基于網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接探究金線蓮降血脂的活性成分及作用機制

趙宏鶴，范方宇

（西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明 650224）

“網(wǎng)絡(luò)靶標相關(guān)”的假說是由清華大學李梢教授于1999 年在中國科學技術(shù)協(xié)會第一次會議上提出。2007 年9 月，李梢教授發(fā)表了內(nèi)容為“網(wǎng)絡(luò)靶標研究框架：基于生物網(wǎng)絡(luò)的方劑研究框架”的論文[1]。這一框架將傳統(tǒng)的中藥研究與現(xiàn)代的生物網(wǎng)絡(luò)技術(shù)結(jié)合，從整體上探討中藥有效成分、作用機制和藥物之間的聯(lián)系，更好地闡述中藥作用機理。同年10 月，英國藥理學專家A L Hopkins[2]也提出了“網(wǎng)絡(luò)藥理學”這一概念，其對網(wǎng)絡(luò)藥理學的基本觀點是：疾病是一種長期的、動態(tài)的、多靶點失衡所致的疾病，而單靶點藥物只能調(diào)節(jié)單一疾病靶點，不能使疾病的多靶點被有效治療，難以達到治療效果，還可能造成不良毒副作用。相對中藥而言，其理念為：多藥物成分、多靶點、多通路，協(xié)作治療，達到整體治療目的。李梢教授指出，網(wǎng)絡(luò)藥理學是一門將多個生物學領(lǐng)域相結(jié)合，從系統(tǒng)、生物網(wǎng)絡(luò)等層面，對藥物與疾病之間的分子關(guān)系進行分析，并揭示其作用機理，是一門全局性藥理學研究的新分支。

金線蓮是我國閩浙臺特有的民族中草藥，具有清熱解毒、涼血、潤肺止咳等功效，民間常稱為“金草”“神草”“藥王”等。金線蓮含有豐富的黃酮[3]、多糖[4]、甾體[5]等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮的有效成分[6-7]可治療肝炎、糖尿病、腫瘤等，同時具有降血壓、降血脂的功效[8]，這也是金線蓮作為藥食兩用食材的原因。閩浙臺普遍認為金線蓮具有預防、治療“三高”作用，是一種以調(diào)節(jié)機體為主的藥膳食材。金線蓮常與土鴨、家兔、鴿子、排骨等一起煲湯，具有清涼、明目、保肝、涼血、滋腎益氣等功效，深受人們喜愛。文獻查閱發(fā)現(xiàn)，金線蓮含有的多糖、金線蓮苷、黃酮等物質(zhì)具有降血脂作用。近年來，以金線蓮作為原料的研究較多，但從網(wǎng)絡(luò)藥理學角度針對金線蓮降血脂的研究未見報道。試驗利用金線蓮已知文獻綜述，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學理論，構(gòu)建成分-靶點-疾病的網(wǎng)絡(luò)作用，分析金線蓮降血脂機制，為開發(fā)金線蓮降血脂的保健食品[9]提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 金線蓮化學成分篩選

通過國內(nèi)期刊、碩博論文數(shù)據(jù)庫及PubMed、SCI 等數(shù)據(jù)庫，以金線蓮化學成分為研究對象，篩選金線蓮化學成分。采用Pubchem 數(shù)據(jù)平臺及化源網(wǎng)，并結(jié)合ChemDraw Professional 16.0 軟件，對其化學結(jié)構(gòu)進行繪制。將繪制好的分子結(jié)構(gòu)輸入Swiss ADME 數(shù)據(jù)庫進行藥物動力學篩選。檢測報告中，以藥代動力學（Pharmacokinetics）、類藥性作為篩選條件（Druglikeness） [選擇“腸胃道吸收為High”及5 個類藥性（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中2 個為“Yes”的化學物質(zhì)] ，滿足以上條件的化學物質(zhì)作為金線蓮降血脂的有效化學成分。

1.2 金線蓮化學成分篩選及靶點預測

金線蓮化學成分進行分析，并對其作用靶點進行預測。使用SwissTargetPrediction 平臺對金線蓮化學成分進行靶點預測。參數(shù)設(shè)置：選擇人類（Homo sapiens），并輸入SDF 格式的化學結(jié)構(gòu)，點擊運行，獲取相應(yīng)的化學成分靶點。

1.3 高血脂靶點的篩選

GeneCards 是一個包含了人類所有已被標注和預測的基因數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫整合了全球150 多家與人類基因數(shù)據(jù)相關(guān)的網(wǎng)站，是一個綜合性基因數(shù)據(jù)庫。使用“Hyperlipidemia”作為關(guān)鍵詞搜索數(shù)據(jù)庫，以相關(guān)分數(shù)（Relevance score） ≥2 為篩選標準，并將其歸類為高脂血癥的靶點。

1.4 金線蓮-高血脂交集靶點基因的獲取

利用Venny2.1.0 在線網(wǎng)站，輸入金線蓮成分靶點及高血脂靶點，繪制金線蓮與高血脂交集靶點韋恩圖。交集靶點即為金線蓮治療高血脂的潛在靶點。

1.5 金線蓮-活性成分-靶點-高血脂網(wǎng)絡(luò)圖的繪制

將金線蓮化學成分、成分對應(yīng)靶點與高血脂交集的靶點匯總后導入Cytoscape3.8.0 軟件，依據(jù)這些靶點之間的對應(yīng)關(guān)系，建立“金線蓮-化學成分-交集靶點-高血脂”相互關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)圖。通過對網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的調(diào)整，使藥物-靶點-疾病三者之間的內(nèi)在聯(lián)系更為明確。

1.6 構(gòu)建蛋白-疾?。≒PI） 網(wǎng)絡(luò)圖

將金線蓮化學成分與高脂血交集靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)定為人類進行分析。預測結(jié)果去除非關(guān)聯(lián)點，并將相互作用系數(shù)設(shè)置為0.4，獲得關(guān)鍵靶點的互作圖。互作圖再導入Cytoscape3.8.0軟件，以介數(shù)中心度數(shù)值進行繪制交集靶點互作（PPI） 網(wǎng)絡(luò)圖。互作網(wǎng)絡(luò)圖可以直觀地了解生物體蛋白工作原理、疾病變化及蛋白間的功能關(guān)系，對于分析靶點相互作用具有重要的意義。

1.7 生物通路與功能富集

選定“Homo sapiens”，將交集靶點（成分與疾病交集靶點） 導入DAVID 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)GO 功能富集的BP（生物學過程）、CC（細胞組成）、MF（分子功能） 及KEGG-pathway 通路數(shù)據(jù)，繪制柱狀圖。在KEGG-PATHWAY 數(shù)據(jù)庫輸入KEGG-pathway 數(shù)據(jù)中相關(guān)性較高的通路名稱，并使用KEGG Mapper工具繪制通路圖并分析。

1.8 分子與疾病靶點對接

選取與蛋白質(zhì)相互作用的前6 個靶點，分別輸入PDB 數(shù)據(jù)庫，下載相應(yīng)3D 結(jié)構(gòu)圖。篩選出6 個核心靶點對應(yīng)的金線蓮化學成分，將化學成分輸入Pubchem 數(shù)據(jù)庫，下載2D 分子結(jié)構(gòu)文件。將分子結(jié)構(gòu)圖錄入MOE 建立小分子數(shù)據(jù)庫，再將處理好的靶點蛋白與小分子數(shù)據(jù)庫進行分子對接，對接次數(shù)設(shè)定為30 次，分子結(jié)構(gòu)設(shè)定為10，其余參數(shù)默認。

2 結(jié)果與分析

2.1 金線蓮化學成分篩選

通過檢索有關(guān)文獻，以“金線蓮的化學成分”為關(guān)鍵字，獲得128 種有效成分[10-12]。將128 個化學成分分別輸入到Swiss ADME 數(shù)據(jù)庫，以胃腸道吸收較好、類藥性較好為篩選條件，最終選取了62 個化合物，并將其作為此次研究金線蓮的化學成分。其中金線蓮苷腸胃道吸收較低，但多篇文獻報道其具有降血脂[13]功效，因此也被列為金線蓮活性成分。

金線蓮活性成分篩選見表1。

表1 金線蓮活性成分篩選

2.2 金線蓮活性成分作用靶點的篩選結(jié)果

將篩選后的62 個金線蓮化學成分[14-16]輸入到Swiss 靶點預測數(shù)據(jù)庫，預測靶點。從數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果共得到2 469 個靶點，去重后獲得645 個活性成分作用靶點。

2.3 高血脂靶點篩選結(jié)果

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫搜索“Hyperlipidemia”關(guān)鍵字，設(shè)定相關(guān)分數(shù)（Relevance score≥2），去除重復數(shù)據(jù)，獲得了315 個與高脂血有關(guān)的靶點。

2.4 金線蓮化學成分靶點- 高血脂交集靶點篩選結(jié)果

采用在線韋恩圖軟件，對金線蓮和高血脂交集靶點韋恩圖進行分析，結(jié)果顯示高血脂有315 個靶點，約占靶點總數(shù)的34.3%；金線蓮有645 個靶點，約占靶點總數(shù)的70.3%；其中金線蓮- 高血脂交集靶點共有43 個，占全部作用靶標的4.7%。由圖1 可知，金線蓮化學成分[17-19]的作用靶點和高血脂交集靶點韋恩圖表。

圖1 金線蓮化學成分靶點-高血脂靶點Venn 圖

金線蓮化學成分靶點- 高血脂靶點Venn 圖見圖1。

2.5 金線蓮-活性成分-交集靶點-高血脂網(wǎng)絡(luò)圖

將金線蓮與高血脂[20]共同交集的43 個靶點及對應(yīng)的62 種活性成分導入Cytoscape 軟件，并依據(jù)介數(shù)中心度數(shù)值大小繪制網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），得到107 個節(jié)點，322 個連線。圖2 中JLX 表示金線蓮，圓形代表金線蓮62 種活性成分，平行四邊形代表交集靶點，GXZ 代表高血脂；CF58 亞麻酸、CF1 正十六烷酸、CF15 棕櫚酸、CF4 2- 十二烷酮、CF40 3-O-β-D-葡萄糖基-（1-壬烯-7-醇） 為主要金線蓮治療高血脂主要化學成分。根據(jù)介數(shù)中心性大小，列出前6 個化學成分。

圖2 金線蓮-成分-靶點-高血脂網(wǎng)絡(luò)圖

金線蓮- 成分- 靶點- 高血脂網(wǎng)絡(luò)圖見圖2，金線蓮化學成分介數(shù)中心性信息見表2。

表2 金線蓮化學成分介數(shù)中心性信息

2.6 蛋白質(zhì)-疾病相互作用（PPI） 和主要作用靶點的繪制

金線蓮-高血脂交集靶點PPI 互作圖（a） 及網(wǎng)絡(luò)圖（b） 見圖3，交集靶點介數(shù)中心性信息見表3。

表3 交集靶點介數(shù)中心性信息

圖3 金線蓮-高血脂交集靶點PPI 互作圖（a） 及網(wǎng)絡(luò)圖（b）

利用String 數(shù)據(jù)庫，制作交集靶點（PPI） 互作圖。下載cys 格式的互作圖，并導入Cytoscape 3.8.0軟件，按照介數(shù)中心性數(shù)值大小，繪制出靶點蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)圖中，圖形越大，表示該靶點越重要；由圖3（b） 可知，從蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系圖中，選擇了6 個介數(shù)中心度較高的交叉靶點。

2.7 KEGG Pathway 和GO 富集分析

金線蓮-高血脂交集靶點GO 分析見圖4，金線蓮-高血脂交集靶點KEGG 通路富集分析見圖5。

圖4 金線蓮-高血脂交集靶點GO 分析

圖5 金線蓮-高血脂交集靶點KEGG 通路富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫，導入金線蓮化學成分與高血脂交集靶點。選取OFFICIAL-GENE-SYMBOL，物種選取人類，對其進行分析。分別下載GO-BP、GO-CC、GO-MF、KEGG-PATHWAY 數(shù)據(jù)，分別得到BP 通路147 條，17 個CC 過程，45 個MF 功能。將GO-BP、GO-CC、GO-MF 數(shù)據(jù)按降序排列，取前10 條數(shù)據(jù)進行匯總。將匯總后的數(shù)據(jù)輸入微生信，進行GO 分析圖繪制（圖4）。從GO 分析圖可以看出，GO 的含量與BP、CC 和MF 均相關(guān)，包括RNA聚合酶II 啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、胞外空間，胞外基質(zhì)，胞外的外來體，鋅離子結(jié)合等都有一定的相關(guān)性。將KEGG_PATHWAY 數(shù)據(jù)按照降序排列，取前10 條數(shù)據(jù)，通過微生信作圖工具繪制KEGG pathway氣泡圖（圖5）。圖5 中氣泡顏色越深，-LogQ 值越大，相關(guān)性越大。金線蓮主要通過Metabolic pathways、Pathways in cancer、Chemical carcinogenesis -receptor activation、PPAR signaling pathway、Transcriptional misregulation in cancer 發(fā)揮降血脂作用。通過KEGG 通路分析，富集在Metabolic pathways 的靶點有15 個，是所有通路中最多的。Metabolic pathways 代謝通路是金線蓮化學成分主要發(fā)揮降血脂的通路，而癌癥通路僅次于Metabolic pathways 代謝通路，也是金線蓮主要發(fā)揮降血脂作用的通路，從信號圖中可看出金線蓮化學成分是通過作用于多通路、多靶點發(fā)揮降血脂的作用。

2.8 金線蓮-高血脂分子對接

交集靶點與金線蓮分子對接信息見表4，金線蓮小分子與靶點蛋白分子對接信息見表5，金線蓮與高血脂靶點最低結(jié)合能熱圖見圖6，分子對接圖見圖7。

表4 交集靶點與金線蓮分子對接信息

表5 金線蓮小分子與靶點蛋白分子對接信息

圖6 金線蓮與高血脂靶點最低結(jié)合能熱圖

圖7 分子對接圖

從交集靶點PPI 互作圖中，依據(jù)介數(shù)中心性（Betweenness Centrality） 降序排列，取靠前的6 個靶點作分子對接[21-22]。根據(jù)篩選好的6 個靶點蛋白，篩選對應(yīng)金線蓮化學成分，作為對接小分子。分別將靶點蛋白、小分子做前處理，對接靶點蛋白與對接小分子信息，利用MOE 軟件，進行分子對接。將金線蓮6 個化學成分與疾病6 個靶點蛋白進行分子對接，分子對接結(jié)果全部小于0 kcal/mol，可見金線蓮的化學小分子配體能與受體蛋白可自發(fā)結(jié)合。取對接最低結(jié)合能作聚類熱圖，熱圖中橫坐標代表靶點蛋白，縱坐標代表金線蓮活性成分。圖6 中黃色顏色越深，代表分子和靶點結(jié)合越好，其中CY3A4 與鄰苯二甲酸二丁脂（Dibutyl Phthalate）、PPARA 鄰苯二甲酸二丁脂（Dibutyl Phthalate）、PPARG 蛋白與亞麻酸（Linoelaidic acid）、VEGFA 與亞麻酸（Linoelaidic acid） 最低結(jié)合能平均值均在- 6 kcal/mol 以下，說明此4 種化學成分均能與高血脂靶點自由結(jié)合，說明配體和受體具有較強的結(jié)合活性[23]。選取熱圖中4 個與目標物結(jié)合得最好的小分子，進行分子對接，將其與目標物結(jié)合的區(qū)域進行放大，可以直觀地展示目標物與目標物的結(jié)合。由圖7 可知，在鄰苯二甲酸二丁脂中，CY3A4 和ARG130 和SER134之間形成了2 個氫鍵，它們之間的距離為3.19，3.93；在PPARA 鄰苯二甲酸二丁脂中，TYR334 和VAL332 2 個氨基酸殘基之間距離為3.05、3.69，且存在著2 個氫鍵；PPARG 蛋白與亞麻酸上的GLY284 和LYS265 之間形成了2 個氫鍵，它們之間的距離為3.28、3.26；VEGFA 與亞麻酸中THR31 和LEU32 之間存在2 個氫鍵，兩者之間的距離為2.92，2.94。

3 結(jié)論

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮降血脂是通過多種活性成分作用于高血脂多種靶點，如正十六烷酸（正十六烷酸與棕櫚酸互為同分異構(gòu)體）、2-十二烷酮、亞麻酸、槲皮素-3,4'-二甲醚、山奈酚、槲皮素等化學成分?；诘鞍紫嗷プ饔镁W(wǎng)絡(luò)圖及GO、KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，金線蓮降脂網(wǎng)絡(luò)中含有多個與高脂血疾病相關(guān)的靶蛋白，包括IL-6、PPARA、PPARG、MMP9 等，多個靶蛋白協(xié)同調(diào)控高脂血癥。PPARA是調(diào)控脂肪細胞分化和脂代謝的關(guān)鍵因子。激活的PPARA 能夠與RXR 和DNA 上的過氧化酶體反應(yīng)元件（PPRE） 相結(jié)合，從而促使細胞內(nèi)與脂肪酸氧化有關(guān)的各種酶活化，促進細胞內(nèi)脂肪酸異化，還對血清質(zhì)有影響的載脂蛋白的表達有一定的調(diào)節(jié)效果[24]。MMP-9 主要是通過對基底膜進行降解，從而對單核細胞入侵起到了有利的作用，加快了氧化修改低密度脂蛋白的滲透速度，對平滑肌細胞的遷移和增殖起到了促進作用[25]。在KEGG-PATHWAY 通路中，有代謝通路（Metabolic pathways）、癌癥通路（Pathways in cancer）、化學致癌- 受體激活通路（Chemical carcinogenesis - receptor activation）、過氧化物酶體增殖物激活受體α 通路（PPAR signaling pathway） 等信號通路，經(jīng)查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，這些靶點和通路均與高血脂相關(guān)。

通過挖掘數(shù)據(jù)與分子對接，初步證實了金線蓮降血脂是利用多成分、多靶點、多通路協(xié)同治療治療高血脂，從而論證了民間食用金線蓮來降低高血脂的經(jīng)驗。為深入研究其降血脂試驗研究提供了基礎(chǔ)。同時，也為金線蓮制作保健產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。