人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟HIF-1α表達(dá)的影響*

高和平， 米焱， 王彩麗， 吳雅茹， 張丁予， 魏凱悅

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科， 內(nèi)蒙古 包頭 014010）

糖尿病腎病是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，已經(jīng)成為終末期腎功能衰竭的重要原因，嚴(yán)重威脅人們的身體健康[1]。由于糖尿病腎病誘發(fā)終末期腎臟疾病的發(fā)病率高，需要進(jìn)行腎臟替代治療的糖尿病腎病患者數(shù)量急劇增加，造成巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，有包括炎癥因子釋放、氧化應(yīng)激、糖脂代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)異常及遺傳等多因素參與，目前并未完全闡明。近年來(lái)，對(duì)低氧反應(yīng)引起糖尿病腎病患者腎功能損傷防治方法的探索成為了關(guān)注焦點(diǎn)。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）是代謝缺氧的主要介質(zhì)，其異常激活在腎臟疾病的發(fā)病中起重要作用。在缺氧條件下，HIF-1 的降解受到抑制，導(dǎo)致HIF-1α 積累。有研究表明，HIF-1α 在慢性缺氧條件下的積累會(huì)誘發(fā)足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞骨架紊亂、足突消失和裂隙隔膜功能障礙[2]。此外，HIF-1α 也是參與腎臟纖維化的重要因素。HIGGINS 等[3]早在2007年發(fā)現(xiàn)，體外低氧環(huán)境中HIF-1α 基因過(guò)表達(dá)小鼠的腎臟小管上皮細(xì)胞更易發(fā)生細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，體內(nèi)通過(guò)沉默HIF-1α 基因減輕腎纖維化模型小鼠的小管間質(zhì)纖維化；并且，糖尿病腎病患者腎穿刺的腎組織纖維化區(qū)域中HIF-1α 基因高表達(dá)。同樣，HIF-1α 參與慢性腎臟病患者腎小管損傷[4]。近年來(lái)，以低氧誘導(dǎo)為治療靶點(diǎn)開(kāi)展的臨床或基礎(chǔ)研究越來(lái)越多，基因治療或新開(kāi)發(fā)的藥物均有一定的治療效果，但現(xiàn)有的治療藥物和方案均不能有效逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病的低氧誘導(dǎo)損傷。目前，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell, HUMSC）在糖尿病腎病的損傷修復(fù)中發(fā)揮了一定作用，HUMSCs 可促進(jìn)糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化的修復(fù)和延緩炎癥反應(yīng)[5]，但是關(guān)于HUMSCs 影響低氧誘導(dǎo)基因表達(dá)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)復(fù)制糖尿病腎病大鼠模型，移植HUMSCs 到其體內(nèi)，觀察糖尿病腎病模型大鼠的腎功能和病理改變、血清HIF-1α 的變化及腎組織HIF-1α 在腎小球和腎小管中分布和表達(dá)特點(diǎn)，進(jìn)一步探討HUMSCs 對(duì)糖尿病腎病低氧誘導(dǎo)的腎損傷的修復(fù)作用，以及HIF-1α 表達(dá)對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能改變的影響。

1 材料與方法

1.1 HUMSCs的體外培養(yǎng)及鑒定

HUMSCs 原代細(xì)胞購(gòu)自北京清大賽爾有限公司。HUMSCs 原代細(xì)胞在含10%胎牛血清的DF-12培養(yǎng)基、37 ℃和5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度接近80%～90%時(shí)傳代，并按1∶3 傳代接種至細(xì)胞皿中，24 h 后換液，每48 h 更換培養(yǎng)液一次，直到細(xì)胞貼壁，并觀察細(xì)胞形態(tài)。

在HUMSCs 細(xì)胞懸液中加入鼠抗人CD90、CD105、CD44、CD29、CD34 抗體及同型鼠IgG 抗體[貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司]，避光環(huán)境下孵育30 min，隨后加入磷酸鹽緩沖液（PBS）吹打均勻，1 000 r/min 離心4 min，棄去上清液，重復(fù)2 次，再次加入PBS 制成HUMSCs 懸液，留一管做空白對(duì)照，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行HUMSCs 活性和免疫表型檢測(cè)。

1.2 復(fù)制糖尿病腎病大鼠模型

50 只健康清潔級(jí)8 周齡雄性SD 大鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK：（京）2019-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK：（蒙）2020-0003]進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，自由進(jìn)食及飲水，定期更換墊料，環(huán)境溫度恒定于25 ℃，每12 h 晝夜交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。隨機(jī)選取20 只為健康對(duì)照組，其余30 只為模型組進(jìn)行模型復(fù)制。30 只大鼠按35 mg/kg 的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin, STZ），連續(xù)注射3 d。第4 天每只大鼠尾尖采血測(cè)血糖，血糖>16.8 mmol/L 為達(dá)標(biāo)，否則繼續(xù)補(bǔ)打STZ，直至達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。之后繼續(xù)飼養(yǎng)12 周，直至鏡下觀察腎臟組織出現(xiàn)損傷為糖尿病腎病大鼠模型復(fù)制成功。觀察兩組大鼠的血糖和體重變化。

1.3 腎臟組織病理檢測(cè)

第8 周時(shí)，隨機(jī)選取兩組大鼠各3 只進(jìn)行病理檢測(cè)，模型組腎臟病理?yè)p傷不明顯；第12 周時(shí)，隨機(jī)選取兩組大鼠各5 只進(jìn)行病理檢測(cè)，模型組腎臟病理?yè)p傷，證明糖尿病腎病大鼠模型復(fù)制成功。具體操作：去掉右腎包膜后，沿橫軸切開(kāi)，每一半腎臟再沿橫軸切一下，使腎臟薄片變成厚度為原來(lái)的1/2，然后固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋，4 μm 厚切片進(jìn)行PAS 和Masson 染色。

1.4 DiR 染料標(biāo)記HUMSCs 及免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠腎臟組織CD90、CD44蛋白表達(dá)

新鮮配制的近紅外熒光（DiR）染料加入計(jì)數(shù)的HUMSCs 中，37 ℃下避光孵育5 min 后PBS 輕柔清洗細(xì)胞2 次，移植備用，避光保存。第12 周，隨機(jī)選取兩組大鼠各3 只分別尾靜脈注射DiRHUMSCs，代謝12～16 h 后在小動(dòng)物活體光學(xué)3D 成像系統(tǒng)下觀察DiR-HUMSCs 在大鼠體內(nèi)的分布。為進(jìn)一步觀察移植入健康對(duì)照組大鼠和模型組大鼠體內(nèi)DiR-HUMSCs 在大鼠腎臟的定位分布，本研究采用人源性和鼠源性間充質(zhì)干細(xì)胞特異性抗體CD90、CD44 染色大鼠腎組織。采用頸椎脫臼法處死大鼠，迅速剪開(kāi)腹部取出腎臟，去掉腎臟外包膜，沿著橫軸切開(kāi)，在每一半腎臟上再沿著橫軸切一下，使腎臟薄片變成厚度成為原來(lái)的1/2，然后固定于4%的多聚甲醛溶液中，石蠟包埋，4 μm厚切片，依次放入二甲苯Ⅰ（10 min），二甲苯Ⅱ（10 min），無(wú)水乙醇Ⅰ（5 min），無(wú)水乙醇Ⅱ（5 min），95%酒精（3 min），90%酒精（3 min），80%酒精（2 min），70%酒精（2 min），然后蒸餾水浸洗2 min。將脫蠟水化后的組織加適量的修復(fù)液（0.01 mol 枸櫞酸緩沖液，pH 6.0），使用微波爐加熱至沸騰進(jìn)行抗原修復(fù)，10～15 min 后放入冷水中冷卻，PBS 沖洗3 遍。將配制好的3%過(guò)氧化氫滴加于模型組大鼠切片組織上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育15 min。用油性筆在組織周圍畫(huà)圈，然后滴加稀釋好的一抗；在健康對(duì)照組大鼠切片組織上滴加PBS 做陰性對(duì)照。加完一抗后于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。第2 天，加入聚合物輔助劑，室溫或37 ℃孵育20 min。PBS 沖洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG，室溫或37 ℃孵育20 ～30 min。切片滴加新鮮配制的DAB 顯色液，顯微鏡下觀察，呈棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性。蘇木精復(fù)染30 s～1 min。水洗后用1%鹽酸酒精分化，再用自來(lái)水沖洗返藍(lán)。將切片再次自來(lái)水沖洗后依次放入70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫水透明，并風(fēng)干切片。中性樹(shù)膠封蓋玻片和切片。最后，切片在顯微鏡下觀察或者采集圖像。

1.5 HUMSCs移植

以上實(shí)驗(yàn)完成后，模型組大鼠剩余19 只，隨機(jī)選取9 只進(jìn)行HUMSCs 移植（HUMSCs 移植組）。HUMSCs 移植采用尾靜脈注射方式，移植濃度為1×106個(gè)/mL 的HUMSCs 500 μ L 至大鼠體內(nèi)，1 次/周，連續(xù)4 周，共28 d。健康對(duì)照組9 只大鼠和模型組其他10 只大鼠不做任何治療。

為進(jìn)一步觀察HUMSCs 在大鼠腎臟的分布，用10% 水合氯醛（300 mg/kg）麻醉劑注射入HUMSCs 移植組大鼠腹腔，待大鼠徹底麻醉后，打開(kāi)腹腔，快速摘取大鼠腎臟，利用Luminaivis Ⅱ成像儀記錄成像。曝光5 min 后，采用小動(dòng)物活體光學(xué)3D 成像系統(tǒng)Living Image?4.5.2 分析、成像。

1.6 大鼠血糖及腎功能指標(biāo)的檢測(cè)

移植HUMSCs 治療后，每周通過(guò)斷尾尖試紙檢測(cè)3 組大鼠的血糖，連續(xù)檢測(cè)4 周。移植HUMSCs 治療4 周后，采用Chemray 800 全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）檢測(cè)3 組大鼠的血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、血清肌酐（serum creatinine, Scr）、尿白蛋白與肌酐比值（urinary protein-creatinine ratio, UACR）水平；采用BCA 蛋白定量法檢測(cè)3 組大鼠的尿液24 h 尿蛋白定量（24-hour urinary protein quantity, 24 h UPro）水平（試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)：23227）；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)3 組大鼠的尿肌酐（urine creatinine, Ucr）水平（試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)：EIACUN）。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清HIF-1α水平

移植HUMSCs 治療4 周后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)：E-EL-R0513c）檢測(cè)大鼠血清HIF-1α 水平。用蒸餾水按1∶20 稀釋洗滌緩沖液；手工洗板，每孔加滿洗滌液，靜置1 min 后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，反復(fù)洗板5 次；從室溫下平衡20 min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃冰箱；設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔，陰、陽(yáng)對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各50 μL；待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL；隨后陰、陽(yáng)性對(duì)照孔及樣本孔中各加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗原100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，重復(fù)手工洗板5 次；每孔加入底物A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min 內(nèi)，測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處各孔的光密度值。采用Excel 表，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)光密度值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度。

1.8 3 組大鼠腎臟組織病理檢測(cè)及免疫熒光染色檢測(cè)HIF-1α、Aquaporin1、Slc12A3的表達(dá)

移植HUMSCs 治療4 周后，第29 天，采用頸椎脫臼法處死3 組大鼠，迅速剪開(kāi)腹部取出腎臟，去掉腎臟包膜，沿著橫軸切開(kāi)，在每一半腎臟上再沿著橫軸切一下，使腎臟薄片厚度成為原來(lái)的1/2，然后固定于4%的多聚甲醛溶液中，石蠟包埋，4 μm 厚切片。一部分采用PAS 和Masson 染色進(jìn)行腎臟組織病理檢測(cè)，一部分進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)HIF-1α、Aquaporin1、Slc12A3 的表達(dá)：PBS 洗3 次，棄去PBS 后加入0.5% Triton X-100 室溫通透20 min，PBS洗2 次并棄去；加入5% BSA，37 ℃封閉1 h，棄去封閉液；加一抗（HIF-1α、Aquaporin 1、SLC12A3），4 ℃孵育過(guò)夜；PBS 洗2 次后加二抗抗體，37 ℃孵育1 h；PBS 洗2 次后棄去并加入抗熒光淬滅封片液（含DAPI）。熒光顯微鏡下觀察并拍照。用Image J 1.49軟件量化分析熒光圖片，結(jié)果用平均熒光強(qiáng)度相對(duì)值表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用Tukey 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HUMSCs的生化特征和特征性表面標(biāo)志物

原代HUMSCs 培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)，48 ～72 h 傳代1 次，傳至第3 代時(shí)，光鏡下觀察細(xì)胞呈梭狀排列，即HUMSCs 外觀為成纖維細(xì)胞狀（見(jiàn)圖1A）。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)證實(shí)HUMSCs 的干性標(biāo)志物CD29、CD44、CD90、CD105 的陽(yáng)性率分別為99.4%、100%、100%和99.8%，而CD34、CD45、HLA-DR 的陽(yáng)性率分別為1.3%、1.6%和1.0%（見(jiàn)圖1B）。確認(rèn)本實(shí)驗(yàn)中使用的HUMSCs 純度較高，免疫原性較低。

圖1 HUMSCs的特征性表面標(biāo)志物

2.2 健康對(duì)照組與模型組大鼠模型復(fù)制過(guò)程中的一般情況比較

健康對(duì)照組與模型組大鼠第0 天的體重和血糖比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。健康對(duì)照組與模型組大鼠第6 天的體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；第6 天的血糖比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第2、4、6、8、10 和12 周的體重和血糖比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組較健康對(duì)照組體重輕，血糖水平高。見(jiàn)表1 和圖2。

表1 健康對(duì)照組與模型組模型復(fù)制過(guò)程中的體重和血糖比較 （±s）

表1 健康對(duì)照組與模型組模型復(fù)制過(guò)程中的體重和血糖比較 （±s）

組別健康對(duì)照組模型組F 值P 值n 20 30體重/g第0天173.74±8.38 176.92±8.53 0.496 0.495第6天202.91±8.71 208.22±14.24 0.709 0.416第2周257.85±8.05 232.42±17.53 12.150 0.004第4周306.60±25.94 258.97±25.51 11.980 0.005第6周337.14±19.38 278.14±32.54 16.970 0.001第8周356.28±25.81 289.82±29.92 19.790 0.000第10周387.02±28.02 290.88±23.22 48.840 0.000第12周413.75±25.49 288.65±22.95 93.080 0.000

續(xù)表1

表1 健康對(duì)照組與模型組模型復(fù)制過(guò)程中的體重和血糖比較 （±s）

組別健康對(duì)照組模型組F 值P 值血糖/mmol/L第0天5.72±0.41 5.96±0.26 1.200 0.305第6天5.62±0.47 20.92±0.75 1483.460 0.000第2周6.00±0.43 25.32±1.29 994.300 0.000第4周6.16±0.61 26.80±2.39 349.300 0.000第6周5.98±0.31 28.85±2.17 541.780 0.000第8周6.22±0.38 30.02±2.19 568.250 0.000第10周6.38±0.62 31.88±1.11 1989.740 0.000第12周6.68±0.72 32.52±1.53 1161.630 0.000

圖2 健康對(duì)照組與模型組大鼠體重生長(zhǎng)曲線和血糖濃度曲線

第12 周時(shí)，PAS 染色結(jié)果顯示模型組大鼠腎臟組織中腎小球基底膜增厚（紅色箭頭），系膜基質(zhì)增多（黃色箭頭）；Masson 染色結(jié)果顯示膠原纖維蛋白的沉積增加（見(jiàn)圖3）。說(shuō)明糖尿病腎病大鼠模型復(fù)制成功。

圖3 兩組大鼠腎臟組織病理圖

2.3 HUMSCs在大鼠腎臟的分布

DiR 染料標(biāo)記的HUMSCs 經(jīng)尾靜脈注射到健康對(duì)照組和模型組大鼠體內(nèi)后，均可在腹部觀察到DiR 染料的熒光分布。模型組大鼠體內(nèi)熒光主要分布在脾胃與胰腺區(qū)，而健康對(duì)照組大鼠體內(nèi)主要分布在肝臟區(qū)（見(jiàn)圖4）。免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD90 和CD44 蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CD44 蛋白在模型組大鼠腎小球和腎小管區(qū)中均表達(dá)（見(jiàn)圖5，藍(lán)色箭頭），CD90 蛋白主要在腎小球中表達(dá)（見(jiàn)圖5，紅色箭頭），證明HUMSCs 在模型組大鼠腎臟中定植。

圖4 DiR-HUMSCs在大鼠活體內(nèi)的分布熒光顯示圖

圖5 大鼠腎臟組織CD90和CD44蛋白的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×40）

2.4 HUMSCs對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟功能的影響

移植HUMSCs 治療后，HUMSCs 移植組第1 周注射干細(xì)胞后死亡3 只，第2 周注射后死亡1 只，剩余5 只直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。模型組在與HUMSCs 移植組平行時(shí)間的第1 周無(wú)死亡，第2 周死亡2 只，第3 周無(wú)死亡，第4 周死亡3 只，剩余5 只；健康對(duì)照組大鼠對(duì)照實(shí)驗(yàn)后剩余9 只，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠無(wú)死亡。

健康對(duì)照組、模型組、HUMSCs 移植組大鼠移植HUMSCs 治療第1、2、3、4 周的血糖比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，模型組和HUMSCs 移植組血糖高于健康對(duì)照組（P<0.05）；模型組與HUMSCs 移植組血糖比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠移植HUMSCs治療期間的血糖比較 （mmol/L， ±s）

表2 3組大鼠移植HUMSCs治療期間的血糖比較 （mmol/L， ±s）

注 ： ? 與健康對(duì)照組比較，P <0.05。

組別健康對(duì)照組模型組HUMSCs移植組F 值P 值第1周6.76±0.21 33.26±0.08?33.30±0.00?62 795.67 0.000第2周6.66±0.92 31.72±1.40?29.08±2.77?269.78 0.000第3周7.10±0.54 32.06±2.60?33.30±0.00?461.74 0.000第4周7.44±0.27 32.80±1.11?31.60±2.43?423.66 0.000

移植HUMSCs 治療4 周后，健康對(duì)照組、模型組、HUMSCs 移植組大鼠的腎功能指標(biāo)Ucr、Scr、24 h UPro、BUN、UCAR 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與健康對(duì)照組比較，模型組和HUMSCs 移植組大鼠Ucr 水平降低（P<0.05），Scr、24 h UPro、BUN、UCAR 均升高（P<0.05）；與模型組比較，HUMSCs 移植組大鼠Ucr 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Scr、24 h UPro、BUN、UCAR 均降低（P<0.05）（見(jiàn)表3）。相較于模型組，HUMSCs 移植組大鼠的腎臟組織增厚的基底膜被改善，小管空泡變性數(shù)量減少，間質(zhì)纖維化減輕（見(jiàn)圖6）。

表3 3組大鼠移植HUMSCs治療后腎功能指標(biāo)比較 （±s）

表3 3組大鼠移植HUMSCs治療后腎功能指標(biāo)比較 （±s）

注 ： ①與健康對(duì)照組比較，P <0.05；②與模型組比較，P <0.05。

組別健康對(duì)照組模型組HUMSCs移植組F 值P 值n9 5 5 Ucr/（μmol/L）1521.07±320.18 582.00±62.60①908.00±199.42①23.320 0.000 Scr/（μmol/L）78.27±8.43 143.8±27.69①110.39±7.61①②17.960 0.000 24h UPro/（mg/24h）96.47±7.38 267.8±9.39①187.68±23.19①②161.980 0.000 BUN/（mmol/L）5.09±0.30 9.82±0.39①7.34±0.38①②211.680 0.000 UACR/（mg/g）103.62±16.8 522.00±84.97①308.20±72.50①②51.450 0.000

圖6 3組大鼠腎臟組織病理切片

2.5 3組大鼠血清HIF-1α水平比較

移植HUMSCs 治療4 周后，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)健康對(duì)照組、模型組、HUMSCs 移植組大鼠的血清HIF-1α 水平分別為（42.69±2.76）、（62.15±3.00）、（50.40±3.20） ng/L，3 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.470，P=0.000）。模型組大鼠血清HIF-1α 水平較健康對(duì)照組升高（P<0.05），HUMSCs 移植組血清HIF-1α 水平較模型組降低（P<0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7 大鼠血清HIF-1α的水平比較

2.6 3 組小鼠HUMSCs 移植治療后腎臟組織的HIF-1α、Slc12A3、Aquaporin1水平比較

HUMSCs 移植治療后，免疫熒光染色檢測(cè)健康對(duì)照組、模型組、HUMSCs 移植組大鼠腎臟組織的HIF-1α、Slc12A3、Aquaporin1 水平，3 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與健康對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟遠(yuǎn)端小管中HIF-1α 蛋白水平升高（P<0.05）；HUMSCs 移植組的HIF-1α 蛋白水平較模型組降低（P<0.05）。模型組遠(yuǎn)端小管標(biāo)記蛋白Slc12A3 水平低于健康對(duì)照組（P<0.05），HUMSCs 移植組Slc12A3 水平較模型組升高（P<0.05）。HUMSCs 移植組的Aquaporin1 蛋白水平較模型組和健康對(duì)照組均降低（P<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 3組小鼠HUMSCs移植治療后腎臟組織的HIF-1α、Slc12A3、Aquaporin1蛋白水平比較 （±s）

表4 3組小鼠HUMSCs移植治療后腎臟組織的HIF-1α、Slc12A3、Aquaporin1蛋白水平比較 （±s）

注 ： ① 與健康對(duì)照組比較，P <0.05； ②與模型組比較，P <0.05。

組別健康對(duì)照組模型組HUMSCs移植組F 值P 值n9 5 5腎臟HIF-1α 23.39±5.83 277.49±19.97①143.70±24.32①②141.91 0.000近端小管HIF-1α 11.32±2.55 230.04±29.47①102.34±7.51①②116.57 0.000遠(yuǎn)端小管HIF-1α 14.13±3.24 289.18±10.84①119.47±10.05①②755.54 0.000遠(yuǎn)端小管Slc12A3 289.37±10.48 130.15±19.97①173.62±14.57①②84.50 0.000近端小管Aquaporin1 233.87±25.13 250.72±29.69 93.54±5.74①②61.30 0.000

免疫熒光染色顯示，HIF-1α 主要在腎小管中大量表達(dá)，腎小球中微量表達(dá)，說(shuō)明低氧誘導(dǎo)主要發(fā)生在腎小管（見(jiàn)圖8A）。3 組小鼠遠(yuǎn)端小管標(biāo)記蛋白Slc12A3 表達(dá)見(jiàn)圖8B，腎臟遠(yuǎn)端小管發(fā)生低氧誘導(dǎo)反應(yīng)，同時(shí)遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞受損。模型組的HIF-1α 蛋白綠色熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于健康對(duì)照組。同時(shí)模型組與健康對(duì)照組大鼠的HIF-1α 和Aquaporin1 蛋白在近端小管中無(wú)共定位，說(shuō)明HIF-1α 蛋白主要在遠(yuǎn)端小管中表達(dá)和分布。HUMSCs 移植組的HIF-1a 蛋白的綠色熒光信號(hào)明顯減弱，Aquaporin1 蛋白的表達(dá)也顯著降低，這進(jìn)一步說(shuō)明近端小管的損傷并不是由低氧反應(yīng)引起（見(jiàn)圖8C）。

圖8 HUMSCs對(duì)糖尿病腎病大鼠低氧誘導(dǎo)因子表達(dá)變化的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，HUMSCs 明顯改善糖尿病腎病大鼠的生存狀態(tài)，糖尿病腎病大鼠在移植HUMSCs 后腎功能指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)，此外，HUMSCs 顯著延緩了糖尿病腎病大鼠腎臟的病理進(jìn)展，增厚的腎小球基底膜和增生的系膜基質(zhì)在移植HUMSCs 后被改善。更重要的是，HUMSCs 抑制糖尿病腎病大鼠體內(nèi)低氧誘導(dǎo)的損傷，移植后糖尿病腎病大鼠血清HIF-1α 水平明顯降低，特別是在治療后糖尿病腎病大鼠腎臟遠(yuǎn)端小管中HIF-1α 的表達(dá)被顯著抑制，這說(shuō)明HUMSCs 具有調(diào)控糖尿病腎病低氧的作用，且可通過(guò)抑制HIF-1α 的表達(dá)修復(fù)腎小管的損傷。

大量的證據(jù)表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可有效保護(hù)和促修復(fù)糖尿病腎病腎臟組織[6-7]。LI 等[8]探討骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMD-MSCs）對(duì)糖尿病大鼠腎功能的保護(hù)作用，研究顯示，通過(guò)尾靜脈5 次注射BMD-MSCs 到糖尿病腎病大鼠體內(nèi)，血清BUN 和Scr 水平，尿液樣本中的糖尿、微量白蛋白、UACR，腎臟病理學(xué)及動(dòng)物的生存均被顯著改善，但是并未觀察到對(duì)高血糖的顯著影響；BMD-MSCs 移植48 h 后，在腎臟損傷區(qū)域發(fā)現(xiàn)MSCs 的定位。此外，臍帶源間充質(zhì)質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UCMSCs）也被證實(shí)具有延緩STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟疾病進(jìn)展的作用。CHEN 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)糖尿病腎病大鼠每周輸注一次UCMSCs，連續(xù)2 周，大鼠的24 h UPro、UCAR、Scr 和BUN 的增加受到抑制，同時(shí)，UCMSCs 改善了糖尿病腎病大鼠腎臟的病理?yè)p傷，并發(fā)現(xiàn)這種改善作用可能是通過(guò)UCMSCs 抑制腎臟細(xì)胞凋亡，減輕糖尿病腎病大鼠腎細(xì)胞損傷和蛋白尿而實(shí)現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)，HUMSCs 在移植到糖尿病腎病大鼠體內(nèi)24 h 后會(huì)內(nèi)化到腎臟，可顯著降低糖尿病腎病大鼠增加的BUN、Scr、24 h UPro、UACR 水平，明顯地改善腎小球的系膜增生和基底膜增厚，減少小管空泡變性，減輕間質(zhì)纖維化，這表明HUMSCs 有效改善了糖尿病腎病大鼠的腎功能。且在第2 次移植HUMSCs 后，糖尿病腎病大鼠的血糖開(kāi)始下降，這表明HUMSCs 具有調(diào)節(jié)糖尿病腎病大鼠血糖的作用。

缺氧反應(yīng)是腎臟適應(yīng)缺氧和在不同病理?xiàng)l件下生存的機(jī)制。近年來(lái)，人們認(rèn)識(shí)到內(nèi)皮和毛細(xì)血管損傷后可以影響腎組織中供氧與耗氧間的平衡，這在糖尿病腎病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。因此，缺氧被認(rèn)為是糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的重要因素[10]。HIF-1 是代謝缺氧的主要介質(zhì)，其異常激活在腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。在缺氧條件下，HIF-1 的降解受到抑制，導(dǎo)致HIF-α 積累。腎臟組織中，HIF-1 在于大多數(shù)腎細(xì)胞中表達(dá)，大部分表達(dá)在近端小管、遠(yuǎn)端小管、連接小管和集合管的細(xì)胞中，并在缺氧性腎病中發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥、纖維化、細(xì)胞凋亡和糖酵解等多種功能[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者腎穿刺組織中HIF-1表達(dá)紊亂，HIF-1 體系在腎小管間質(zhì)損傷之前被激活，從而提出高血糖-HIF 通路學(xué)說(shuō)[11]。在正?；蛉毖鯒l件下，高血糖可以不同方式激活HIF-1 的表達(dá)，如晚期糖基化終產(chǎn)物的合成、蛋白激酶C 激活、促炎細(xì)胞因子、線粒體活性氧等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠血清HIF-1α 異常升高，其在腎小球和遠(yuǎn)端小管中均表達(dá)增強(qiáng)，并且遠(yuǎn)端小管中HIF-1α 的表達(dá)高于腎小球和近端小管。因此，本研究推測(cè)高糖環(huán)境下，HIF-1α 是引起糖尿病腎病腎小管損傷的重要基因。

已有研究證明，糖尿病腎病缺氧環(huán)境中，HIF-1α 過(guò)度活化促進(jìn)了腎臟間質(zhì)纖維化，與尿蛋白增多、腎功能減退及腎臟病理形態(tài)學(xué)的變化密切相關(guān)，是糖尿病腎病治療的靶蛋白[13]。DEBRA 等[3]研究者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)沉默HIF-1α 基因可減輕腎纖維化小鼠模型中的間質(zhì)纖維化。近年來(lái)研究表明HIF-1 是糖尿病腎病的藥物鈉/葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（Sodium/glucose cotransporter 2, SGLT2）抑制劑的作用靶點(diǎn)[13-15]。SGLT2 抑制劑可降低體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α 蛋白及其靶基因的表達(dá)[13，15]，其機(jī)制是線粒體耗氧量減少。SGLT2 抑制劑治療糖尿病db/db 小鼠可減少HIF-1α 在腎小球中表達(dá)、減輕小管損傷和間質(zhì)纖維化[13]。本研究進(jìn)一步探討了HUMSCs 對(duì)糖尿病腎病大鼠HIF-1α 表達(dá)的影響，結(jié)果表明，HUMSCs 可顯著減少HIF-1α 在糖尿病腎病大鼠腎小球和腎小管中的表達(dá)，特別是遠(yuǎn)端小管細(xì)胞中HIF-1α 的表達(dá)被明顯減弱，同時(shí)標(biāo)記蛋白Slc12A3 蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。有趣的是，HIF-1α 并不會(huì)引起近端腎小管低氧誘導(dǎo)損傷。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力地證明糖尿病腎病腎臟遠(yuǎn)端小管HIF-1α 因子表達(dá)增強(qiáng)可能是誘發(fā)腎臟損傷的重要原因。

綜上所述，本研究表明HUMSCs 可改善糖尿病腎病大鼠缺氧反應(yīng)，其能夠通過(guò)調(diào)控HIF-1α 在腎臟遠(yuǎn)端小管的表達(dá)而減緩腎臟損傷。因此，HIF-1α 基因是HUMSCs 治療糖尿病腎病的重要作用靶點(diǎn)。這可能為糖尿病腎病的治療提供新的見(jiàn)解和思路。