在將TGF-β 超家族配體的細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核過程中起重要作用[11,12]，而且研究發(fā)現(xiàn)SMAD2 參與腎纖維化進(jìn)程[13]。生物信息學(xué)分析及文獻(xiàn)報道表明,miR-155 與SMAD2 具有靶向調(diào)控關(guān)系[11,14]，但其在LN 中的作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在探索miR-155 調(diào)控SMAD2 表達(dá)在LN 中發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步理解LN 的發(fā)病機(jī)制，以及探索新的治療策略和靶向治療提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

1.1.1 實驗動物 6 周齡MRL/lpr 雌性小鼠40 只及C57BL /6 雌性小鼠8 只，江蘇華創(chuàng)信諾公司,許可證編號：SCXK(蘇)2020-0009。喂養(yǎng)、取材以及實驗等操作均于廣西百色市右江民族醫(yī)學(xué)院動物實驗中心（SPF 級）進(jìn)行,適應(yīng)環(huán)境一周后用于實驗。本實驗由廣西百色市右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會審批通過后開展相關(guān)性實驗，審批號：20200630001，整個實驗過程全部嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》規(guī)范要求進(jìn)行。

1.1.2 實驗試劑 蘇木素（Sigma）、伊紅、二甲苯（國藥集團(tuán)）、AAV9 腺相關(guān)病毒（漢恒生物）、尿蛋白試 劑 盒 (南 京 建 成) 、TRIzol Reagent( invitrogen) 、miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Master Mix（翌圣生物）、內(nèi)參U6、引物(上海生工) 。RIPA 裂解液(英文特生物) 、PMSF、20X TBST、牛血清白蛋白、4%多聚甲醛（北京索萊寶）、PAGE 凝膠快速制備試劑盒、BCA 試 劑 盒 (上 海 雅 酶 生 物) 、PVDF 膜（美 國Millpore）。 P-cadherin 、nephrin 和SMAD2 抗 體(Abcam) 、ECL 發(fā)光劑、GAPDH 、山羊抗兔免疫球蛋白(H+L)HRP (江蘇親科生物) 。濃縮型正常山羊血清、光（CY3）標(biāo)記羊抗兔IgG（武漢博士德生物）、 IL-6 和TNF-α、DAPI（碧云天）、抗熒光淬滅劑（southernbiotech）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 (1) 空白組:C57BL/6 雌性小鼠尾靜脈注射生理鹽水（0.2 mL/只）；(2)模型組：MRL/lpr 雌性小鼠尾靜脈注射生理鹽水（0.2 mL/只）；(3) AAV9-miR-NC 組：MRL/lpr 雌性小鼠尾靜脈注射miR-155 上調(diào)陰性對照AAV（0.2 mL/只）；(4) AAV9-miR-155組：MRL/lpr雌性小鼠尾靜脈注射miR-155 上調(diào)AAV（0.2 mL/只）；(5) AAV9-miR-anti組：MRL/lpr雌性小鼠尾靜脈注射miR-155抑制AAV（0.2 mL/只）；(6)AAV9 -miR-anti-NC 組：MRL/lpr雌性小鼠尾靜脈注射miR-155 抑制陰性對照AAV（0.2 mL/只）。

1.2.2 miR-155-5p 靶基因預(yù)測 通過在線靶基因預(yù)測網(wǎng)站Target genes(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測miR-155-5p 與SMAD2 的結(jié)合位點。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測實驗 構(gòu)建LT-m-smad2-3UTR-wt、LT-m-smad2-3UTR-mut質(zhì)粒（漢恒上海），通過Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑分別 將 LT-m-smad2-3UTR-wt 和 LT-m-smad2-3UTR-mut 分 別 與 miR-155-5pmimics 和miR-155-5p-NC 共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.4 HE 染色 取腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定組織樣本，固定時間為24 h，使用常規(guī)梯度乙醇進(jìn)行脫水處理，然后用二甲苯進(jìn)行透明化處理，接著進(jìn)行石蠟包埋。隨后進(jìn)行超薄切片處理，常規(guī)脫蠟，蘇木素染色，使用鹽酸乙醇進(jìn)行分化處理，接著進(jìn)行伊紅復(fù)染。最后使用梯度乙醇進(jìn)行脫水處理，并使用中性樹脂進(jìn)行封片。最終在光鏡下觀察組織的病理變化，并拍攝照片以進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

1.2.5 尿蛋白水平 給予處理最后1 周收集小鼠尿液樣本，并使用考馬斯亮藍(lán)（CBB 法）來檢測尿液中的蛋白質(zhì)含量。根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀在光波長為595 nm 測定光密度（OD）值。然后，根據(jù)以下計算公式計算尿液中蛋白質(zhì)的濃度：尿蛋白濃度（mg/L）= 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（524 mg/L）×（測定OD 值-空白OD 值） /（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）。

1.2.6 實時定量 PCR 法檢測 用 Trizol 提取各組細(xì)胞總RNA，測定RNA 濃度，然后將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,具體操作按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，其以內(nèi)參為U6，LightCycler96 實時熒光定量PCR 儀 進(jìn) 行 擴(kuò) 增。結(jié) 果 以 2-△△CT法 計 算 分 析miR-155 的相對表達(dá)量。引物見表1。

表1 qRT-qPCR 引物序列Tab 1 RT-qPCR primer sequences

1.2.7 Western blot 實驗 取凍存的腎臟組織制成勻漿，加入適量預(yù)冷 RIPA 緩沖液，充分混勻后在冰上裂解30 min。隨后離心提取總蛋白，并使用二巰基甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。取等質(zhì)量的蛋白進(jìn)行上樣，經(jīng)凝膠電泳分離樣品蛋白，然后進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜。取目的條帶后使用牛血清白蛋白制成的封閉液，在4 ℃下封閉3 h。封閉液稀釋一抗（nephrin、P-cadherin 和SMAD2）制成孵育液，稀釋比例為1∶1 000，在4 ℃過夜孵育。之后使用TBST 漂洗樣品3 次，加入稀釋比例為1∶6 000 的對應(yīng)二抗孵育液，在室溫孵育2 h。再次用TBST 漂洗樣品3 次，最后使用ECL 發(fā)光劑進(jìn)行顯影。分析使用Image J軟件對各組蛋白的灰度進(jìn)行分析，以GAPDH 作為內(nèi)參。目的蛋白相對表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。

1.2.8 免疫熒光染色 取腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，使用梯度酒精進(jìn)行組織脫水、透明化、浸蠟和包埋切片。然后，使用二甲苯和酒精分別進(jìn)行脫蠟處理。接下來進(jìn)行抗原修復(fù)，將組織切片放入山羊血清中進(jìn)行室溫封閉，封閉時間為30 min。之后，加入IL-6、TNF-α 的目標(biāo)抗體進(jìn)行孵育，將孵育過的切片放入4 ℃的濕盒中避光孵育過夜。隨后，分別滴加熒光標(biāo)記物，將切片放入濕盒中，在37 ℃孵育1 h，然后滴加DAPI 進(jìn)行染核。最后，使用含有抗熒光淬滅劑的封片液進(jìn)行封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS23.0 統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)用以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-155 與SMAD2 存在靶向互作的關(guān)系

靶基因預(yù)測網(wǎng)站Target genes 結(jié)果顯示，miR-155-5p 與SMAD2 的3’-UTR 結(jié) 構(gòu) 域 有 結(jié) 合 區(qū)域，見圖1。

圖1 miR-155-5p 與SMAD2-3' UTR 靶位點結(jié)合示意圖Fig 1 The binding diagram of miR-155-5p and SMAD2-3'UTR target site

2.2 雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-155與SMAD2 的靶向關(guān)系

轉(zhuǎn)染野生型SMAD2 基因表達(dá)載體WTSMAD2 后，與NC mimics 對 照 組 相 比，miR-155-5p-3' UTR-WT 的luciferase 的 表 達(dá) 顯 著 下 調(diào)（t=23.93，P＜0.001），而轉(zhuǎn)染突變型SMAD2 基因表達(dá)載體MUT- SMAD2 后，與NC mimics 對照組相比，miR-155-5p-3' UTR-MUT 的luciferase 的 表 達(dá) 差 異不 顯 著（t=0.126 9，P=0.905 1＞0.05）可 見，miR-155-5p 可以靶向調(diào)控SMAD2 的表達(dá)，見圖2。

圖2 雙熒光素酶實驗驗證miR-155-5p 靶向結(jié)合SMAD2Fig 2 Double-luciferase experiment to verify the targeted binding of miR-155-5p to SMAD2

2.3 尿蛋白水平

CBB 法檢測各組24 h 尿蛋白含量顯示，各組與空白組相比 ，尿蛋白呈現(xiàn)升高的趨勢（P＜0.05）。和模型組、AAV9-mir-NC 組相比， AAV9-miR-155組 尿 蛋 白 升 高（P＜0.001）；和 模 型 組 、AAV9-miR-anti-NC 組相比，AAV9-miR-anti 組尿蛋白呈降低趨勢（P＜0.001）；模型組、AAV9-miR-NC組和AAV9-miR-anti-NC 組的尿蛋白含量則差異不明顯（P＞0.05）。見圖3。

圖3 小鼠尿蛋白含量Fig 3 The levels of urinary proteins in mice

2.4 HE 染色

空白組：腎臟結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯增生變性。模型組鏡下出現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞增生 ， 伴有炎性細(xì)胞浸潤。AAV9-miR-155 組有腎小球細(xì)胞較明顯增生， 且有較多炎性細(xì)胞浸潤 。AAV9-miR-anti 組則腎組織結(jié)構(gòu)輕度異常，腎實質(zhì)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，個別腎小球基底膜增厚。AAV9-miR-NC組、 AAV9-miR-anti-NC 組則鏡下亦可見腎組織結(jié)構(gòu)異常、腎小球系膜細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤，病理改變嚴(yán)重程度與模型組相似。見圖4。

圖4 小鼠腎組織HE 染色（200×）Fig 4 The HE staining of renal tissue from mice（200×）

2.5 各組小鼠中miR-155 RNA 的表達(dá)水平

結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組、AAV9-miR-155 組 和AAV9-miR -NC 組miR-155-5p 的 表 達(dá) 水 平 均 上 調(diào)（P＜0.05），和 模 型 組、AAV9-miR-NC 組 相 比，AAV9-miR-155 組miR-155-5p RNA 表達(dá)水平增加較顯著（P＜0.001），而AAV9-miR-NC 組和模型組相比差異不明顯（P＞0.05）；與空白組相比，模型組、AAV9-miR-anti 組和AAV9-miR-anti-NC 組miR-155-5p 表達(dá)水平均有上調(diào)（P＜0.05），和模型組、AAV9-miR-anti-NC 組相比，AAV9-miR-anti 組miR-155-5p RNA 有 降 低 趨勢（P＜0.001），而AAV9-miR-anti-NC 組和模型組相比差異不明顯（P＞0.05）。見圖5。

圖5 小鼠miR-155 RNA 的表達(dá)情況Fig 5 The expression of miR-155 RNA in mice

2.6 過表達(dá)及抑制miR-155 對nephrin、P-cadherin和SMAD2 蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組 P-cadherin（P＜0.01）、nephrin （P＜0.05）和SMAD2 （P＜0.001）蛋白表達(dá)均降低。 與模型組、AAV9-miR-NC 組相比，AAV9-miR-155 組nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表達(dá)量顯著降低（均P＜0.05）；而與模型組、AAV9-miR-anti-NC 組 相 比， AAV9-miR-anti 組nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表達(dá)增加（均P＜0.05）；另 外，模 型 組、AAV9-miR-NC 組、AAV9-miR-anti-NC組nephrin、P-cadherin和SMAD2蛋白差異不明顯（P＞0.05）。結(jié)果提示：模型組相對空白組SMAD2 蛋白表達(dá)降低，并且小鼠足細(xì)胞有所損傷；過表達(dá)miR-155-5p 抑制SMAD2 蛋白表達(dá)，并促進(jìn)小鼠足細(xì)胞損傷，抑制miR-155-5p 可使SMAD2 蛋白表達(dá)增加，而小鼠足細(xì)胞損傷則有所改善。見圖6、7。

圖6 小空白組和對照組nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表達(dá)情況Fig 6 The protein expression of nephrin， P-cadherin and SMAD2 in blank and control groups

圖7 過表達(dá)和抑制miR-155 對nephrin、P-cadherin 和SMAD2 蛋白表達(dá)影響Fig 7 Effects of overexpression and inhibition of miR-155 on nephrin， P-cadherin and SMAD2 protein expression

2.7 過表達(dá)及抑制miR-155 表達(dá)對IL-6、TNF-α 表達(dá)的影響

與空白組比較，其余各組 IL-6、TNF-α 蛋白熒光強(qiáng)度均表現(xiàn)為增加趨勢。 與模型組、AAV9-miR-NC 組 相 比， AAV9-miR-155 組IL-6、TNF-α 熒光強(qiáng)度均增加較顯著；與模型組、AAV9-miR-anti-NC組相比，AAV9-miR-anti組IL-6、TNF-α 則降低較顯著，模型組、AAV9 -miR-NC 組、AAV9-miR-anti-NC 組熒光強(qiáng)度未見明顯差異。見圖8、9。

圖8 各組腎組織 TNF-α 免疫熒光（400×）Fig 8 The kidney tissue TNF-α immunofluorescence for each group （400×）

圖9 各組腎組織 IL-6 免疫熒光（400×）Fig 9 The kidney tissue IL-6 immunofluorescencefor each group （400×）

3 討論

SLE 是一種慢性全身性自身免疫性疾病，其特征是異質(zhì)性表現(xiàn)和多種自身抗體的產(chǎn)生［1，15，16］。目前，SLE 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，陽光照射或病毒感染可在具有遺傳易感性的個體中誘發(fā)疾病，其中女性是其中最脆弱的群體［1］。誘因激活先天免疫和適應(yīng)性免疫，從而導(dǎo)致T 細(xì)胞激活自身反應(yīng)性B 細(xì)胞，并導(dǎo)致免疫復(fù)合物沉積在組織中，引起自身免疫級聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)可能僅限于單個器官也可能涉及全身［17］。LN 是SLE 最常見和最嚴(yán)重的并 發(fā)癥之一，大約25%～50%的SLE 患者合并有LN，LN 顯示炎癥細(xì)胞因子高表達(dá)、腎小球腎炎和腎功能受損［15，16］，并且在 10%～20% 的患者中作為疾病的初始表現(xiàn)進(jìn)展為終末期腎?。?8］。目前LN 療法在誘導(dǎo)緩解或預(yù)防新發(fā)作方面不夠有效，并非所有患者都表現(xiàn)出足夠的治療反應(yīng)［19］。所以，對LN 發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，有助于探究疾病的治療策略，降低疾病的發(fā)生率。miRNA 在SLE 以及LN 中的腎臟發(fā)育和免疫病理、生理過程中起著關(guān)鍵作用，miRNA 失調(diào)可能導(dǎo)致腎臟細(xì)胞增殖異常、炎癥和腎臟纖維化［9，20，21］。

miRNA 是一種非編碼RNA 分子，由18～25 個核苷酸組成，可通過與mRNA 的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）結(jié)合來調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)［4，9］。miRNA通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等各種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［4］。miRNA 的異常表達(dá)會導(dǎo)致免疫性疾病，如自身免疫性疾 病 和 自 身 炎 癥 性 疾 病［22，23］。miR-155 是miRNA超家族的成員，介導(dǎo)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成、炎癥和免疫應(yīng)答［4］，參與SLE 進(jìn)展和器官損傷［9］以及LN 的炎癥過程［4］。研究表明，外泌體miR-155 在SLE 患者中上調(diào)，外泌體miR-155 表達(dá)水平可作為診斷SLE 和LN 的潛在生物標(biāo)志物［9］。此外，在狼瘡患者中的血液、尿液、外周血單核細(xì)胞、血漿中也發(fā)現(xiàn)了顯著上調(diào)的miR-155［5，8，10］。這些研究表明，miR-155 參與LN 炎癥進(jìn)程，并呈高表達(dá)。在本研究中，與空白組相比，模型組的miR-155 表達(dá)量增加，這與前人研究結(jié)果一致。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 的過表達(dá)可以促進(jìn)足細(xì)胞中炎癥分子的產(chǎn)生，從而加重足細(xì)胞損傷［7］。足細(xì)胞在腎小球濾過和腎功能的維持中起著關(guān)鍵作用，而LN 蛋白尿的主要原因是足細(xì)胞損傷，其中細(xì)胞死亡或脫離導(dǎo)致足細(xì)胞丟失是腎小球疾病進(jìn)展的關(guān)鍵，預(yù)防足細(xì)胞損傷在LN 治療中至關(guān)重要［15，16，24］。此外，足細(xì)胞在LN 中可能通過充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞或通過分泌促炎細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)［25］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在 TGF-β1 干預(yù)的足細(xì)胞損傷模型中，CD2AP 與 podocin、synaptopodin表達(dá)均降低而miR-155 升高，還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-155 可 負(fù) 調(diào) 節(jié) podocin、synaptopodin、CD2AP的表達(dá)，而低表達(dá)miR-155 可使 podocin、synaptopodin、CD2AP 表達(dá)上調(diào)［6，10］?？梢?，過表達(dá)miR-155可促進(jìn)足細(xì)胞損傷，抑制miR-155 表達(dá)可改善足細(xì)胞的損傷，這與前人的研究結(jié)果一致，因此推測miR-155 可通過促進(jìn)足細(xì)胞損傷參與LN 炎癥進(jìn)程。然而，目前miR-155 在LN 的調(diào)控機(jī)制并未完全清楚。

Smad 蛋白家族是近年來通過遺傳篩選方法在無脊椎動物中鑒定出的一種細(xì)胞內(nèi)信號蛋白［26，27］。已經(jīng)表明，Smad 蛋白是TGF-β 信號通路的關(guān)鍵中間體。Smad 蛋白家族是將TGF-β 與其受體結(jié)合產(chǎn)生的信號從細(xì)胞質(zhì)傳遞到細(xì)胞核的中間分子，在信號傳遞和調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用［26］。SMAD2 是SMAD 蛋白家族其中一員，為受體調(diào)節(jié)型 SMAD（R-SMAD），作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能［28］。TGF-β/Smad 信號通路介導(dǎo)了炎癥和腎纖維化，其中TGF-β1 的介導(dǎo)因子包括Smad2 和Smad3，研究發(fā)現(xiàn)敲除Smad2 可顯著減輕腎纖維化［13］。有研 究 報 道，miR-155 可 以 和SMAD2 靶 向 結(jié) 合［11，14］。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-155-5p 與Smad2 的3′ UTR 存在相互補(bǔ)的結(jié)合位點，兩者間可能存在較為可靠的靶向關(guān)系。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示， miR-155-5p 能夠靶向調(diào)控SMAD2 的表達(dá)。

為了明確miR-155-5p 是否通過SMAD2 對LN起調(diào)控作用，本研究對小鼠進(jìn)行腺相關(guān)病毒AAV9轉(zhuǎn)染干預(yù)，分別上調(diào)和下調(diào)miR-155-5p 的表達(dá)，結(jié)果表明miR-155-5p 不僅可與 SMAD2 靶向結(jié)合，還負(fù) 向 調(diào) 控 SMAD2 的 表 達(dá)。 此 外，過 表 達(dá)miR-155-5p 可加重小鼠足細(xì)胞損傷和狼瘡腎炎的炎性反應(yīng)，而下調(diào)miR-155-5p 表達(dá)可改善小鼠足細(xì)胞損傷和炎性反應(yīng)。綜上，下調(diào)miR-155 可通過促進(jìn)SMAD2 來改善小鼠足細(xì)胞損傷和腎臟的炎性反應(yīng)，本研究為探索miR-155 在狼瘡腎炎的作用提供了新思路。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張潔：實驗設(shè)計與操作，論文撰寫；徐璐瑤：數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析；吳昱升、王蓉、楊嵐茵、藍(lán)夢麟、林雨倩、黃艷琴：實驗操作助手；林栩：研究指導(dǎo)，論文修改，經(jīng)費支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。