間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體治療器官纖維化的研究進展*

郭佳玲， 李暉， 曾子鍵， 陶雨靜， 董海艦

（成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 中心實驗室，四川 成都 610072）

多種器官可發(fā)生纖維化，器官內(nèi)纖維結(jié)締組織增多，實質(zhì)細(xì)胞減少，持續(xù)進展可致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退，乃至衰竭，嚴(yán)重威脅人類健康和生命[1]。據(jù)統(tǒng)計，重大纖維化相關(guān)疾病的年綜合發(fā)病比例約為0.2/10 萬[2]，造成巨大的臨床和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。迄今為止，僅有吡非尼酮和尼達尼布兩種藥物被批準(zhǔn)用于特發(fā)性肺纖維化，但療效不佳，毒性反應(yīng)大，限制了臨床應(yīng)用[3-4]，因而研發(fā)有效的器官纖維化治療方法具有重要意義。間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosomes, MSC-Exos）是一種新的無細(xì)胞療法，具有調(diào)節(jié)特性，通過生理屏障將功能性“物質(zhì)”運送到靶細(xì)胞，發(fā)揮通信和調(diào)節(jié)活性，還具有體積小、免疫原性低、無致瘤作用、半衰期長、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢，具有良好的應(yīng)用前景，已成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。近年來，MSC-Exos 在治療器官纖維化方面取得了一些進展，本文綜述了MSCExos 治療器官纖維化中可能存在的作用機制。

1 概述

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSC）來源于早期發(fā)育的中胚層，是一種具有較強增殖能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，存在于人體各組織器官中，可以很容易地從骨髓、胎盤、臍帶、羊水、脂肪組織、牙髓、母乳和滑膜等組織來源中分離出來[5]，經(jīng)靜脈注射給藥。其來源多樣，取材方便，具有低免疫原性、多能分化性、旁分泌特性及自動歸巢于損傷區(qū)域，在抗炎及抗纖維化治療中顯示出了良好的應(yīng)用前景，已廣泛用于治療多種組織器官損傷。然而，盡管已經(jīng)進行了約20 年的研究，但只有少數(shù)基于細(xì)胞的療法進入了常規(guī)實踐，其仍存在局限性：靜脈注射干細(xì)胞易在肺部毛細(xì)血管滯留，存在肺栓塞風(fēng)險，須限制使用的細(xì)胞數(shù)量，難以大量歸巢；鑒于干細(xì)胞的分化傾向，其在長期培養(yǎng)過程中很難保持穩(wěn)定的表型[6]；MSCs 移植有腫瘤形成風(fēng)險，細(xì)胞排斥和輸注毒性的風(fēng)險仍存在[7]；需要提高MSCs 的歸巢效率和MSCs 在宿主中的存活率，以確保MSCs 能夠長期有效地在宿主體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)的作用[8]。上述MSCs 的應(yīng)用局限推動了對替代治療策略的探尋，無細(xì)胞治療可能會克服基于細(xì)胞療法相關(guān)的限制。

MSCs 在靜息或活化條件下可分泌具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，包括外泌體、微囊泡和凋亡小體[9]。其中，外泌體是細(xì)胞外囊泡中最重要的成分，直徑為30～150 nm，富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、微RNA（miRNA）和信使RNA（mRNA）等細(xì)胞特異性生物活性分子[8]；MSC-Exos 是天然存在的低毒性分泌囊泡，具有良好的耐受性和歸巢能力，在體內(nèi)容易被膜吸收，通過改變外泌體表面分子可促進細(xì)胞類型的特異性靶向，是作為瞬時修飾靶細(xì)胞中特定過程的理想載體系統(tǒng)[10]。此外，MSC-Exos還參與誘導(dǎo)血管生成、抑制纖維化、增強神經(jīng)元存活和分化、刺激細(xì)胞外基質(zhì)重塑、消除局部炎癥反應(yīng)以及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性[11]。MSC-Exos 具備MSCs 的生物學(xué)潛力，與MSCs 相比，其分泌能力強，更具針對性，具有體積更小、免疫原性更低、無致瘤作用、可以穿過血腦屏障等優(yōu)勢，更好地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗炎和組織修復(fù)功能[10]，具有作為無細(xì)胞治療的潛力。

越來越多的證據(jù)表明，MSC-Exos 作為一種新的無細(xì)胞療法，優(yōu)于相應(yīng)的MSCs，可能成為一種有效的替代方案，探究MSC-Exos 在纖維化疾病中的作用及機制有利于提升臨床疾病的診療水平。

2 MSC-Exos在不同器官纖維化中的作用

纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）蛋白過度沉積，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)扭曲和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)喪失，最終誘發(fā)瘢痕形成的過程[12]，其標(biāo)志包括肌成纖維細(xì)胞和膠原沉積物的存在和持久性[13]，一旦發(fā)生纖維化，多難以完全逆轉(zhuǎn)，臨床治療較為棘手。目前已有研究證實MSC-Exos 治療后的纖維化動物模型中炎癥因子、膠原纖維的表達量顯著降低，纖維化通路相關(guān)分子表達下調(diào)，器官纖維化得到明顯改善[14]。MSC-Exos 在組織修復(fù)中的具體作用機制尚不清楚，可能與抑制甚至逆轉(zhuǎn)纖維化、促進原有細(xì)胞增殖修復(fù)等有關(guān)。

2.1 MSC-Exos在肝纖維化中的作用

肝纖維化是由慢性肝損傷和炎癥反應(yīng)引起肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell, HSC）活化和ECM 過度沉積的病理過程，持續(xù)進展可導(dǎo)致肝硬化、肝癌等嚴(yán)重并發(fā)癥?；罨腍SCs 增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞合成ECM 并釋放大量基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，通過抑制間質(zhì)膠原酶活性來減少ECM 降解，導(dǎo)致ECM 積累[15]。有研究證明MSC-Exos 可以發(fā)揮與親代細(xì)胞類似的治療效果[16]，可抑制HSCs 的活化，抑制膠原蛋白的分泌，減少ECM 的沉積以達到抗纖維化作用。ZHANG 等[17]通過實驗表明，MSC-Exos 能夠內(nèi)化并整合到LX-2 細(xì)胞中，通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路在細(xì)胞周期的G1期使細(xì)胞周期停滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞表型，抑制HSCs 增殖，下調(diào)膠原蛋白I 和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）表達，抑制上皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和降解ECM，進而抑制肝纖維化。AFARIN 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos 通過體外和體內(nèi)介導(dǎo)NADPH 氧化酶（NOX）信號通路，有效地降低了活化HSCs 中的NOX1、NOX2 和NOX4 mRNA 表達，Smad3 蛋白的磷酸化和活性氧產(chǎn)生，抑制活化HSCs 并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，進而發(fā)揮抗纖維化作用。另有研究者發(fā)現(xiàn)，富含MSC-Exos 的microRNA-618通過靶向Smad4 減弱了肝纖維化的進展[19]；富含MSC-Exos 的microRNA-148a 通過Kruppel 樣因子6/STAT3 信號調(diào)節(jié)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞功能，并為肝纖維化提供了潛在的治療靶點[20]。MSC-Exos 已成為天然生物相容性藥物遞送載體；木犀草素（Luteolin,LUT）是一種植物類黃酮，在治療肝纖維化方面很有優(yōu)勢，ASHOUR 等[21]制備了LUT 負(fù)載的外泌體（LUT-Ex），通過實驗證明LUT-Ex 具有很好的抗纖維化活性，同時證實了MSC-Exos 具有抗纖維化、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和再生活性增強藥物作用的效果。綜上所述，MSC-Exos 抗肝纖維化的機制十分復(fù)雜，目前研究仍未能完全明確闡述，仍需要研究者不斷地探索。

2.2 MSC-Exos在腎纖維化中的作用

腎纖維化是多種致病因素刺激，其固有細(xì)胞受損，發(fā)展到后期出現(xiàn)大量膠原沉積和積聚，造成腎實質(zhì)逐漸硬化，形成瘢痕，直至腎臟完全喪失臟器功能。據(jù)估計，慢性腎臟?。╟hronic kidney disease, CKD）影響全球8%～16%的人口，被認(rèn)為是第16 大死因[22]。腎纖維化是CKD 常見的進行性和不可逆的病理特征和最終表現(xiàn)，其形態(tài)特征包括腎小球硬化、腎小管萎縮、間質(zhì)性慢性炎癥和纖維化，以及血管稀疏[23]，目前尚無有效的腎纖維化治療藥物。

MSC-Exos 因其抗凋亡、抗炎和促血管生成作用而成為有希望治療腎纖維化的新策略。miRNA 在腎臟發(fā)育和腎功能的維持中起著重要作用，是纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中細(xì)胞生物學(xué)功能的主要調(diào)節(jié)因子[24]。MSC-Exos 可通過microRNA-21a-5p 介導(dǎo)糖酵解限速酶肌肉磷酸果糖激酶（muscle phosphofructose kinase, PFKM），靶向減弱腎小管上皮細(xì)胞的糖酵解來改善腎纖維化[25]。解整合素金屬蛋白酶19（a disintegrin metalloproteinase 19, ADAM19）高表達與腎小球纖維化和炎癥有關(guān)，其在轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）誘導(dǎo)的腎細(xì)胞中表達增加，并促進腎臟腎小管EMT；富含MSC-Exos 的microRNA-335-5p 通過降低ADAM19 蛋白水平來改善TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞的EMT 和炎癥，增強抗炎細(xì)胞因子表達，進而改善腎纖維化[26]。也有研究證明，MSC-Exos 治療對腎纖維化的緩解是由microRNA-122a 介導(dǎo)的；microRNA-122a 緩解腎小管上皮細(xì)胞纖維化的策略調(diào)節(jié)了自噬和mTOR 相關(guān)的信號通路，通過自噬信號通路和自噬流減輕HK-2 中TGF-β 引起的纖維化[27]。

近年來進行的實驗研究表明，以MSC-Exos 為基礎(chǔ)的治療對腎臟損傷修復(fù)及功能恢復(fù)具有一定效果，甚至可逆轉(zhuǎn)纖維化進程，為腎纖維化的治療提供了新的選擇。

2.3 MSC-Exos在肺纖維化中的作用

肺纖維化是多種原因?qū)е碌囊猿衫w維細(xì)胞增殖及大量ECM 沉積、肺組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的間質(zhì)性肺疾病的終末期肺臟改變[28]。肺纖維化是大多數(shù)慢性呼吸系統(tǒng)疾病的主要臨床結(jié)局，如塵肺和特發(fā)性肺纖維化，其疾病譜范圍廣，病死率高，至今仍缺乏有效的治療方法[2，29]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos 可修復(fù)不可再生的組織或器官，其治療肺纖維化疾病的潛能引起研究者的廣泛關(guān)注。放射誘發(fā)的肺纖維化是胸部放療的常見并發(fā)癥，體外和體內(nèi)輻射使上皮極性喪失，上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin 表達上調(diào)，干擾受體細(xì)胞中的基因表達， 誘導(dǎo)EMT 和肺損傷， 富含MSC-Exos 的microRNA-466f-3p 通過抑制Akt/GSK3β 通路可逆轉(zhuǎn)上述改變，發(fā)揮抗纖維化作用[30-31]。此外，MSCExos 通過抑制TGF-β1/Smad2/3 信號通路，抑制肺上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，緩解博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[32]。還有研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos 體內(nèi)移植減少膠原蛋白積累，降低促纖維化因子TGF-β1的水平，抑制了肺纖維化組織中Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的表達，抑制EMT 的進展，有效緩解了二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化[33]。

由此可見，MSC-Exos 可能是治療肺纖維化較理想的方法，但將其應(yīng)用于臨床前還需通過大量實驗進行驗證。

2.4 MSC-Exos在心肌纖維化中的作用

心肌纖維化是一個持續(xù)進展且不可逆的病理過程，不同心臟病病因均可發(fā)生。心肌纖維化特征是心臟成纖維細(xì)胞過度增殖和ECM 蛋白沉積，引起進行性心臟舒縮功能障礙，最終導(dǎo)致慢性心力衰竭、心律失常及心臟驟停等心血管事件[34]。

目前已有諸多研究表明，MSC-Exos 可通過內(nèi)部的miRNA 將信息傳遞至靶細(xì)胞參與并調(diào)節(jié)心肌纖維化的病理形成過程。有研究者對富含MSC-Exos的miRNA 進行了網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果表明MSC-Exos 中含量較高的microRNA-1246、microRNA-23a-3p 和microRNA-451a 能明顯抑制人心肌成纖維細(xì)胞膠原的生成[35]。ZHENG 等[36]研究發(fā)現(xiàn)通過靶向血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶16（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 16,ADAMTS16）來上調(diào)富含MSC-Exos 的microRNA-29b-3p，可改善心肌血管生成和心室重塑，減少心肌纖維化，增加毛細(xì)血管密度和血管內(nèi)皮生長因子表達，并抑制心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。另外，WANG 等[37]通過復(fù)制大鼠心臟缺血再灌注損傷模型和體外心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/再灌注模型，發(fā)現(xiàn)MSC-Exos 通過調(diào)節(jié)血小板衍生的生長因子受體β，增強應(yīng)激條件下的微血管再生，抑制纖維化的發(fā)展，改善心功能。MSC-Exos 通過增強心肌血管生成和免疫調(diào)節(jié)以及控制心肌細(xì)胞凋亡和纖維化，已被證明并被廣泛認(rèn)可其在心臟修復(fù)和心臟再生中的作用。

2.5 MSC-Exos在子宮腔粘連中的作用

子宮腔粘連（intrauterine adhesion, IUA）是子宮內(nèi)膜嚴(yán)重?fù)p傷修復(fù)引起膠原纖維沉積在宮腔內(nèi)造成內(nèi)膜纖維化，導(dǎo)致的宮腔部分或全部粘連閉塞，其本質(zhì)是一種纖維化疾病[38]。IUA 可引起月經(jīng)異常、周期性腹痛、不孕及反復(fù)流產(chǎn)等一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅女性的生殖健康，已成為臨床上待解決的難題，目前無論是藥物治療還是手術(shù)治療均未取得較為滿意的效果[38-39]。近年研究發(fā)現(xiàn)，MSCExos 在促進損傷子宮內(nèi)膜再生修復(fù)和纖維化中發(fā)揮重要作用。LI 等[40]采用不同濃度的TGF-β1構(gòu)建IUA 細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)富含MSC-Exos 的microRNA-145-5p 改善了子宮內(nèi)膜纖維化。TAN 等[41]的研究表明，MSC-Exos 可促進體外和體內(nèi)子宮內(nèi)膜修復(fù)，microRNA-29 的過表達可降低TGF-β 的表達，從而抑制Smad3 的活性，實現(xiàn)抗纖維化。YAO 等[42]復(fù)制IUA 兔模型，發(fā)現(xiàn)MSC-Exos 可通過抑制TGF-β1/Smad 信號通路減少內(nèi)膜纖維化區(qū)域，增加子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量，增加維持子宮內(nèi)膜細(xì)胞完整性的細(xì)胞骨架蛋白CK-19 的表達，而下調(diào)Vimentin 的表達，證實了MSC-Exos 通過逆轉(zhuǎn)EMT 對損傷內(nèi)膜的修復(fù)作用。

2.6 MSC-Exos在其他器官纖維化中的作用

幾乎所有組織器官損傷修復(fù)的終末階段均可引起纖維化。無細(xì)胞治療作為一種新型療法，在多種損傷性疾病中均有報道。有研究發(fā)現(xiàn)富含MSC-Exos 的microRNA-214 可通過阻斷IL-33/ST2 軸來緩解皮膚纖維化[43]。MSC-Exos 可有效減輕高糖腹透液誘導(dǎo)的小鼠腹膜纖維化，為抑制腹膜纖維化提供了新方法[44]。

3 總結(jié)與展望

纖維化疾病的高病死率和復(fù)雜的發(fā)病機制使臨床治療面臨巨大挑戰(zhàn)。MSC-Exos 在治療纖維化疾病方面具有強大的應(yīng)用前景，近年來應(yīng)用MSCExos 治療各種纖維化的實驗研究不斷涌現(xiàn)，并已取得一定的進展，但在臨床應(yīng)用方面仍有很多困難。如何精準(zhǔn)誘導(dǎo)MSCs 產(chǎn)生特定類型的外泌體治療特定的疾病是亟待解決的問題；需進一步確定MSCExos 內(nèi)容物的表征、疾病治療的特定分子機制及運輸方式，以確保其安全性和有效性；目前外泌體的應(yīng)用大多數(shù)局限于體外實驗，臨床應(yīng)用較少，缺乏豐富的臨床實驗數(shù)據(jù)，其在人體細(xì)胞中的作用機制及具體療效還需繼續(xù)深入探索。相信隨著MSC-Exos 相關(guān)研究的不斷深入，上述這些問題會逐步解決，MSC-Exos 將展現(xiàn)出良好的治療前景。