蒲公英水煎液對(duì)犢牛源多重耐藥大腸桿菌耐藥性的消除作用

王 琪,張惠玲,劉日蓉,孫 月,李培鋒,樊舒婷,宋 晨,郝普國(guó),徐文琦,郭 宇,趙紅霞

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010 ; 2.北京第二外國(guó)語(yǔ)學(xué)院中東學(xué)院,北京 朝陽(yáng) 100024 ;3.鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)系,內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000 ; 4.內(nèi)蒙古動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心 ,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

犢牛腹瀉是養(yǎng)牛業(yè)常見(jiàn)疾病,發(fā)病率高達(dá)90%,死亡率高達(dá)50%以上,對(duì)犢牛的生長(zhǎng)、發(fā)育和成活等有重大的影響[1-3]。大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)是引起犢牛腹瀉的主要病原菌之一,且隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；同F(xiàn)代化的發(fā)展,使用抗菌藥物防控由大腸桿菌引起的犢牛腹瀉已成為主流[4]。但抗菌藥物的不合理使用不僅引發(fā)了很多公共衛(wèi)生問(wèn)題,同時(shí)也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

蒲公英(TaraxacummongolicumHand. -Mazz.)屬菊科,是由蒲公英屬植物的全草炮制而成,臨床研究發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抑菌抗炎[5]、利膽保肝、降血糖、降血脂、抗氧化和抗腫瘤等作用[6-7]。因此,本試驗(yàn)以蒲公英為對(duì)象,通過(guò)對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)引起犢牛腹瀉的大腸桿菌進(jìn)行分離、鑒定和藥敏試驗(yàn),對(duì)其所攜帶的耐藥基因進(jìn)行分析,并篩選出耐藥菌株,研究蒲公英對(duì)其耐藥性的消除作用,以期為獸醫(yī)臨床治療由大腸桿菌引起的犢牛腹瀉提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 犢牛源口腔病料、鼻腔病料和糞便病料共107份,來(lái)源于內(nèi)蒙古地區(qū)大型牧場(chǎng);標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC 25922,由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基和腸桿菌生化鑒定管,均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒,購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司;氨芐西林(Ampicillin,Amp)、美羅培南(Meropenem,Mer)、頭孢噻吩(Cephalothin,Cel)、頭孢吡肟(Cefepime,Cep)、頭孢噻肟(Cefotaxime,Cet)、頭孢西丁(Cefoxitin,Cex)、多西環(huán)素(Doxycycline,Dox)、四環(huán)素(Tetracycline,Tet)、米諾環(huán)素(Minocycline,Min)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,Cip)、左氧氟沙星(Levofloxacin,Lev)、加替沙星(Gatifloxacin,Gat)、氧氟沙星(Ofloxacin,Ofl)、阿米卡星(Amikacin,Ami)、卡那霉素(Kanamycin,Kan)、慶大霉素(Gentamycin,Gen)、妥布霉素(Tobramycin,Tob)和多黏菌素B(Polymyxin B,PMB)18種抗菌標(biāo)準(zhǔn)藥物,均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;中藥蒲公英,購(gòu)自呼和浩特市國(guó)大藥房。

1.1.3 主要儀器 智能生化培養(yǎng)箱(SPX-160),購(gòu)自寧波江南儀器廠;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZC-250),購(gòu)自太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;超凈工作臺(tái)(S.SW-CJ-1F),購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;PCR 儀(2720 Thermal cycler),購(gòu)自 Thermofisher 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 犢牛源大腸桿菌的分離和鑒定 將病料劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基,對(duì)純化培養(yǎng)后的大腸桿菌進(jìn)行革蘭染色涂片鏡檢,結(jié)合生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)方法對(duì)所分離菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.2 藥物敏感試驗(yàn) 選用18種抗菌藥物對(duì)大腸桿菌分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) 推薦的K-B法進(jìn)行,結(jié)果依據(jù) CLSI 2019年推薦的藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[8]。

1.2.3 犢牛源大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè) 采用PCR方法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(blaTEM、blaCTX-M)、喹諾酮類耐藥基因[qnr(A)、qnr(S)]、四環(huán)素類耐藥基因[tet(A)、tet(D)]和氨基糖苷類耐藥基因[aad(B)、aac(C)],引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.2.4 蒲公英水煎液最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)的測(cè)定

1.2.4.1 菌液的制備 將分離菌株劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,挑取單菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中,于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)16 h進(jìn)行活化,將活化后菌液的含菌量調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠁挝?約含 1×108CFU/mL),即紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定菌液在625 nm處的吸光度值為0.08～0.13。將調(diào)整好濃度的菌液再稀釋1 000倍,使其含菌量變?yōu)?×105CFU/mL。

1.2.4.2 蒲公英水提物的制備 稱取 50 g 蒲公英,浸泡于蒸餾水中2 h,先用武火煎煮,沸騰后改用文火煮 30 min,紗布過(guò)濾,藥渣再加蒸餾水煮30 min,合并2次濾液,濃縮至25 mL,110 ℃、20 min 高壓滅菌后,置于 4 ℃冰箱備用。

1.2.4.3 瓊脂稀釋法測(cè)定MIC 取8支滅菌試管依次進(jìn)行編號(hào),1號(hào)試管加入2 mL蒲公英水煎液(2 g/mL),除1號(hào)試管外其余試管各加入2 mL生理鹽水,2號(hào)試管加入2 g/mL蒲公英水煎液2 mL,吹打混勻后吸取2 mL加入3號(hào)試管,依次按二倍倍比稀釋至8號(hào)試管后棄去2 mL。取8個(gè)無(wú)菌平板均加入18 mL滅菌普通瓊脂培養(yǎng)基并依次編號(hào),分別吸取上述1～8號(hào)試管中的藥液2 mL于對(duì)應(yīng)平板中。將稀釋好的菌液分別劃線接種于平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h,抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為MIC。

1.2.5 蒲公英水煎液耐藥消除作用的檢測(cè) 以耐藥菌株(根據(jù)耐藥表型選取1株多重耐藥菌株)的亞抑菌濃度(即1/2MIC)進(jìn)行蒲公英水煎液耐藥消除試驗(yàn)。在無(wú)菌試管中用普通肉湯培養(yǎng)基把蒲公英水煎液濃度稀釋至 1/2 MIC,同時(shí)設(shè)立不加藥液的普通肉湯培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組,將在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱搖菌培養(yǎng)好的耐藥株和標(biāo)準(zhǔn)菌株稀釋至1×106CFU/mL,取菌液100 μL 分別接種于各試管中,37 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng),間隔24 h 傳代接種;傳代3次后,分別取培養(yǎng)24、48和72 h的菌液與藥液培養(yǎng)物,用 K-B 法檢測(cè)耐藥菌株對(duì)氧氟沙星和妥布霉素的耐藥表型變化情況。

2 結(jié)果

2.1 犢牛源大腸桿菌的分離和鑒定 本試驗(yàn)共分離鑒定得到44株?duì)倥Ｔ创竽c桿菌,分離率為41%,其中從口腔病料中分離到5株(11%),從鼻腔病料中分離到7株(16%),從糞便病料中分離到32株(73%)。

2.2 藥物敏感試驗(yàn) 犢牛源大腸桿菌分離株對(duì)18種抗菌藥物體外藥物敏感性測(cè)定結(jié)果如表2所示,犢牛源大腸桿菌分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥嚴(yán)重,其中對(duì)氨芐西林的耐藥率達(dá)到了100%,對(duì)頭孢噻吩和頭孢噻肟耐藥率相同,為 66%,對(duì)頭孢西丁的耐藥率為32%,對(duì)頭孢吡肟相對(duì)敏感,耐藥率為18%;對(duì)四環(huán)素類抗菌藥物中的多西環(huán)素和米諾環(huán)素較敏感,耐藥率為16%,而對(duì)四環(huán)素相對(duì)耐藥,耐藥率達(dá)到了43%;對(duì)喹諾酮類抗菌藥物耐藥情況相對(duì)嚴(yán)重,其中對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率達(dá)到了75%,對(duì)左氧氟沙星和氧氟沙星的耐藥率分別為55%和45%;對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物相對(duì)耐藥,其中對(duì)卡那霉素和慶大霉素的耐藥率分別達(dá)到了45%和39%,對(duì)阿米卡星和妥布霉素的耐藥率分別為 27%和 23%;幾乎所有的犢牛源大腸桿菌分離株都對(duì)碳青霉烯類的美羅培南和多肽類的多黏菌素B敏感,耐藥率均為2%。

表2 44株?duì)倥Ｔ创竽c桿菌分離株藥物敏感性測(cè)定結(jié)果

2.3 犢牛源大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè) β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的檢出率最高,其中blaCTX-M基因檢出數(shù)最多,共38株分離株可檢出該基因(86%)(部分結(jié)果見(jiàn)圖1),27株分離株可檢出blaTEM基因(61%);對(duì)氨基糖苷類耐藥的犢牛源大腸桿菌中,aac(C)基因檢出數(shù)最多,共16株分離株可檢出該基因(36%),2株分離株可檢出aad(B)基因(5%);對(duì)四環(huán)素類耐藥的大腸桿菌中,分別有23株(52%)和6株(14%)分離株可檢出tet(A)基因和tet(D)基因;對(duì)喹諾酮類耐藥的大腸桿菌中,2株分離株可檢測(cè)到qnr(A)基因(5%),14株分離株可檢測(cè)到qnr(S)基因(32%)。

圖1 blaCTX-M基因的PCR檢測(cè)

2.4 蒲公英水煎液MIC的測(cè)定 經(jīng)瓊脂稀釋法測(cè)定,蒲公英水煎液的MIC為200 mg/mL。

2.5 蒲公英水煎液耐藥消除作用的檢測(cè) 選取44株?duì)倥Ｔ创竽c桿菌中耐14種抗菌藥物的39號(hào)分離株作為進(jìn)行耐藥消除試驗(yàn)的耐藥菌株,將蒲公英水煎液消除組與空白對(duì)照組藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。如表3所示,通過(guò)蒲公英水煎液處理的犢牛源大腸桿菌耐藥菌株在培養(yǎng)48和72 h后抑菌圈直徑明顯增加;如表4所示,其對(duì)氧氟沙星和妥布霉素均可以達(dá)到一定的敏感程度。

表3 蒲公英水煎液對(duì)抗菌藥物抑菌圈直徑的影響

表4 蒲公英水煎液對(duì)犢牛源大腸桿菌耐藥表型的影響

3 討論

本試驗(yàn)從來(lái)源于內(nèi)蒙古地區(qū)大型牧場(chǎng)的107份病料中分離鑒定出44株?duì)倥Ｔ创竽c桿菌,分離率為41%;李慧等[9]研究中對(duì)石河子地區(qū)53份犢牛腹瀉糞便樣品進(jìn)行分離,得到的29株大腸桿菌,分離率達(dá)到55%;在王姣姣等[10]研究中對(duì)吉林省部分地區(qū)犢牛腹瀉的64份直腸拭子進(jìn)行分離,得到39株致病性大腸桿菌,分離率達(dá)到60%;而在高?；鄣萚11]研究中,從35份犢牛腹瀉樣本中分離鑒定得到26株大腸桿菌,其分離率高達(dá)74%,上述研究中大腸桿菌分離率均高于本試驗(yàn)。本試驗(yàn)選取18種抗菌藥物進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn),結(jié)果顯示,44株?duì)倥Ｔ创竽c桿菌對(duì)氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星5種抗菌藥物的耐藥率均高于50%;陳虹豆等[12]分離到的腹瀉犢牛源大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星有較好的敏感性,對(duì)米諾環(huán)素也有一定的敏感性;吳同壘等[13]研究表明,秦皇島地區(qū)的腹瀉犢牛源大腸桿菌對(duì)慶大霉素和阿米卡星的耐藥率均為83%,對(duì)氧氟沙星最敏感,而本試驗(yàn)分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星高度耐藥,達(dá)75%,而對(duì)米諾環(huán)素敏感性較高,對(duì)慶大霉素和阿米卡星也表現(xiàn)出一定程度的耐藥性,但對(duì)氧氟沙星的耐藥率卻達(dá)到了45%。本試驗(yàn)對(duì)44株?duì)倥Ｔ创竽c桿菌進(jìn)行8種耐藥基因的檢測(cè),結(jié)果顯示,分離菌株均呈現(xiàn)不同程度的耐藥基因攜帶情況,尤其對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的檢出率最高,同藥敏試驗(yàn)中對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率最高一致,表明耐藥基因的檢出率與藥物的敏感性也有一定程度的關(guān)聯(lián)。楊艷麗等[14]報(bào)道顯示,新疆地區(qū)牛源大腸桿菌喹諾酮類耐藥基因主要是qnr(A)基因,而本試驗(yàn)中主要為qnr(S)基因;張陸等[15]通過(guò)對(duì)哈爾濱地區(qū)腹瀉犢牛大腸桿菌耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),blaCTX-M耐藥基因檢出率為19.2%,而本試驗(yàn)中blaCTX-M檢出率達(dá)到了86%;劉勃興等[16]研究結(jié)果顯示,河北省腹瀉犢牛大腸桿菌四環(huán)素類耐藥基因tet(C)檢出率高達(dá)100%,tet(D)基因檢出率為0,與本試驗(yàn)所得的四環(huán)素類耐藥基因主要為tet(A)和tet(D),且檢出率分別為52%和14%有一定的差異;以上數(shù)據(jù)說(shuō)明,不同地區(qū)分離株對(duì)藥物的敏感程度存在一定差異,但結(jié)果表現(xiàn)的不同可能與細(xì)菌中存在多種耐藥機(jī)制有關(guān)系,需要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行探究。

中藥能夠逆轉(zhuǎn)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性,在蒲公英的作用下,耐藥菌株對(duì)氧氟沙星和頭孢霉素的敏感性提高,由原來(lái)的耐藥菌株轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾芯?。本試?yàn)初步證明了蒲公英具有一定的耐藥消除作用,通過(guò)將犢牛源大腸桿菌與蒲公英水煎液相互作用,對(duì)比消除后抑菌圈直徑的大小,結(jié)果顯示,蒲公英水煎液對(duì)不同種類的抗菌藥物恢復(fù)了一定的敏感性;王永芬等[17]用石榴皮、黃芩和黃連作用于豬致病性大腸桿菌的研究結(jié)果顯示,3種中藥對(duì)大腸桿菌都有逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用;趙秋云[18]使用4組中藥對(duì)15株致病性大腸桿菌進(jìn)行耐藥消除試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)經(jīng)中藥培養(yǎng)后各組菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性均增強(qiáng);劉金平等[19]使用中藥提取物恢復(fù)耐藥大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物敏感性的研究證明,中藥可以從一定程度上恢復(fù)大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。以上研究證實(shí),中藥可以增加細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性,降低耐藥性,而且耐藥性的消除與中藥的作用時(shí)間密切相關(guān),在一定時(shí)間內(nèi),中藥作用時(shí)間越長(zhǎng),耐藥性的消除效果越好[20]。

內(nèi)蒙古地區(qū)犢牛源大腸桿菌的耐藥情況比較嚴(yán)重,抗菌藥物的濫用可能會(huì)增加細(xì)菌獲得耐藥基因的潛力,應(yīng)盡量減少抗菌藥物的使用,并逐漸通過(guò)中藥來(lái)緩解耐藥性,本試驗(yàn)可為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。