火麻仁黃嘌呤氧化酶抑制肽的酶解制備工藝研究

魏連會(huì)，董 艷，姬妍茹，石 杰，李國(guó)巍，張正海，楊慶麗，高 媛，潘 靜

（黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319）

火麻（Cannabis sativaL.） 俗稱為大麻，在我國(guó)又稱為火麻，是大麻科大麻屬一年生草本植物，火麻屬低毒大麻，因其四氫大麻酚含量低于0.3%，已不具備毒品利用價(jià)值。火麻全身都是寶，火麻的皮、桿、根、籽和葉都可開(kāi)發(fā)利用，產(chǎn)業(yè)涉及紡織、食品、制藥、能源和建材等領(lǐng)域[1]。目前，許多發(fā)達(dá)國(guó)家都在大力開(kāi)發(fā)利用火麻，尤其是以火麻籽功能食品的研究備受關(guān)注?；鹇樽训V物質(zhì)含量豐富，含有蛋白質(zhì)（20%～25%）、膳食纖維（10%～15%）、脂類（25%～35%）、碳水化合物（20%～30%），是自古以來(lái)人們重要的營(yíng)養(yǎng)源[2]?；鹇樽训鞍鬃鳛橐环N新型蛋白資源，具有很高的開(kāi)發(fā)研究?jī)r(jià)值。

人體嘌呤代謝異常會(huì)引發(fā)高尿酸血癥，最后發(fā)展為痛風(fēng)，痛風(fēng)患者的數(shù)量逐年上升[3-4]。同時(shí)體內(nèi)嘌呤代謝紊亂會(huì)使尿酸水平升高，引發(fā)高尿酸血癥[5-7]?，F(xiàn)有的化學(xué)藥物對(duì)身體造成了極大傷害，尋求食源性黃嘌呤氧化酶抑制劑具有重要意義[8-10]。火麻仁蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，開(kāi)發(fā)利用率低，因此對(duì)其進(jìn)行火麻仁降尿酸肽研究探討，有利于增加產(chǎn)品的附加值，帶動(dòng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展及其種植結(jié)構(gòu)調(diào)整[11-12]。因此，以火麻蛋白為原料，研究火麻仁黃嘌呤氧化酶抑制肽的酶解制備工藝，以延長(zhǎng)火麻產(chǎn)業(yè)鏈條。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

火麻仁蛋白粉，黑龍江省科學(xué)院大慶分院自制；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，夏盛酶生物技術(shù)有限公司提供；黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶，Sigma 公司提供。

1.2 儀器設(shè)備

FA1104N 型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-1 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司產(chǎn)品；DHG-9070A 型鼓風(fēng)干燥箱，上海飛躍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；MS300 型加熱式恒溫電動(dòng)磁力攪拌器，上海般特公司產(chǎn)品；BCD-215TBDZ 型冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；Epoch 型酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 火麻仁蛋白酶解產(chǎn)物的制備

基本工藝：火麻仁蛋白粉→加水調(diào)整料液比→調(diào)pH 值和溫度→加蛋白酶酶解→滅酶（5 min） →離心（轉(zhuǎn)速5 000 r/min，時(shí)間20 min） →上清液→真空低溫冷凍干燥→火麻仁肽粉。

1.3.2 酶解用蛋白酶的篩選

料液比1∶5，酶解時(shí)間4 h，設(shè)定酶最適pH值，溫度（T），對(duì)火麻仁蛋白進(jìn)行酶解。設(shè)定酶用量5 000 U/g，確定火麻蛋白XOD 抑制肽最佳酶種類。

蛋白酶最適條件見(jiàn)表1。

表1 蛋白酶最適條件

1.3.3 單因素試驗(yàn)

為了能得到火麻仁肽以XOD 抑制活性指標(biāo)，進(jìn)一步考查酶解溫度（T）、蛋白酶用量和酶解時(shí)間這3 個(gè)因素的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定酶解制備火麻仁蛋白XOD 抑制肽的最佳工藝。

酶解條件因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 酶解條件因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.5 水解度測(cè)定

采用福林酚比色法，按照公式計(jì)算：

式中：N0——不同濃度火麻蛋白溶液氮含量，mg/mL；

N1——蛋白酶水解前可溶性氮含量，mg/mL；

N2——蛋白酶水解后可溶性氮含量，mg/mL。

1.3.6 火麻仁肽XOD 抑制活性測(cè)定

參考鄒琳等人[13]的文獻(xiàn)進(jìn)行火麻仁黃嘌呤氧化酶抑制肽活性測(cè)定研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解用蛋白酶的篩選結(jié)果

采用不同蛋白酶酶解火麻仁蛋白，中性蛋白酶的XOD 抑制活性、水解度均最高，分別達(dá)到73.34%和19.5%。試驗(yàn)的中性蛋白酶主要含有內(nèi)肽酶活性，含有少量的氨肽酶和羧肽酶活性。內(nèi)肽酶的作用點(diǎn)位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，遠(yuǎn)離其N(xiāo) 端和C 端。這些酶共同作用于蛋白質(zhì)分子中的肽鍵，將蛋白質(zhì)水解成低聚肽及氨基酸。因此，選用中性蛋白酶進(jìn)行下一步優(yōu)化制備工藝。

不同蛋白酶對(duì)XOD 抑制活性和水解度的影響見(jiàn)表3。

表3 不同蛋白酶對(duì)XOD 抑制活性和水解度的影響

2.2 中性蛋白酶的單因素試驗(yàn)結(jié)果

研究中性蛋白酶用量、酶解溫度和酶解時(shí)間3 個(gè)因素對(duì)酶解制備火麻仁蛋白XOD 抑制肽的影響。

2.2.1 中性蛋白酶用量對(duì)酶解效果的影響

在料液比為1∶5，中性蛋白酶pH 值為6.5，酶解溫度50 ℃條件下酶解火麻仁蛋白4.0 h，考查中性蛋白酶用量分別為3 000，4 000，5 000，6 000，7 000 U/g 時(shí)對(duì)XOD 抑制活性。

中性蛋白酶用量對(duì)酶解效果的影響見(jiàn)圖1。

圖1 中性蛋白酶用量對(duì)酶解效果的影響

由圖1 可知，XOD 抑制活性隨著酶用量的增加而上升。當(dāng)酶用量超過(guò)5 000 U/g 后，XOD 抑制活性變化不大，考慮節(jié)約成本，酶用量以5 000 U/g為最佳。

2.2.2 中性蛋白酶酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

在料液比為1∶5，中性蛋白酶pH 值為6.5，蛋白酶用量5 000 U/g 條件下酶解火麻仁蛋白4.0 h，考查中性蛋白酶酶解溫度分別為40，45，50，55，60 ℃時(shí)對(duì)XOD 抑制活性。

中性蛋白酶酶解溫度對(duì)酶解效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 中性蛋白酶酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

由圖2 可知，XOD 抑制活性隨著酶解溫度的遞增也逐漸增大。當(dāng)酶解溫度大于50 ℃時(shí)，隨著酶解溫度的增加，XOD 抑制活性趨于平穩(wěn)。因此，中性蛋白酶最佳酶解溫度為50 ℃。

2.2.3 中性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

在料液比為1∶5，中性蛋白酶pH 值6.5，蛋白酶用量5 000 U/g，酶解溫度50 ℃條件下酶解火麻仁蛋白，考查中性蛋白酶酶解時(shí)間分別為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 h 時(shí)對(duì)XOD 抑制活性。

中性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響見(jiàn)圖3。

圖3 中性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

由圖3 可知，XOD 抑制活性隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)也逐漸增大。當(dāng)酶解時(shí)間大于4.0 h 時(shí)，XOD 抑制活性趨于平穩(wěn)。因此，中性蛋白酶最佳酶解時(shí)間為4.0 h。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，料液比1∶5，pH 值6.5對(duì)中性蛋白酶酶解火麻蛋白的各影響因子進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定火麻仁的最佳條件。

酶解條件正交試驗(yàn)見(jiàn)表4。

表4 酶解條件正交試驗(yàn)

由表4 可知，料水比1∶5，pH 值6.5 條件下最優(yōu)水平組合為A3B2C3，即酶用量6 000 U/g，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間5 h，酶解XOD 抑制活性最佳，通過(guò)極差分析，各因素影響的主次順序?yàn)锳＞C＞B。通過(guò)對(duì)最優(yōu)組合A3B2C3驗(yàn)證試驗(yàn)，在酶用量為6 000 U/g，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間5 h，蛋白酶酶解火麻蛋白的XOD 抑制活性為78.98%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)確定了火麻仁蛋白黃嘌呤氧化酶抑制肽的最佳工藝為采用中性蛋白酶，在pH 值6.5，料液比1∶5，酶用量6 000 U/g，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間5 h 條件下，XOD 抑制活性為78.98%，火麻仁蛋白是制備黃嘌呤氧化酶抑制肽的優(yōu)質(zhì)來(lái)源，火麻仁黃嘌呤氧化酶抑制肽的制備，增加了火麻蛋白的附加值，延伸了火麻產(chǎn)業(yè)鏈條。