餅干中紫草紅色素檢測方法的建立

王 彬，何 沖，安 瑜，邊文文

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710048）

食品添加劑因具備增加食品風(fēng)味、改善食品品質(zhì)、提高食品營養(yǎng)價值等功能，被譽(yù)為現(xiàn)代食品工業(yè)魔法師[1]。紫草紅是從紫草科紫草屬植物根中提取的紅色素，主要成分是紫草素及其衍生物，為暗紫紅色結(jié)晶品、紫紅色黏稠膏狀或紫紅色粉末，溶于有機(jī)溶劑和油脂，不溶于水，但溶于堿液[2-4]；可作為食品添加劑應(yīng)用于飲料、餅干、果酒、肉制品、點(diǎn)心等食品中，天然健康，還具有清熱消毒、消炎抗菌、防病抗癌等藥理性功效[5-7]。紫草紅色素因具性能穩(wěn)定、色澤艷麗、吸附著色力強(qiáng)、持久力久等優(yōu)點(diǎn)，在食品、保健品、藥品、生物制品等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

在GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[8]中明確規(guī)定果汁飲料類、糕點(diǎn)、餅干、雪糕、果酒等食品中可添加的紫草紅色素最大限量為0.1 g/kg。目前，食品色素產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，但關(guān)于檢測紫草紅色素的方法大多用于藥品，而食品中檢測方法尚未完善，檢測方法滯后給食品安全帶來了巨大的隱患[9]。梁占麗等人[10]建立了軌道阱高分辨質(zhì)譜法，對飲料中紫草紅進(jìn)行了分析測定，檢出限為200～500 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～9.2%，可以簡單快速地對飲料中紫草紅色素進(jìn)行快速篩選和分析。以食品作為基質(zhì)的檢測方法未見到相關(guān)的報道。通過對前處理方法進(jìn)行摸索，優(yōu)化色譜條件，建立高效液相色譜法測定餅干中紫草紅色素的含量，為食品中紫草紅色素安全監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫草紅標(biāo)準(zhǔn)品（20 mg），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司提供；石油醚（分析純），天津市富宇精細(xì)化工公司提供；無水乙醇（色譜純），美國Honeywell 公司提供；甲酸（優(yōu)級純），天津市科密歐化學(xué)試劑公司提供；纖麩木糖醇消化餅干，東莞思朗食品有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters E2695 型高效液相色譜儀，美國Waters公司產(chǎn)品；ST-16R 型高速離心機(jī)，美國ThermoFisher 公司產(chǎn)品；ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 色譜柱，美國Agilent 公司產(chǎn)品；AUTO 型全自動氮吹儀，廈門瑞科儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-250DE 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；XS-20S 型電子分析天平，瑞士METTLER-TOLEDO 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫草紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取0.01 g 紫草紅標(biāo)品（精確至0.000 1 g），置于100 mL 容量瓶，用甲醇溶解，并定容，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 紫草紅標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃條件下避光保存。

1.3.2 樣品前處理

稱取餅干5 g（精確至0.01 g），加入20 mL 甲醇提取液，旋渦混勻，超聲20 min，經(jīng)過5 g 無水硫酸鈉脫水后，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心5 min，取上清于40 ℃條件下氮吹，甲醇- 0.1%甲酸= 85∶15（V/V） 流動相定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm PTFE 濾頭過濾待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A 為甲醇，B 為0.1%甲酸（V/V=85∶15），流速1.0 mL/min，檢測波長516 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，采用等梯度洗脫。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

依次取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋為0.5，1，2，5，10，50，100 μg/mL 7 個質(zhì)量濃度梯度，以紫草紅質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)繪制紫草紅標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 樣品加標(biāo)回收率測定

按上述前處理條件進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，在餅干中分別添加質(zhì)量濃度為10.0，50.0，200.0 mg/kg 的紫草紅標(biāo)準(zhǔn)溶液，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

食品中的紫草紅常與其他人工合成色素混合使用，因此要去除人工合成色素的干擾。食用色素易溶于水，因此為了避免提取到食用色素，選用有機(jī)試劑進(jìn)行提取。由圖1 可知，以1.0 mg/kg 紫草紅加標(biāo)時，石油醚和無水乙醇作為提取劑時回收率較低，僅為31.25%和67.45%，乙腈回收率為81.21%，甲醇作為提取溶劑，相較乙腈提取回收率要更高，為100.32%。可見甲醇提取效果較好，雖帶有一定的雜質(zhì)，但對紫草紅出峰情況影響不大，幾乎不受人工合成色素的影響；且基線噪音小，峰形較美觀，因此選擇甲醇作為提取劑。

圖1 不同提取劑對應(yīng)的紫草紅色素色譜圖

不同提取劑對應(yīng)的紫草紅色素色譜圖見圖1，以餅干為基質(zhì)4 種提取溶劑回收率比較見表1。

表1 以餅干為基質(zhì)4 種提取溶劑回收率比較

由表1 可知，以甲醇提取劑時，噪音干擾小，基線平穩(wěn)且回收率高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在合適范圍內(nèi)。

2.2 提取方式選擇

餅干通常含有巧克力、可可脂、乳化劑等物質(zhì)，制樣后添加物多的餅干不容易分散，直接浸提法提取效果不佳。試驗(yàn)對比超聲不同時間的提取效果，選取時間分別為10，20，30，40 min。超聲提取達(dá)到20 min 后，延長時間不能提高回收率。因此，確定了直接超聲浸提為最佳紫草紅色素提取方法，提取溫度要嚴(yán)格控制在60 ℃以下，溫度過高容易導(dǎo)致紫草素分解。

2.3 流動相及比例的選擇

紫草素一般選擇甲醇-緩沖鹽體系和乙腈-甲酸作為流動相[11-12]，緩沖鹽使用不當(dāng)時易析出，因此試驗(yàn)測試乙腈-水和甲醇-水作為流動相時，紫草素峰形容易出現(xiàn)拖尾，峰較寬。流動相pH 值降低后，紫草素峰拖尾得到改善。

不同流動相下紫草紅標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（50 μg/mL）見圖2。

圖2 不同流動相下紫草紅標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（50 μg/mL）

由圖2 可知，紫草紅色素以乙腈-水為流動相時出峰時間較早且有些許拖尾現(xiàn)象，甲醇-0.1%甲酸為流動相時，峰不拖尾且對稱；使用甲醇-0.1%甲酸時，優(yōu)化比例后，紫草紅出峰時間為5.273 min，峰形較好，可縮短分析時間，同時甲醇提取出來的雜質(zhì)出峰較早，可與紫草紅實(shí)現(xiàn)分離。

2.4 檢測波長的選擇

紫草紅色素光譜圖見圖3。

圖3 紫草紅色素光譜圖

由圖3 可知，紫草素在217 nm 和516 nm 均有吸收，波長217 nm 下容易受其他雜質(zhì)干擾，而516 nm下色譜圖基線平整，干擾雜質(zhì)相對較少且目標(biāo)峰附近無雜質(zhì)干擾峰，可較好地簡化凈化過程，因此確定檢測波長為516 nm。

2.5 方法線性范圍及檢出限

紫草紅色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 紫草紅色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖4 可知，質(zhì)量濃度0.5～100.0 μg/mL 時表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。通過樣品基線噪音在紫草紅標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的響應(yīng)信號進(jìn)行比較，以3 倍信噪比（S/N=3） 所對應(yīng)樣品中的紫草紅質(zhì)量濃度為檢出限進(jìn)行計算，得到方法檢出限為0.2 mg/kg。

紫草紅色素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表2。

表2 紫草紅色素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.6 回收率和精密度試驗(yàn)

加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果表明，紫草紅色素的平均回收率為88.1%～96.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為2.7%～5.8%，表明該方法精確度高、準(zhǔn)確性好，能夠較準(zhǔn)確地對餅干中紫草紅色素進(jìn)行定量測定。

餅干中紫草紅色素回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6） 見表3。

表3 餅干中紫草紅色素回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.7 實(shí)際餅干樣品檢測

采用該檢測方法對市面上可能含有紫草紅色素餅干進(jìn)行檢測，其中夾心餅干測出紫草紅，威化餅干未檢測出紫草紅色素。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～3.2%，結(jié)果表明該方法的精密度與重復(fù)性較好。

不同餅干樣品中紫草紅色素的測定結(jié)果（n=6）見表4。

表4 不同餅干樣品中紫草紅色素的測定結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

基于紫草紅色素檢測方法的滯后，建立了一種測定餅干中紫草紅色素含量的高效液相色譜法。餅干樣品經(jīng)甲醇超聲提取后定容上機(jī)，采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱，以甲醇- 0.1%甲酸=85∶15（V/V） 為流動相，檢測波長為516 nm，柱溫為35 ℃，采用等度洗脫。結(jié)果表明，在該色譜條件下紫草紅色素質(zhì)量濃度為0.5～100.0 μg/mL 時呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999 9，方法檢出限為0.2 mg/kg，平均加標(biāo)回收率為88.1%～96.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6） 為2.7%～5.8%。表明該方法精確度高、準(zhǔn)確性好，能夠較準(zhǔn)確地對餅干中紫草紅色素進(jìn)行定量測定。用此方法對5 種市銷售餅干中紫草紅色素含量進(jìn)行測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～3.2%，證實(shí)其具有前處理方法操作簡單、分析時間短、加標(biāo)回收率高、檢測波長高、抗干擾能力強(qiáng)和檢出限低的特點(diǎn)，可適用于餅干中的紫草紅色素含量的檢測。此方法的建立填補(bǔ)了紫草紅在餅干食品中檢測方法的空缺，為食品中紫草紅色素的定量檢測提供了理論參考。