豬繁殖與呼吸綜合征病毒入侵宿主細(xì)胞途徑研究進(jìn)展

李 睿,喬松林,張改平

[河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物疫病防控研究所(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室),河南 鄭州 450002]

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)屬于套式病毒目(Nidovirales)、動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、β-動(dòng)脈炎病毒屬(Betaarterivirus)(https：//ictv.global/taxonomy/taxondetails?taxnode_id=201851832),是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒。PRRSV感染主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障礙,新生仔豬高病死率以及各年齡段豬呼吸系統(tǒng)疾病[1]。當(dāng)前,PRRSV是危害全球養(yǎng)豬業(yè)最主要的病原之一,每年均造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。然而,PRRSV毒株多樣,導(dǎo)致目前疫苗免疫、抗病毒治療等防控手段面臨巨大的困難和挑戰(zhàn)。作為非細(xì)胞型病原,PRRSV首先入侵宿主細(xì)胞,然后利用細(xì)胞生命系統(tǒng)完成自身復(fù)制周期[3]。因此,追蹤PRRSV入侵宿主細(xì)胞這一關(guān)鍵步驟的最新研究進(jìn)展,有助于深入理解PRRSV感染及其致病機(jī)制,為抗病毒策略開(kāi)發(fā)提供新的理論依據(jù)。

1 動(dòng)物囊膜病毒入侵宿主細(xì)胞途徑

病毒是一類(lèi)非細(xì)胞型病原,根據(jù)其是否具有脂質(zhì)雙分子層的囊膜結(jié)構(gòu)(Envelope),可被進(jìn)一步劃分為有囊膜病毒(Enveloped viruses)和無(wú)囊膜病毒(Non-enveloped viruses)。作為細(xì)胞內(nèi)寄生病原,病毒必須感染宿主細(xì)胞才能完成自身復(fù)制周期進(jìn)行增殖。病毒復(fù)制周期由一系列受高度調(diào)控的過(guò)程組成,一般包括入侵(Invasion)、脫殼(Uncoating)、生物合成(Synthesis)、組裝(Assembly)和釋放(Release)等階段[4-5]。

在入侵宿主細(xì)胞途徑方面,關(guān)于動(dòng)物囊膜病毒的研究較為充分,包括通過(guò)病毒囊膜與宿主細(xì)胞質(zhì)膜(Plasma membrane)直接膜融合(Membrane fusion)和利用細(xì)胞內(nèi)吞作用(Endocytosis)兩種入侵途徑[6]。前者是由病毒囊膜蛋白與宿主細(xì)胞表面受體相互作用或/和被定位于宿主細(xì)胞質(zhì)膜上的蛋白酶、外源蛋白酶等切割,引起病毒膜融合蛋白(Fusion protein)構(gòu)象發(fā)生改變,觸發(fā)病毒囊膜與宿主細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生膜融合,從而在宿主細(xì)胞表面釋放病毒基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制[7]。后者可根據(jù)細(xì)胞內(nèi)吞作用機(jī)制細(xì)分為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑(Clathrin-mediated endocytosis,CME)、小窩蛋白(Caveolin)介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑、脂筏(Lipid raft)介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和巨胞飲(macropinocytosis)等[8]。動(dòng)物囊膜病毒利用內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)體(Endosomes)后,病毒膜融合蛋白在內(nèi)體蛋白酶、低pH等作用下構(gòu)象發(fā)生改變,引起病毒囊膜與內(nèi)體膜融合,釋放病毒基因組進(jìn)行復(fù)制[9]。大量研究證實(shí),動(dòng)物囊膜病毒往往利用多種途徑入侵宿主細(xì)胞以提高感染效率。例如,嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)纖突糖蛋白(Spike glycoprotein)與受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin converting enzyme 2)結(jié)合后,被位于宿主細(xì)胞質(zhì)膜上的跨膜絲氨酸蛋白酶2(Transmembrane protease serine 2)切割,引起病毒直接在宿主細(xì)胞表面發(fā)生膜融合[10];另一方面,SARS-CoV-2還能利用CME[11]和巨胞飲[12]等多種內(nèi)吞作用入侵宿主細(xì)胞建立感染。

入侵是病毒完成復(fù)制周期的第一關(guān)鍵步驟,因此一直是病毒學(xué)領(lǐng)域的研究前沿和熱點(diǎn),也是疫苗和抗病毒藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo)。深入研究病毒入侵宿主細(xì)胞途徑對(duì)于全面揭示病毒感染及其致病機(jī)制、開(kāi)發(fā)高效抗病毒策略具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。如上所述,目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)SARS-CoV-2入侵途徑的研究成果豐碩,為全球防控SARS-CoV-2提供了可靠的理論支持;同時(shí)基于SARS-CoV-2入侵途徑的抗體類(lèi)藥物已成功用于感染患者的臨床治療,另有眾多小分子類(lèi)和多肽類(lèi)抗病毒藥物正在臨床試驗(yàn)中,有望助力抗擊肆虐全球的SARS-CoV-2疫情[13-14]。

2 PRRSV入侵宿主細(xì)胞途徑

PRRSV具有高度的宿主細(xì)胞嗜性,在豬體內(nèi)主要感染單核/巨噬細(xì)胞,包括豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)和樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells)[15-16];在體外感染必需受體CD163表達(dá)的非洲綠猴腎上皮細(xì)胞系MA-104及其衍生的MARC-145細(xì)胞等[17]。在PRRSV入侵途徑研究方面,最初美國(guó)學(xué)者使用氯喹(Chloroquine)、氯化銨(Ammonium chloride)和巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)處理MARC-145細(xì)胞影響細(xì)胞內(nèi)囊泡pH,通過(guò)檢測(cè)PRRSV感染過(guò)程中RNA復(fù)制和子代病毒產(chǎn)生發(fā)現(xiàn),PRRSV入侵依賴(lài)于低pH,進(jìn)一步通過(guò)電子顯微鏡(Electron microscopy)觀察到PRRSV入侵時(shí)病毒顆粒被包裹在網(wǎng)格蛋白形成的細(xì)胞囊泡內(nèi),初步確定PRRSV通過(guò)低pH依賴(lài)的內(nèi)吞途徑入侵MARC-145細(xì)胞[18]。隨后,比利時(shí)學(xué)者通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)、激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)等方法結(jié)合使用氯喹、氯化銨等試劑進(jìn)一步明確PRRSV通過(guò)低pH依賴(lài)的受體介導(dǎo)的CME入侵PAMs[19]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者后續(xù)鑒定出硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin,Sn)、波形蛋白(Vimentin)、CD151、CD163、CD209、非肌肉肌球蛋白重鏈9(Non-muscle myosin heavy chain 9,MYH9)、多配體蛋白聚糖4(Syndecan-4)、表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor)、熱休克蛋白家族成員8(Heat shock protein member 8,HSPA8)等細(xì)胞受體或因子參與PRRSV CME過(guò)程[20-22]。深入研究表明,PRRSV通過(guò)其結(jié)構(gòu)蛋白與細(xì)胞受體或因子相互作用介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞：PRRSV基質(zhì)蛋白(Matrix protein,M)首先被HS吸附使病毒聚集到細(xì)胞表面,接著PRRSV囊膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)5被Sn結(jié)合使病毒內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,隨后PRRSV GP2、GP4與CD163相互作用促進(jìn)病毒內(nèi)吞;同時(shí),PRRSV核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein)、GP5和GP4分別與波形蛋白、MYH9和HSPA8相互作用協(xié)助病毒入侵[20-22]。近期,本研究團(tuán)隊(duì)揭示了PRRSV進(jìn)入內(nèi)體后的膜融合細(xì)節(jié)[23-24],進(jìn)一步豐富了PRRSV通過(guò)CME入侵宿主細(xì)胞的分子機(jī)制。

另外,國(guó)內(nèi)多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)使用甲基-β環(huán)糊精(Methyl-β cyclodextrin,MβCD)等去除MARC-145細(xì)胞或PAMs細(xì)胞膜中的膽固醇破壞脂筏后,通過(guò)多種方法監(jiān)測(cè)PRRSV感染過(guò)程發(fā)現(xiàn),MβCD顯著抑制PRRSV入侵宿主細(xì)胞,而在MβCD處理后回補(bǔ)外源膽固醇會(huì)部分恢復(fù)PRRSV入侵宿主細(xì)胞,提示PRRSV利用脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵宿主細(xì)胞[25-27],然而相關(guān)分子機(jī)制還需進(jìn)一步揭示。

3 PRRSV入侵途徑最新研究進(jìn)展

除上述CME和脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑外,本研究團(tuán)隊(duì)近年來(lái)在PRRSV入侵途徑領(lǐng)域取得了新的進(jìn)展。2020年,本研究團(tuán)隊(duì)使用細(xì)胞內(nèi)吞作用抑制劑系統(tǒng)研究PRRSV入侵途徑發(fā)現(xiàn),即使阻斷CME和脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑,PRRSV仍能入侵MARC-145細(xì)胞和PAMs,提示存在新的途徑參與PRRSV入侵宿主細(xì)胞。該研究使用巨胞飲特異性抑制劑5-(N-乙基-N-異丙基)-阿米洛利[5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride]處理宿主細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),PRRSV入侵受到顯著抑制,初步確定PRRSV可利用巨胞飲入侵宿主細(xì)胞;然后利用右旋糖酐(Dextran)指示巨胞飲、分揀連接蛋白5(Sorting nexin 5)指示巨胞飲體(Macropinosomes)、鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)標(biāo)記巨胞飲F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)膜凸起、細(xì)胞松弛素D(Cytochalasin D)和拉春庫(kù)林A(Latrunculin A)影響巨胞飲肌動(dòng)蛋白重排等手段進(jìn)一步明確巨胞飲可參與PRRSV入侵宿主細(xì)胞[28]。為了揭示PRRSV調(diào)控巨胞飲的分子機(jī)制,該研究還采用斑點(diǎn)印跡法(Dot blotting)、免疫印跡法(Immunoblotting)、蛋白沉降法(Pulldown)、RNA干擾(RNA interference)、FCM和CLSM等試驗(yàn),闡明了PRRSV囊膜暴露的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)被宿主細(xì)胞表面PS受體-T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子(T-cell immunoglobulin and mucin domain)家族成員識(shí)別,激活下游Rho家族鳥(niǎo)苷三磷酸酶Rac1/細(xì)胞分裂控制蛋白42(Cell division control protein 42)-p21活化激酶1(p21-activated kinase 1)信號(hào)通路誘導(dǎo)巨胞飲[28]。該研究首次鑒定出PRRSV利用巨胞飲入侵宿主細(xì)胞的途徑。

同年,本團(tuán)隊(duì)在研究高致病性PRRSV(Highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)致病機(jī)制時(shí)意外發(fā)現(xiàn),HP-PRRSV感染豬后會(huì)導(dǎo)致豬肺臟組織大量分泌彈性蛋白酶(Elastase);為了揭示彈性蛋白酶在HP-PRRSV感染過(guò)程中的作用,外源添加該蛋白酶發(fā)現(xiàn)其能夠顯著促進(jìn)HP-PRRSV入侵MARC-145細(xì)胞和PAMs;隨后通過(guò)多種方法驗(yàn)證了彈性蛋白酶促進(jìn)HP-PRRSV入侵不依賴(lài)于上述已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)吞途徑,而且添加多種抑制劑阻斷低pH依賴(lài)的內(nèi)吞途徑后,該蛋白酶仍能介導(dǎo)病毒入侵;最終證實(shí)彈性蛋白酶是通過(guò)切割HP-PRRSV GP5介導(dǎo)病毒直接在宿主細(xì)胞表面發(fā)生膜融合,從而促進(jìn)病毒入侵[29]。該研究鑒定了除內(nèi)吞途徑外HP-PRRSV入侵宿主細(xì)胞的另一種途徑。除HP-PRRSV外,其他PRRSV毒株是否也能通過(guò)此途徑入侵宿主細(xì)胞還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 小結(jié)和展望

綜上所述,PRRSV通過(guò)自身囊膜與宿主細(xì)胞質(zhì)膜直接膜融合、CME、脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和巨胞飲多種途徑入侵宿主細(xì)胞。然而,PRRSV入侵途徑研究領(lǐng)域仍然存在諸多問(wèn)題有待解答,例如,膜融合、CME、脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和巨胞飲這些入侵途徑的分子機(jī)制尚未完全闡明,包括調(diào)控的信號(hào)通路、參與其中的宿主和病毒蛋白及其相互作用等;又如,上述入侵途徑如何在PRRSV感染過(guò)程中協(xié)同發(fā)揮作用以及哪種入侵途徑發(fā)揮主要作用;再如,國(guó)內(nèi)外學(xué)者新發(fā)現(xiàn)PRRSV還可利用納米管(Nanotubes)[30]、外泌體(Exosomes)[31]等非傳統(tǒng)入侵途徑進(jìn)行宿主細(xì)胞之間的傳播,所以隨著研究技術(shù)手段的進(jìn)步,可能會(huì)鑒定出新的病毒入侵途徑。因此,持續(xù)研究PRRSV入侵宿主細(xì)胞途徑及其分子機(jī)制,可為疫苗和抗病毒藥物等抗病毒策略開(kāi)發(fā)提供新的參考。對(duì)此,目前已發(fā)現(xiàn)抗菌肽(Antimicrobial peptides)、黃綿馬酸AB(Flavaspidic acid AB)、甘草酸(Glycyrrhizin)、姜黃素(Curcumin)和ι-卡拉膠(Iota-carrageenan)等能夠在細(xì)胞水平通過(guò)阻礙PRRSV入侵,抑制病毒感染;另已證實(shí)25-羥基膽固醇(25-hydroxycholesterol)和楸毒素(Rottlerin)等可在豬體內(nèi)干擾PRRSV入侵,發(fā)揮較強(qiáng)的抗病毒效果,具有較好的應(yīng)用前景[21,32]。