藍莓葉斑病病原菌分離鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

白建波 張晉 楊偉 孔瓊 周銀麗

白建波，張 晉，楊 偉，等. 藍莓葉斑病病原菌分離鑒定及室內(nèi)藥劑篩選［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2024，52（7）：118-123.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.016

（1.紅河學院云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，云南蒙自 661100； 2.紅河學院商學院，云南蒙自 661100）

摘要：為明確云南蒙自藍莓葉斑病的病原菌種類，篩選出防治藍莓葉斑病的有效殺菌劑，以采自云南蒙自的藍莓葉斑病葉片為材料，對致病菌進行分離純化，并進行致病性測定。采用病原菌形態(tài)學結(jié)合基因序列分析比對的方法鑒定病原菌，以6種殺菌劑為對象，研究殺菌劑對病原菌菌絲的室內(nèi)毒力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引起云南蒙自藍莓葉斑病的病原菌Y1為交鏈格孢（Alternaria alternata）；不同類型殺菌劑對菌株Y1的生長抑制存在較大差異；室內(nèi)毒力測定效果最好的是325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑，EC50值為1.152 mg/L；其次為37%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、25％吡唑醚菌酯懸浮劑，EC50值分別為1.624、2.149 mg/L；75%百菌清可濕性粉劑的抑菌效果在6種供試藥劑中最差，EC50值為 524.237 mg/L。結(jié)果可為交鏈格孢引起的藍莓葉斑病防治提供參考。

關(guān)鍵詞：藍莓；葉斑??；鏈格孢；毒力測定；病原菌分離測定

中圖分類號：S436.639? 文獻標志碼：A? 文章編號：1002-1302（2024）07-0118-06

藍莓是杜鵑花科越橘屬（Vaccinium spp.）植物［1］，果肉細膩口感較好，營養(yǎng)成分豐富，所含的花青素與花色苷、黃酮及其糖苷衍生物、酚酸與糖類物質(zhì)等均有多種生理保健功能［2］。云南省地理、氣候獨特，地處低緯度高原，具有晝夜溫差大、光照時間長等優(yōu)勢，目前蒙自、曲靖、大理、文山、玉溪等地區(qū)已大規(guī)模種植藍莓。近年來，由于市場需求量的不斷增加，藍莓種植面積和產(chǎn)量不斷擴大，藍莓病害的種類也不斷增加。藍莓葉斑病是常見且危害嚴重的病害之一。在藍莓的營養(yǎng)生長期，葉斑病首先危害藍莓葉片，葉片呈現(xiàn)大小不等的褐色圓斑。發(fā)病后期葉片呈現(xiàn)泛黃、卷曲等趨勢，最終葉片脫落，導致花芽減少，從而影響藍莓的產(chǎn)量和質(zhì)量。藍莓葉斑病的病原菌種類復(fù)雜多樣，明確引起葉斑病的病原菌是有效防治該病害的前提和基礎(chǔ)。關(guān)于藍莓葉斑病前人進行了大量研究，張國輝等發(fā)現(xiàn)，黔東南苗族侗族自治州流行的藍莓葉斑病是由巨腔莖點霉（Phoma macrostoma）引起的［3］。薛德勝等對山東省藍莓葉斑病進行分離純化，鑒定其病原菌為棒狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）［4］。余磊等將云南藍莓葉斑病的致病菌最終鑒定為細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）［5］。楊秀梅等研究發(fā)現(xiàn)，云南地區(qū)藍莓葉斑病是由柯氏麗赤殼菌（Calonectria colhounii）引起的［6］。薛德勝等對山東半島藍莓葉斑病進行室內(nèi)毒力測定，其中福美雙和苯醚甲環(huán)唑抑菌效果強于其他藥劑［7］。凌丹燕研究了6種殺菌劑對浙江金華藍莓試驗基地藍莓葉斑病的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑及異菌脲效果最佳，EC50值都小于3.0 mg/L［8］。楊麗娜等通過室內(nèi)藥劑篩選試驗發(fā)現(xiàn)，60％乙霉·多菌靈可濕性粉劑對藍莓葉斑病的抑制作用最好；田間防治效果表明，甲基硫菌靈對藍莓葉斑病防治效果最佳，乙霉·多菌靈的防治效果次之［9］。藍莓葉斑病嚴重降低了藍莓的質(zhì)量和經(jīng)濟價值，亟需明確葉斑病病原菌種類，進而制定有效的防控措施。本研究對云南藍莓葉斑病病原菌進行分離，并采用形態(tài)學觀察結(jié)合基因序列（rDNA-ITS、Alta1、EF-1α）分析比對的方法鑒定病原菌，選擇6種殺菌劑進行室內(nèi)藥劑毒力測定，篩選能夠防治藍莓葉斑病的有效殺菌藥劑，以期為云南藍莓葉斑病的有效防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植株

于2022年3—5月在云南蒙自藍莓種植基地采集葉斑病病害藍莓葉片樣品，試驗地點為紅河學院生物科學與農(nóng)學學院。

1.1.2 供試藥劑

所有供試藥劑均于農(nóng)藥市場購買（表1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離純化

采用組織分離法［10］將采集到的藍莓葉斑病病葉沖洗干凈后，取藍莓葉片病健交界組織［11］進行病原菌分離、純化。

1.2.2 病原菌致病性測定

采用離體和活體葉片接種法［12］對分離的病原菌進行回接試驗，并進行致病性測定。用打孔器在純化后的病原菌菌落邊緣整齊打取菌餅，直徑為5 mm。隨后將菌絲面輕輕按壓在經(jīng)酒精消毒和無菌刺傷后的健康藍莓葉片的刺傷部位，3次重復(fù)，以刺傷但不接種菌塊為空白對照。將離體接種的葉片放置在28 ℃恒溫箱進行保濕培養(yǎng)，每天按時觀察并仔細記錄其發(fā)病情況。當葉片出現(xiàn)明顯癥狀時，對藍莓葉片刺傷處發(fā)病部位取樣，病原菌進行再次分離純化，并與原始病原菌進行菌落和分生孢子形態(tài)對比。

1.2.3 病原菌形態(tài)學鑒定

將純化后的供試菌株接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板上，每天觀察菌落的顏色和形態(tài)，并借助顯微鏡觀察記錄其菌絲的顏色、有無隔膜以及分生孢子形態(tài)大小、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征，結(jié)合文獻［13］對病原菌進行形態(tài)鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學鑒定

用美國 （Omega Bio-Tek）真菌DNA提取試劑盒，提取藍莓葉斑病病原真菌DNA。將所提取到的病原菌DNA用核糖體rDNA-ITS序列［14］、翻譯延長因子α（EF-1α）［15］、過敏原基因（Alta1）［16］進行擴增，引物序列如表2所示，反應(yīng)體系參照劉俏等的方法［17］。將擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技股份有限公司昆明分公司進行序列測定，根據(jù)測序結(jié)果采用鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 室內(nèi)殺菌劑毒力測定

采用菌絲生長速率法測定藍莓葉斑病病菌對殺菌劑的敏感性［18］。450 g/L咪鮮胺水乳劑的試驗濃度分別為90.00、45.00、18.00、4.50、0.45 mg/L，37%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑的試驗濃度分別為74.00、37.00、14.80、3.70、0.37 mg/L，50%異菌脲可濕性粉劑的試驗濃度分別為100.0、50.0、20.0、5.0、0.5 mg/L，75%百菌清可濕性粉劑的試驗濃度分別為1 500.0、750.0、375.0、187.5、75.0 mg/L，25%吡唑醚菌酯懸浮劑的試驗濃度分別為108.00、54.00、21.60、5.40、0.54 mg/L， 325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑的試驗濃度分別為65.000、32500、13.000、3.250、0.325 mg/L。

藥劑濃度配制完成后，與PDA培養(yǎng)基充分混合，制作成不同濃度的含藥平板。隨后將純化后的菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅小心轉(zhuǎn)移至平板中央，每個藥劑濃度設(shè)3次重復(fù)。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)7 d后，測量菌落直徑（cm），根據(jù)菌落直徑計算菌絲生長抑制率并進行回歸分析，比較其差異性。運用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件得出毒力回歸方程（Y=aX+b）、抑菌率中濃度（EC50值）和相關(guān)系數(shù)（r）。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍莓葉斑病田間癥狀

葉斑病主要危害葉片，發(fā)病初期葉片呈現(xiàn)大小不一致的棕褐色圓斑，隨著病害逐漸嚴重，病斑面積開始慢慢擴大，最終呈現(xiàn)直徑較大的圓斑或連片不規(guī)則形狀的紅褐色病斑。發(fā)病后期，葉片泛黃、卷曲、甚至脫落，最終導致整個葉片枯萎死亡（圖1）。

2.2 病原菌的分離與致病性測定

從云南蒙自采集得到的藍莓葉斑病葉片樣品中分離、純化得到菌株Y1。采用離體和活體2種接種方式，于健康藍莓葉片上接種菌株Y1。結(jié)果（圖2）表明，接種菌株Y1的葉片開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀的時間為接種后2 d，其癥狀與葉斑病相似，比對后對致病性葉片進行病原菌再次分離、純化，得到與接種菌Y1形態(tài)學特征相同的病原菌，由此確定菌株Y1為藍莓葉斑病的致病菌。

2.3 病原菌形態(tài)學特征觀察

菌株Y1培養(yǎng)初期氣生菌絲發(fā)達，菌絲顏色為灰白色，培養(yǎng)3 d后變?yōu)槟G色絨狀，最外圍菌絲呈灰白色。菌落背面顏色為黑色，菌落邊緣呈現(xiàn)整齊形態(tài)，具灰白色與墨綠色相間的同心輪紋，顏色逐漸向內(nèi)加深，培養(yǎng)7 d后菌落直徑達（7.60±0.17） cm。培養(yǎng)10 d時，菌落背面為青灰色，菌絲為灰白色絮狀。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分生孢子呈淺褐色，長橢圓形、卵形、倒梨形，單生，具0～3個縱膈膜，1～5個橫膈膜，大小為（22.5～69.0）μm×（3.2～4.6）μm。分生孢子具喙，喙為柱狀形，直立或略彎曲。分生孢子彎曲或直立，梗淺褐色，簇生或單生，具明顯分隔（圖3）。綜合分生孢子和菌落形態(tài)特征描述，初步確認致病菌Y1為交鏈格孢（Alternaria alternata）。

2.4 病原菌分子生物學鑒定

對藍莓葉斑病病原真菌DNA的過敏原Alt_a1、翻譯延長因子EF-1α[WTBZ][STBZ]和ITS進行擴增和測序，基因片段序列長度分別為478、251、537 bp， 將序列在NCBI中進行BLAST比對。

從GenBank中下載同屬的標準菌株序列，基于ITS、EF-1α和Alta1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖4至圖6）表明，Y1的ITS基因與已登錄的Alternaria alternata（登錄號為OQ026848.1）相似性達到100%；Y1的Alta1基因和EF-1α基因分別與已登錄的Alternaria alternata（登錄號分別為MH377243.1和OM991445.1）相似性較高，相似性達到100%。結(jié)合菌株的形態(tài)特征，最終鑒定 A. alternata 為引起云南蒙自藍莓葉斑病的病原菌。

2.5 殺菌劑對藍莓葉斑病病原菌的抑制作用

為尋找控制藍莓葉斑病的殺菌劑，初步篩選了6種殺菌劑對病原菌Y1進行毒力測定，結(jié)果（表3）表明，不同的藥劑對A. alternata的菌絲生長均有抑制效果。其中，325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑的毒力最強，EC50值為1.152 mg/L；其次為37%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和25%吡唑醚菌酯懸浮劑，EC50值分別為1.624、2.149 mg/L；75%百菌清可濕性粉劑效果最差，EC50值為524.237 mg/L。

3 討論

葉斑病是藍莓種植過程中危害較為嚴重且經(jīng)常發(fā)生的一種真菌病害，其病原種類數(shù)目繁多，大部分病原菌會導致果實受害，從而影響藍莓的產(chǎn)量和質(zhì)量［19］。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南蒙自的藍莓葉斑病主要危害葉片，易形成大小不一致的棕褐色小圓斑，嚴重時葉片泛黃、反卷、脫落，最終整個葉片枯萎死亡。本研究通過分離鑒定發(fā)現(xiàn)，該病由 A. alternata 危害造成。

鏈格孢菌根據(jù)其分生孢子形態(tài)特征可輕松鑒定到屬，但由于分生孢子形態(tài)易受培養(yǎng)條件影響而導致種間的變異性較大， 難以鑒定到種。 因而采用ITS序列分析方法只可以鑒定到屬的分類水平，但不適用于鏈格孢小孢子種的復(fù)核鑒定［20］。目前，鏈格孢菌的鑒定大多采用形態(tài)學與多基因系統(tǒng)分析結(jié)合的方法，楊麗萍等采用形態(tài)學與Alta1、鈣調(diào)蛋白基因（CAL）和ATPase基因序列結(jié)合的方法對甘肅省的櫻桃黑斑病進行研究，認為櫻桃黑斑病由 A. tenuissima 和A. alternata引起［21］。本研究采用真菌通用引物和特異性引物rDNA-ITS、Alta1和EF-1α基因序列分析對病原菌進行鑒定，明確了藍莓葉斑病的致病菌為A. alternata。

在我國，已報道交鏈格孢能引起番茄［22］、魔芋［23］、柑橘［24］、八角［25］、芹菜［26］等發(fā)生葉斑病或褐斑病，目前關(guān)于該種病害化學防治藥劑的相關(guān)報道較少，蔣晶晶等對將從黃芩上分離得到的鏈格孢進行室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明，0.3%丁子香酚可溶液劑、98.5%腐霉利原藥、97%咯菌腈原藥、0.4%蛇床子素可溶液劑均對鏈格孢有抑制作用，其中抑菌效果最好的是97％咯菌腈，對A.tenuissima和茄鏈格孢（A.solani）均有抑菌作用，EC50值分別為0.04、0.06 mg/L［27］。王榮波等選用98%異菌脲、95%嘧霉胺、96%啶菌噁唑、96.4%菌丹清、96%啶酰菌胺、99%腐霉利6種殺菌劑進行室內(nèi)毒力測定，結(jié)果顯示，96%啶菌噁唑的效果最好，EC50值為 0.621 μg/mL［28］。本研究選用6種不同類型殺菌劑進行毒力測定，結(jié)果顯示，（1）復(fù)配殺菌劑的抑菌活性強于單劑殺菌劑；（2）三唑類殺菌劑和甲氧基丙烯類殺菌劑的殺菌效果均高于咪唑類殺菌劑；（3）取代苯類殺菌劑的抑菌效果最差，其EC50值為524.237 mg/L。綜上，復(fù)配殺菌劑、三唑類、甲氧基丙烯類殺菌劑效果較好，咪唑類一般，取代苯類殺菌劑較差。因此，在葉斑病防治過程中，復(fù)配殺菌劑、三唑類、甲氧基丙烯類殺菌劑可作為藍莓葉斑病田間防治的參考用藥。

4 結(jié)論

本研究對云南省蒙自市藍莓葉斑病病原菌進行分離鑒定，結(jié)合形態(tài)學及基因序列分析比對的方法確定引起藍莓葉斑病的病原菌為A.alternata。[JP2]6種殺菌劑對菌株Y1的菌絲生長均有抑制作用，室內(nèi)毒力效果最好的是325 g/L[JP]苯甲·嘧菌酯懸浮劑，EC50值為1.152 mg/L；其次為37%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和25%吡唑醚菌酯懸浮劑，EC50值分別為1.624、2.149 mg/L，可為藍莓葉斑病田間防治提供參考。

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基金項目：云南省地方高?；A(chǔ)研究聯(lián)合專項（編號：2018FH001-034）；紅河學院科研基金博士專項（編號：XJ17B10）。

作者簡介：白建波（1980—），女，云南個舊人，碩士，副教授，主要從事園藝植物栽培研究。E-mail：bjb_biology2@126.com。

通信作者：周銀麗，博士，副教授，主要從事植物線蟲病害及植物病害復(fù)合侵染研究。E-mail：zyl_biology2@126.com。