基于網(wǎng)絡藥理學探討白芍治療非酒精性脂肪性肝病的作用機制

石思 楊梅 趙琦 張飛 李開楊 胡奕

*基金項目：國家自然科學地區(qū)基金（82160866）；貴州省衛(wèi)生健康委科學技術基金項目（gzwkj2023-208）；貴州中醫(yī)藥大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（黔教合YJSKYJJ〔2021〕168）

第一作者簡介：石思（1995-），女，在讀碩士研究生，研究方向：脂肪肝病防治。

△通信作者：楊梅，E-mail：908417289@qq.com

摘要：目的? 本研究運用網(wǎng)絡藥理學的研究方法探索白芍治療非酒精性脂肪性肝病的作用機制。方法? 通過TCMSP、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選出白芍的有效成分及主要成分靶點；運用Genecards數(shù)據(jù)庫查找疾病靶點基因；通過Venny2.1在線作圖工作平臺獲取白芍成分靶點與疾病靶點的交集圖，通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建白芍-活性成分-靶點網(wǎng)絡；并通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 蛋白網(wǎng)絡、DAVID數(shù)據(jù)庫進行基因GO分析和KEGG通路分析。結(jié)果? 通過篩選共獲得白芍有效成分13個，藥物靶點基因264個，疾病靶點基因有950個，共取得交集靶點基因83個?；騁O分析得出白芍主要參與RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、細胞凋亡過程的負調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)合等多種生物過程。KEGG通路分析得出癌癥的途徑、HIF-1信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt 信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化等20條與之密切的相關通路。結(jié)論? 白芍通過多靶點、多途徑發(fā)揮其治療非酒精性脂肪性肝病的作用。

關鍵詞：白芍；網(wǎng)絡藥理學；非酒精性脂肪性肝??；作用機制

中圖分類號：R575.5??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1007-2349（2024）04-0024-07

Exploration of the Mechanism of Paeoniae in the Treatment of Non-alcoholicFatty Liver Disease Based on Network Pharmacology

SHI Si1， YANY Mei2， ZHAO Qi2， ZHANG Fei1， LI Kai-yang1， HU Yi1

（1. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550002， China;2. The Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550003， China）

【Abstract】Objective： To explore the mechanism of Paeoniae in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease by using the method of network pharmacology. Methods： The effective components and main component targets of Paeoniae were screened by TCMSP and Swiss Target Prediction database. The target gene of the disease was found? by using Genecards database， and the intersection map of Paeoniae component target and disease target was obtained by Venny2.1 online mapping platform. And then a network of Paeoniae-active-component-target was constructed by Cytoscape3.7.2 software and PPI protein network and DAVID database were constructed by String database to make gene GO analysis and KEGG pathway analysis. Results： A total of 13 effective components， 264 drug target genes， 950 disease target genes and 83 intersection target genes were obtained through screening. The? gene GO analysis showed that Paeoniae was mainly involved in the positive regulation of RNA polymerase II promoter transcription， the negative regulation of apoptosis， protein binding and other biological processes. The KEGG pathway analysis showed 20 closely related pathways， including cancer pathway， HIF-1 signaling pathway， MAPK signaling pathway， PI3K-Akt signaling pathway， lipid and atherosclerosis. Conclusion： Paeoniae exerts its role in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease through multi-target and multi-pathway.

【Key words】 Paeoniae; Network Pharmacology; Nonalcoholic Fatty Liver Disease; Action Mechanism

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是一種以病理特征為肝細胞彌漫性大水泡脂肪改變的臨床綜合征，其疾病譜包括單純性非酒精性脂肪性肝病，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化［1-2］。隨著肥胖和代謝綜合征的日益流行，非酒精性脂肪性肝病NAFLD已取代病毒性肝炎，成為最常見的慢性肝病，并將成為纖維化、肝硬化甚至肝癌的主要原因之一［3-5］。NAFLD的治療方式除了生活方式的改變，如減肥，地中海飲食和體育鍛煉，目前的國際指南只考慮少數(shù)NAFLD特異性藥物治療選擇，如維生素E和吡格列酮等藥物［6］，但西藥療效欠佳，長期用藥可能會產(chǎn)生一些不良反應，而通過對中藥治療NAFLD的臨床和實驗研究總結(jié)可以發(fā)現(xiàn)，中藥及其活性成分可以從抗氧化、抗炎、抗纖維化、改善肝臟脂肪變性和IR等多種途徑來緩解NAFLD［7］。中藥白芍具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗的功效［8］，主要含單萜苷類、三萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類等化學成分，現(xiàn)代藥理研究表明，白芍具有抗炎、保肝、鎮(zhèn)痛、養(yǎng)血等藥理作用［9-10］。本研究主要是通過網(wǎng)絡藥理學研究方法，系統(tǒng)分析白芍治療NAFLD的作用機制。

1? 方法

1.1? 白芍有效成分的收集? 主要通過TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺［11］（https：//tcmsp-e.com/），選擇“Herb name”，將“白芍”作為關鍵詞檢索。點擊口服利用度OB 值≥30%、藥物相似性DL值≥0.18作為藥物主要有效成分篩選條件。

1.2? 白芍靶點的預測及構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖? 將篩選出來的有效成分通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫［12］與Swiss-ADME數(shù)據(jù)庫［13］（swissadmehttp：//www.swissadme.ch/index.php）獲取與之相對應的SMILES號，并上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫［14］預測各化學成分的潛在作用靶點，選擇“Homo sapiens”作為篩選條件得出藥物主要成分的靶點，將預測出的藥物靶點輸入Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫［15］中轉(zhuǎn)化為標準的基因名，并通過繪圖軟件Cytoscape3.7.2［16］構(gòu)建白芍有效成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.3? 白芍治療非酒精性脂肪性肝病的潛在靶點收集? 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫［17］（https：//www.Genecards.org/）以“Non-alcoholic fatty liver disease”作為關鍵詞檢索收集非酒精性脂肪性肝病疾病相關靶點基因。然后將篩選出的白芍靶點基因與非酒精性脂肪性肝病疾病靶點基因輸入Venny 2.1.0（csic.es）（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）中，得出白芍治療非酒精性脂肪性肝病的潛在靶點基因。

1.4? PPI（蛋白間相互作用）網(wǎng)絡的構(gòu)建? 將上述韋恩圖得出的交集基因?qū)雜tring11.5數(shù)據(jù)庫［18］（https：//stringdb.org/）中，將物種選擇為“Homo sapiens”，設置“high confidence”為 0.4，刪除網(wǎng)絡中的單一節(jié)點，構(gòu)建從網(wǎng)絡分析獲得的關鍵蛋白PPI網(wǎng)絡。

1.5? GO分析和KEGG通路分析及靶點-通路網(wǎng)絡的構(gòu)建

DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）數(shù)據(jù)庫［19］匯集了多個功能注釋來源，將白芍與NAFLD的共同靶點錄入DAVID數(shù)據(jù)庫，設置物種與背景為“Homo sapiens”，對核心靶點進行GO及KEGG富集分析（P<0.01），再運用微生信在線平臺（www.bioinformatics.com.cn）將得到的GO、Kegg通路富集分析數(shù)據(jù)進行可視化處理。

2? 結(jié)果

2.1? 白芍的主要有效成分及靶點預測? 根據(jù)OB ≥30%及DL ≥0.18從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出白芍主要有效成分13個，查詢靶點及相關文獻后剔除4個，最終納入有效活性成分9個，見表1。

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2.2? 白芍靶點的預測及構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖? 將白芍9種主要有效成分輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中進行藥物靶點預測，再將其導入 Uniprot 數(shù)據(jù)庫對名稱進行標準化處理，得到去重后的白芍靶點264個，將整理后的白芍靶點表格數(shù)據(jù)輸入Cytoscape軟件，構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖，見圖1。

2.3? 白芍治療非酒精性脂肪性肝病的潛在靶點收集? 以“Non-alcoholic fatty liver disease”作為關鍵詞檢索收集到非酒精性脂肪性肝病疾病相關靶點2090個，篩選出排名較前、可信度高的靶點共950個，將疾病靶點與藥物靶點導入Venny 2.1.0在線作圖工作平臺制作韋恩圖，共得到白芍治療非酒精性脂肪性肝病的潛在靶點83個，見圖2。

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2.4? PPI（蛋白間相互作用）網(wǎng)絡的構(gòu)建? 將白芍治療非酒精性脂肪性肝病的83個潛在靶點導入string11.5數(shù)據(jù)庫制作PPI網(wǎng)絡，PPI網(wǎng)絡中包含83個節(jié)點、邊數(shù)555條及平均節(jié)點度13.4，見圖3。然后將其導入cytoscape軟件，根據(jù)節(jié)點大小篩選出排名靠前10的關鍵靶點，見圖4，通過節(jié)點大小可以分析出AKT1、JUN、PPARG等為關鍵靶點。

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2.5? GO分析和KEGG通路分析及靶點-通路網(wǎng)絡的構(gòu)建? 將白芍治療非酒精性肝病的83個有效靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行分析，物種選擇“HOMO sapiens”（P<0.01），結(jié)果顯示GO富集得到RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、凋亡過程的負調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄負調(diào)控（negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）等10個生物過程（BP），細胞溶質(zhì)（cytosol）、細胞膜（plasma membrane）、細胞核（nucleus）等10個細胞組成（CC），蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合（identical protein binding）、鋅離子結(jié)合（zinc ion binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）等10個分子功能（MF），具體分析見圖5。

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基于DAVID數(shù)據(jù)庫的KEGG富集分析顯示白芍治療非酒精性脂肪性肝病的主要通路為癌癥的途徑（Pathways in cancer）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、化學致癌-活性氧（Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species）、化學致癌-受體激活（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、松弛素信號通路（Relaxin signaling pathway）、癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、PPAR信號通路（PPAR signaling pathway）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、胰島素抵抗（Insulin resistance）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）等通路，具體見圖6，其中癌癥的途徑通路（Pathways in cancer）是包含靶點最多的通路，包含24個靶點。通過KEGG富集通路分析發(fā)現(xiàn)，白芍的有效成分是通過調(diào)控多種生物學途徑發(fā)揮治療NAFLD作用的。

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3? 討論

NAFLD的病因包括過食肥甘、情志失調(diào)、勞逸失度、脾腎虧虛及他病遷延，其病位在肝，與脾腎相關，其病機為肝失疏泄、脾運失健、腎失氣化，導致濕熱內(nèi)蘊，聚而化痰，痰濁阻絡，氣血郁滯，最終痰瘀搏結(jié)痹阻于肝臟脈絡發(fā)為NAFLD，根據(jù)NAFLD的病因病機，可將其歸為“肝痞”“積聚”“痰證”“痰濁”“濕阻”“瘀證”“肥氣”“積證”等范疇［20-21］。白芍苦、酸，微寒，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛，斂陰止汗、平抑肝陽的功效［22］?，F(xiàn)代研究表明［23-24］，白芍具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗腫瘤、抗氧化等功效，其化學成分主要有單萜及其苷類、三萜類、黃酮類等。

本研究通過TMCSP數(shù)據(jù)庫共篩選出芍藥苷、兒茶素、β-谷甾醇、山奈酚等在內(nèi)的白芍核心成分9個。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、降脂、等作用［25］。山奈酚為黃酮醇類化合物具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用，能夠有效防治糖尿病、動脈粥樣硬化和骨質(zhì)疏松，保護神經(jīng)、肝臟和心肌以及抑制蛋白激酶活性［26］。兒茶素及其類似化合物所具有的抗氧化、保護心血管、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護、調(diào)節(jié)糖脂代謝等藥理作用［27］。大量研究證明［28-29］，芍藥苷具有抗抑郁、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝、保護神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)靜催眠等多種藥理作用。

從拓撲分析的關鍵節(jié)點來看，AKT1、JUN、PPARG等為關鍵靶點，表明白芍通過多靶點途徑作用于NAFLD。GO功能分析顯示白芍的活性成分發(fā)揮治療NAFLD作用主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄負調(diào)控等過程，這些成分可能是通過作用在細胞溶質(zhì)、細胞膜、細胞核，從而影響蛋白質(zhì)結(jié)合、鋅離子結(jié)合、酶結(jié)合等分子功能。研究顯示［30-31］，胰島素抵抗與非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，肝細胞凋亡在NAFLD向肝纖維化乃至肝硬化、肝細胞癌進展中扮演著至關重要的角色。KEGG通路分析主要涉及癌癥的途徑、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、化學致癌-活性氧、化學致癌-受體激活、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、松弛素、癌癥中的蛋白聚糖、MAPK、PI3K-Akt、PPAR、IL-17信號通路、雌激素信號通路、Ras、胰島素抵抗、HIF-1等信號通路。Chen J等研究發(fā)現(xiàn)［32］，在缺氧條件下，HIF-2α上調(diào)會導致脂質(zhì)積累和PI3K-AKT-mTOR途徑激活，HIF-2α敲低在脂肪變性HCC中可改善甘油三酯積累和脂肪變性。Donohoe F等通過研究發(fā)現(xiàn)［33］，飲食誘導的肥胖增加了發(fā)生脂肪變性的小鼠中MKP1的肝臟表達，MKP1可能會減少p38和JNK MAPK介導的糖異生基因轉(zhuǎn)錄，以及p38 MAPK介導的CREB磷酸化，這也通過PPARγ促進糖異生，所有這些都可能導致肝臟脂肪生成增加。有文獻表明［34］，AGEs-RAGE軸參與了肝損傷和NAFLD的發(fā)病機制。在近年研究中發(fā)現(xiàn)IL-17參與多種疾病的發(fā)病機制，相關研究已證實了IL-17通過胰島素抵抗、激活肝內(nèi)某些重要通路、介導某些炎癥因等機制參與了脂肪肝及其他相關肝病的發(fā)病過程［35］。

綜上所述，通過對白芍成分進行網(wǎng)絡藥理學分析尋找其中可能發(fā)揮治療NAFLD的潛在靶點，結(jié)果表明白芍對非酒精性脂肪性肝病的治療具有潛在藥用價值，為臨床應用中藥治療NAFLD的可行性提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2023-05-04）