貓肥厚型心肌病生物標志物的應用現(xiàn)狀和研究進展

丁婉霜,劉萌萌

(海南大學熱帶農(nóng)林學院,海南 ?？?570100)

肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是貓最常見的心臟病,在貓中總體發(fā)病率為10%～15%[1],在老年貓中尤其高發(fā),發(fā)病率可高達近30%[2]。貓HCM的典型特征為左心室壁異常增厚。根據(jù)病因不同,該病可分為原發(fā)性和繼發(fā)性。在原發(fā)性HCM中,部分貓品種有一定的易感性或遺傳傾向,如緬因貓、布偶貓、英國短貓和斯芬克斯等[3]。繼發(fā)性HCM患貓的臨床表現(xiàn)多樣,有些貓發(fā)病急,迅速出現(xiàn)充血性心力衰竭(Congestive heart failure,CHF)和動脈血栓栓塞(Arterial thromboembolism,ATE)的癥狀,極少數(shù)貓可能突然死亡;還有些貓可能終生處于亞臨床期,不表現(xiàn)任何臨床癥狀[4]。目前,臨床上對貓HCM的診斷主要依賴于超聲心動圖技術,結合心電圖、X線技術和基因篩查等方法輔助診斷。傳統(tǒng)的HCM診斷方法對動物醫(yī)院設備條件、臨床獸醫(yī)從業(yè)者的技術水平和經(jīng)驗均有較高要求,且這些方法往往昂貴且耗時,無法反映心臟微觀層面的病理變化。

生物標志物是指可以標記器官、組織、細胞和亞細胞結構或功能改變的、具有一定特異性的生化指標,其釋放與組織/器官的損傷程度通常成正比,因此可用于疾病診斷、分期或者用來評價治療方案的安全性和有效性。近年來,生物標志物在人類和伴侶動物心血管疾病中的應用廣受關注。與傳統(tǒng)的心臟病診斷技術相比,生物標志物檢查操作簡便、快速、侵入性低,還可以提供疾病分子層面的病理信息。目前,心血管生物標志物的臨床應用包括以下5個方面：(1)亞臨床疾病檢測;(2)急慢性綜合征診斷;(3)疾病風險分級;(4)監(jiān)測疾病進展或評估治療效果;(5)輔助選擇合適的治療方案[5]。目前,臨床上針對貓HCM的診斷已有商品化心臟生物標志物,比如利鈉肽和肌鈣蛋白。此外,近期研究表明,與心肌重塑、炎癥、凝血和腎臟功能相關的生物標志物在貓HCM或心肌病的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮一定的作用,本文將對上述標志物展開探討。

1 利鈉肽

利鈉肽是一組在心房和心室中合成的結構相關的肽,主要包括心房利鈉肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)、腦利鈉肽(Brain natriuretic peptide,BNP)和C型利鈉肽等,目前臨床常用ANP和BNP。利鈉肽基因編碼mRNA組成具有長肽序列的利鈉肽前體,成熟的活性ANP和BNP從前體分子上被切割下來,并與它們各自的非活性形式氨基末端心房利鈉肽前體(N-terminal pro-atrial natriuretic peptide,NT-proANP)和氨基末端腦利鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)一起釋放到循環(huán)中。當心壁受牽拉時,心臟分泌ANP和BNP進入循環(huán),以對抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS),并抑制心肌細胞肥大和凋亡,刺激血管再生,抑制器官纖維化[6]。因此,ANP和BNP的升高被認為是對心房和心室機械應力的保護性激素反應,目的是維持心肌健康和心血管穩(wěn)態(tài)。目前,利鈉肽被用于多種心血管問題的診斷和預后,如高血壓、充血性心力衰竭和急性冠狀動脈綜合征[7],其中BNP被認為是反映心功能障礙最敏感、最特異的利鈉肽[7-8]。由于非活性NT-proBNP比具有活性的BNP更穩(wěn)定,因此臨床上通常檢測NT-proBNP。目前,市面上已有多種檢測貓NT-proBNP的商品化試劑盒用于診斷貓的心臟病,尤其是鑒別患有嚴重心臟病的病例。例如,Connolly等[9]發(fā)現(xiàn)健康貓血清中NT-proBNP濃度明顯低于患有心臟病且伴有CHF的貓,且以NT-proBNP濃度是否高于49 fmol/mL來區(qū)分健康貓和患有心臟病且伴有CHF的貓時,其診斷敏感性和特異性分別為100%和89.3%。NT-proBNP濃度的檢測方法包括定量和半定量,二者均可用于區(qū)分健康貓和患有心臟疾病的貓。半定量床旁護理檢測(Point-of-care,POC)可對NT-proBNP濃度進行快速評估,10 min內(nèi)獲取結果,因此適用于急診。NT-proBNP半定量檢測法適用于鑒別患貓是由心臟原因或非心臟原因所致的呼吸窘迫,而對于POC檢測出異常的NT-proBNP濃度,建議進行心臟超聲以確定該結果的意義[10]。相較于半定量法,定量檢測法對于診斷患有嚴重HCM的貓通常具有更高的敏感性和特異性[11]。傳統(tǒng)的定量檢測法一般需要送樣到第三方實驗室進行檢測,24～48 h后才能得到檢測結果,因此限制了其在緊急情況下的應用。最近幾年,國內(nèi)外生物公司陸續(xù)開發(fā)了便攜式貓NT-proBNP定量檢測儀,可用于一線臨床,但這些檢測儀的診斷表現(xiàn)有待于進一步確定。由于定量檢測法可以給出明確的BNP濃度,因此適用于個體病例的追蹤研究,可為臨床治療效果和預后提供更多信息。在HCM患貓生物標志物濃度是否能預測心臟死亡的研究中,單因素分析結果顯示,血漿NT-proBNP界限值>250 pmoL/L與HCM患貓預后較差有顯著相關性[12]。在筆者先前開展的一項針對12只CHF患貓的追蹤研究中,血清NT-proBNP濃度在初診和復查時始終高于檢測上限(1 500 pmol/L)的患貓,1年內(nèi)死亡率為100%,支持了NT-proBNP的持續(xù)顯著升高提示預后不良,而研究中80%存活患貓的NT-proBNP濃度均穩(wěn)定或下降[13]。

除了血漿樣本或血清樣本,患貓的其他體液也可以用于NT-proBNP濃度的檢測,如胸腔積液[14-15];Humm等[15]的研究表明,將胸腔積液中的NT-proBNP臨界值設定為322.3 pmol/mL,可以區(qū)分產(chǎn)生胸腔積液的原因是心源性還是非心源性,且胸腔積液中檢測NT-proBNP的精準度與血漿NT-proBNP的觀察值相似,該研究還對尿液樣本中的NT-proBNP進行了檢測,但效果并不理想。

NT-proBNP的檢測在臨床中發(fā)揮重要作用,但也存在一定的局限性,例如,該檢測無法診斷早期HCM。Han?s等[16]的研究表明,POC法和定量檢測法都可以鑒別出患有左心房擴張的HCM貓,但均無法識別無左心房擴張的HCM貓。Hsu等[11]在對40只緬因或緬因混合品種貓的研究中發(fā)現(xiàn),血漿NT-proBNP可鑒別重度HCM,但并不適用于區(qū)分輕度到中度的HCM。同時,需要注意樣本來源不同貓的NT-proBNP濃度變化,如胸腔積液樣本和血漿樣本中NT-proBNP濃度之間存在差異,這就需要對不同的樣本來源制定不同的臨界值?？焖贆z測試劑盒對檢測血漿樣本表現(xiàn)出良好的特異性和敏感性,但對胸腔積液樣本的特異性較差[17]。貓血液NT-proBNP濃度也存在一定的日間波動[18],除此之外,還受激素和腎臟功能等因素的影響[19],因此判讀時應當考慮上述因素。在實際檢測中,可能還會受到激素的影響,干擾真實結果的判定,一項對貓短期服用潑尼松龍的臨床學調(diào)查結果顯示,在所有受試貓中4只接受潑尼松龍治療的患貓和1只對照組貓在不同時間的NT-proBNP濃度均超過了疑似心臟病的臨界值(>100pmoL/L),但其超聲心動圖均無異常[20],提示NT-proBNP濃度在評估糖皮質(zhì)激素引起貓血流動力學變化時可能診斷價值有限,而且在臨床上正常貓亦可能出現(xiàn)假陽性結果。

2 心肌肌鈣蛋白

心肌肌鈣蛋白由附著在肌動蛋白絲上的3個亞基(T、C 和 I)組成,在心肌細胞收縮中起調(diào)節(jié)作用。心肌細胞損傷可導致肌鈣蛋白釋放,因此肌鈣蛋白循環(huán)濃度增加可提示心臟損傷。目前,在HCM患貓臨床研究中最敏感和最常用的肌鈣蛋白是肌鈣蛋白I(Cardiac troponin I,cTnI)[21-22],其次是肌鈣蛋白T(Cardiac troponin T,cTnT)。

已有研究證實,HCM患貓循環(huán)血液中cTnI濃度顯著升高[23]。如果血漿cTnI濃度<0.163 ng/mL,可排除HCM;血漿cTnI濃度>0.234 ng/mL,則可識別貓患有重度HCM[21],因此cTnI濃度的升高程度可反映HCM的嚴重程度。另一項研究表明,將血清cTnI濃度參考值設為0.06 ng/mL,可較有效地區(qū)分健康貓和HCM患貓[22]。為提高cTnI檢測的靈敏度,人用測量cTnI濃度的超靈敏測量方法(Siemens ADVIA Centaur CP TnI-Ultra)被嘗試用于貓,與普通測量方法相比,這種超靈敏測量方法可將cTnI濃度檢測的下限降至0.006 ng/mL[21-22]。心肌肌鈣蛋白對于區(qū)分心臟病與其他原因引起的呼吸困難具有一定的作用,但診斷表現(xiàn)遜于NT-proBNP[12,24]。此外,心肌肌鈣蛋白也可用于評估心肌肥厚患貓的預后,Langhorn等[25]對原發(fā)性HCM患貓的研究表明,cTnI和cTnT濃度升高均與HCM患貓死亡顯著相關,其中cTnI對心肌損傷的敏感性更高,而cTnT似乎更能指示預后,即cTnT濃度的增加通常提示更嚴重的心肌細胞破壞。另一項研究表明,HCM患貓循環(huán)血液中cTnI濃度與左心室壁厚度和左心房大小成正相關,伴左心房擴張的HCM患貓的cTnI濃度顯著升高,提示循環(huán)cTnI濃度可反映心臟重塑程度[26]。

與利鈉肽相似,肌鈣蛋白也可在非心臟疾病中增加,包括甲狀腺功能亢進、貧血、高血壓和腎臟疾病等[19]。研究表明,慢性腎病患貓和HCM患貓血清cTnI濃度均可見升高,而且腎病組與HCM組之間沒有顯著差異;在人類醫(yī)學研究中已證實,cTnI是受腎臟疾病影響最大的生物標志物[27]。此外,品種和性別也會影響健康貓血清cTnI的濃度[26],在對肌鈣蛋白檢測結果做出解釋時,還應考慮這些可能影響其濃度變化的因素。

3 心肌重塑標志物

嚴重的心臟疾病往往伴隨心肌成分和結構的改變,這一過程也被稱為心臟重塑。心肌細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)重塑是心臟重塑的重要部分。在生理情況下,ECM是維持心臟結構和生理穩(wěn)態(tài)的重要成分,主要由基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)及其組織抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)調(diào)節(jié),實現(xiàn)動態(tài)平衡。心肌ECM過度重塑時,MMPs和TIMPs調(diào)節(jié)失常[28]。因此,循環(huán)MMPs和TIMPs濃度可以為發(fā)生心臟重塑的臨床病例提供更多信息,例如,TIMP-1水平升高提示高血壓繼發(fā)左心肥厚的患者出現(xiàn)CHF;發(fā)生心肌梗死后,MMP-8和MMP-9水平急劇上升等[29-30]。

臨床上,與雌性貓相比,HCM更高發(fā)于雄性貓。研究發(fā)現(xiàn),雄性HCM患貓心肌中MMP-2、MMP-3和TIMP-3的mRNA轉錄水平顯著高于雌性貓,MMP-2和MMP-3通過誘導血管內(nèi)皮生長因子表達,促進血管生成和ECM代謝,而TIMP-3降低血管內(nèi)皮生長因子表達并抑制血管生成,該結果提示上述酶可能參與調(diào)節(jié)HCM患貓的心肌ECM重塑及該過程中出現(xiàn)的血管病變[31]。在重度心臟纖維化患貓中,MMP-2的表達增加,TIMP-3在輕度纖維化區(qū)域的成纖維細胞中表達增加[32]。MMPs不僅負責ECM的降解,還調(diào)節(jié)膠原蛋白的合成,引起心肌纖維化,因此,MMPs和TIMPs的上調(diào)可提示貓心臟纖維化和ECM重塑的發(fā)生。一項評價CHF患貓血清蛋白質(zhì)組學的研究支持了上述結果,在心肌病晚期患貓的血清中,ECM重塑標志物顯著上升[33];在貓HCM晚期,這些重塑標志物,特別是MMP-2、MMP-3和TIMP-3的區(qū)域性激活,參與心肌重塑,導致HCM患貓的心臟出現(xiàn)心壁變薄、收縮功能下降等結構和功能的變化[31]。而且這些重塑標志物在HCM和心房血栓患貓中,表現(xiàn)不同的轉錄水平,提示這些重塑標志物可能有助于區(qū)別不同的心臟疾病。

半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)由多種免疫細胞表達,包括肥大細胞、組織細胞和巨噬細胞,在多種生理功能中發(fā)揮重要作用。由于Gal-3在細胞表面表達,且較易由損傷細胞和炎癥細胞分泌,因此認為Gal-3為心臟纖維化的循環(huán)生物標志物。在人類中,Gal-3升高可預測心肌纖維化和不良心臟事件[34]。最近的一項研究表明,Gal-3具有成為貓HCM新型生物標志物的潛能[35]。與健康貓相比,HCM患貓血清Gal-3升高,并且與左心房大小、左心室大小和心肌細胞外容積(一種無創(chuàng)測量心肌纖維化的指標)呈正相關。但有必要進一步研究和評估Gal-3與心肌纖維化和預后之間的關系。

4 炎癥標志物

急性期反應是機體對潛在致病刺激的反應,其始于炎性細胞釋放白細胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)。這些細胞因子可誘導發(fā)熱、白細胞增多和急性期反應蛋白(Acute phase protein,APP)的釋放[36]。C反應蛋白(C-reactive-protein,CRP)、血清淀粉樣蛋白A(Serum amyloid A protein,SAA)、α1-抗胰蛋白酶(Alpha-1 antitrypsin,A1A)等APP在炎癥刺激后可成倍增長。心臟病晚期心衰時,常伴隨炎癥相關因子的過度表達。1956年,研究人員首次在心衰患者血液中發(fā)現(xiàn)CRP升高[37]。此后,大量研究調(diào)查了心衰與炎癥標志物之間的相關性,強調(diào)了CRP、TNF-α和IL-6在慢性心衰中的預測價值[38]。且已有研究指出,貓的HCM與炎癥有關[31]。例如,HCM患貓存在炎癥細胞浸潤心肌(尤其是巨噬細胞募集和增殖),炎性細胞因子IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α的轉錄水平上升以及APP在HCM患貓外周血中顯著升高等等。

SAA是貓主要的APP。先前研究表明,患病住院的貓血清中SAA濃度增加[39];在HCM患貓中,相對于心肌局灶性或多灶性肥厚的病例,左心泛發(fā)性肥厚患貓的SAA濃度升高,鑒于該值升高后仍在實驗室檢測參考范圍內(nèi),提示此時可能僅存在局部炎癥,組織學證據(jù)支持亞臨床HCM患貓的心肌中有輕度炎性細胞浸潤[23]。另一項研究發(fā)現(xiàn),貓原發(fā)性心肌病晚期發(fā)生CHF時,SAA濃度也有所增加;與健康貓相比,心衰患貓血清中富亮氨酸α2糖蛋白1(Leucine-rich-alpha-2-glycoprotein 1,LRG1)和銅藍蛋白也有所增加[13]。LRG1的生物學功能目前尚不完全明確,有研究表示,其與炎癥有關,并可能通過與轉化生長因子β相互作用而在心肌纖維化中發(fā)揮作用[40]。銅藍蛋白則是一種在急性期反應中增加的銅氧化酶,具有抗氧化功能。SAA、LRG1和銅藍蛋白水平與原發(fā)性心肌病患貓的左心房大小和NT-proBNP濃度呈正相關,提示這3種APP具有成為貓心肌病分期和預后標志物的潛能。

研究還發(fā)現(xiàn)了一種稱為α-1酸性糖蛋白(Alpha-1-acid glycoprotein,AGP)的APP,在人群中已證實AGP是心血管疾病患者死亡率和全因死亡的獨立預測因子[41]。在原發(fā)性心肌病和CHF患貓血清中,AGP水平與cTnI和NT-proBNP濃度呈顯著正相關,多因素分析顯示,AGP是貓CHF死亡風險的獨立預測因子[33]。上述標志物的研究尚在起步階段,未來需要進一步研究闡明它們與貓心肌病之間的關系。

CHF中最常研究的APP是CRP。在人和犬的研究中均顯示,CRP在CHF中增加,并與疾病嚴重程度相關[42]。雖然CRP在貓中不是主要的APP,但在貓原發(fā)性心肌病引起的CHF和心腎綜合征的研究中,CRP與腎臟功能標志物呈顯著正相關[13]。

A1A通過抑制中性粒細胞彈性蛋白酶和纖溶酶原激活劑在肺臟組織中發(fā)揮抗炎作用,以避免過度的組織損傷。CHF患貓血清的A1A顯著升高,這與先前人類醫(yī)學中心衰患者的循環(huán)A1A增加的研究結果一致[43]。而且,這種蛋白酶抑制劑與心肌病患貓的血清NT-proBNP濃度呈密切正相關,被認為是與氧化應激相關的生物標志物。在Michaek等[44]對HCM患貓抗氧化防御和氧化應激標志物的研究中,HCM患貓血清中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性不同,過氧化氫酶活性僅在疾病無癥狀階段顯著降低;在獸醫(yī)學中,鮮有過氧化氫酶活性在心血管疾病中的研究;在人類醫(yī)學中,隨著病變血管數(shù)量的增加,過氧化氫酶活性逐漸降低[45],這也提示抗氧化物可能為區(qū)分潛在HCM患貓?zhí)峁┯幸嫘畔ⅰ?/p>

5 凝血標志物

血栓形成和ATE是貓心肌病的常見并發(fā)癥,尤其與左心房擴大相關?；罨哪獦酥疚锟捎糜谠u價HCM患貓的凝血狀態(tài)與左心房大小的關系[46]。通過檢測活化的凝血標志物和纖溶標志物可評估受試者高凝狀態(tài),并為HCM患貓指示ATE風險,但目前的研究結果所提供的信息還非常有限。Bédard等[46]通過評價健康貓和無癥狀HCM患貓血漿凝血標志物,比較了二者的凝血酶-抗凝血酶復合物、D-二聚體和纖維蛋白降解產(chǎn)物(Fibrin degradation product,FDP)的血漿濃度,結果顯示,凝血酶-抗凝血酶復合物是其中最敏感的標志物,其次是D-二聚體和FDP。凝血酶-抗凝血酶復合物反映體內(nèi)凝血酶的生成,被認為是凝血激活的敏感標志物。研究表明,在特發(fā)性心肌病患者中,左心房直徑與凝血酶-抗凝血酶復合物濃度顯著相關[47]。D-二聚體由凝血酶介導的纖維蛋白原裂解和纖溶酶介導的纖維蛋白凝塊裂解產(chǎn)生,在人類中被認為是形成血栓的敏感標志物。雖然在一些早期研究中,只有少數(shù)ATE患貓的血漿D-二聚體濃度較高,但是隨著近年來相關研究的增多和深入,發(fā)現(xiàn)50%的ATE患貓中D-二聚體濃度升高[48]。一項評價HCM患貓血漿D-二聚體濃度的研究也表明,與健康貓相比,伴有ATE的HCM患貓血漿中D-二聚體濃度較高[49],提示較高濃度的D-二聚體可能增加了ATE的風險。

上述凝血標志物與貓HCM之間的聯(lián)系還需要進一步研究。在患有高血栓風險疾病的病人中,評估高凝狀態(tài)通常需要測量幾種不同的凝血標志物,這種多標志物聯(lián)合檢查的手段或許也適用于評估HCM患貓的血栓風險。

6 腎臟標志物

心血管-腎軸疾病又稱為心腎綜合征(Cardiorenal syndrome,CRS),指心臟和腎臟其中一個器官的急性或慢性功能障礙,可能會導致另一個器官的急性或慢性功能障礙[50]。因此,在臨床上對腎臟疾病進行診斷的相關生理指標是否應納入對于心臟疾病的診斷也值得探討。

肌酐是肌肉組織的代謝產(chǎn)物,主要由腎小球濾過排出體外。血清(或血漿)肌酐濃度隨腎小球濾過率(Glomerular filtration rate,GFR)下降而升高。在心臟病發(fā)展過程中,神經(jīng)體液系統(tǒng)的激活可能會潛在降低GFR,從而改變腎功能。晚期HCM患貓的每搏輸出量和全身灌注減少,可能導致交感神經(jīng)系統(tǒng)激活和RAAS活性增加[51]。Sampedrano等[52]研究證實,HCM患貓的循環(huán)肌酐濃度異常升高。

對稱性二甲基精氨酸(Symmetric dimethylarginine,SDMA)是蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物,主要通過腎臟排出,因此也可以反映GFR情況。SDMA對GFR下降的敏感度高于肌酐。Langhorn等[53]關于貓HCM、原發(fā)性腎病與SDMA關系的研究表明,慢性腎病患貓的血清SDMA濃度顯著升高,而HCM患貓的血清SDMA濃度與健康對照無顯著差異。但是,Liu等[13]研究貓原發(fā)性心肌病的報道表明,肌酐、SDMA和NT-proBNP被定義為CRS標志物,出現(xiàn)CHF的心肌病患貓的血清SDMA和NT-proBNP濃度顯著高于健康對照組和亞臨床心肌病組,并且指標均超過了正常參考范圍,提示存在心臟或腎臟問題;該研究中亞臨床心肌病組與健康對照組貓的血清SDMA和肌酐濃度未見顯著差異,這與之前的研究一致,支持CRS可能不會出現(xiàn)在貓心肌病的早期階段[53]。此外,血清SDMA濃度升高與CHF患貓生存期縮短呈正相關,提示SDMA對心肌病患貓的預后具有潛在的應用價值。

腎臟相關的RAAS過度激活可導致心血管病變。血管緊張素II和醛固酮通過調(diào)節(jié)腎臟、血管和心臟中細胞因子和趨化因子的表達,引起促炎作用和心血管重塑[54-56],這些病理生理變化最終可導致心血管損傷[57]。與健康貓相比,心肌病患貓的RAAS相關標志物顯著升高,如血管緊張素Ⅱ和醛固酮等[58]。RAAS標志物活性在心肌病晚期患貓血液中顯著增加,提示RAAS參與貓心肌病的病程發(fā)展。

7 小結

目前,獸醫(yī)臨床上缺少能對貓HCM進行準確分級、診斷和預后的方法,這使得心臟生物標志物的開發(fā)成為新的趨勢。本文所述生物標志物為貓的HCM提供了相關的病理生理信息,隨著研究的不斷深入,未來將心臟生物標志物與其他臨床診斷方法相結合,有望對貓的HCM實現(xiàn)更準確的疾病分級,輔助制定最佳的治療方案和預后追蹤,最終推動獸醫(yī)臨床工作的發(fā)展。