萘酚-苯并噻唑衍生物的合成及其瓊脂糖凝膠對(duì)三文魚(yú)新鮮度雙通道無(wú)損檢測(cè)

趙亞菲，姚 遠(yuǎn)，鐘克利,2,*，孫小飛，李學(xué)鵬，湯立軍,2，勵(lì)建榮,*

（1.渤海大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2.渤海大學(xué)海洋研究院，遼寧 錦州 121013；3.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；4.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

魚(yú)肉具有補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)血脂、改善皮膚狀態(tài)等功效，是餐桌上不可或缺的美食[1]。在眾多魚(yú)類(lèi)中，三文魚(yú)具有肉質(zhì)鮮美、脂肪含量低、富含多種微量元素[2-4]等優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為“水中珍品”。我國(guó)三文魚(yú)多數(shù)以進(jìn)口為主，需要長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸和貯藏才能送達(dá)消費(fèi)者手中，魚(yú)肉長(zhǎng)時(shí)間貯藏會(huì)使微生物大量生長(zhǎng)，其不斷分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生異味[5]，消費(fèi)者誤食不新鮮的魚(yú)肉后會(huì)給身體帶來(lái)?yè)p害，如引起腸胃不適、嘔吐腹瀉，嚴(yán)重的可以造成食物中毒，危及生命[6]。因此，檢測(cè)三文魚(yú)的新鮮度具有重要意義。

魚(yú)肉新鮮度傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方法主要有氣相色譜法[7-9]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[10]、電化學(xué)法[11]等，然而，這些方法涉及大型儀器、操作復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力[12-14]、不適合實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[15]，因此，開(kāi)發(fā)快速、可視化實(shí)時(shí)檢測(cè)魚(yú)肉新鮮度的方法十分必要[16-17]。目前，比色法可以直觀評(píng)價(jià)魚(yú)肉新鮮度，如2020年本課題組以溴酚紅和溴甲酚紫為指示劑制備了一種指示標(biāo)簽，通過(guò)標(biāo)簽對(duì)魚(yú)肉樣品總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的敏感度變化評(píng)價(jià)魚(yú)肉的鮮度[18]。當(dāng)指示標(biāo)簽的內(nèi)圈和外圈顏色均變?yōu)樯钭仙?，表明魚(yú)肉已經(jīng)腐?。?022年，Ding Nan等[19]探索了一種基于銀摻雜普魯士藍(lán)納米顆粒的比色探針，用于檢測(cè)三甲胺和蝦/魚(yú)的新鮮度，當(dāng)探針顏色由藍(lán)色變?yōu)闊o(wú)色，表明魚(yú)肉已腐??；2023年，Said等[20]將姜黃素與明膠復(fù)合制備的比色膜用于魚(yú)片的新鮮度檢測(cè)，膜的顏色由黃色變?yōu)槌燃t色，表明魚(yú)肉由新鮮變?yōu)楦瘮??？梢?jiàn)，這種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、無(wú)損的比色探針在魚(yú)肉鮮度指示方面具有一定的應(yīng)用前景。但是，已報(bào)道的比色探針中也存在顏色變化不顯著，魚(yú)肉在合格與腐敗之間可視化區(qū)分不明顯，進(jìn)而導(dǎo)致品質(zhì)誤判的情況發(fā)生，因此，需要開(kāi)發(fā)新方法彌補(bǔ)單通道比色法的不足。

熒光法由于靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為檢測(cè)生物活性分子的有效方法之一[21-25]。將熒光法與比色法結(jié)合，開(kāi)發(fā)對(duì)揮發(fā)胺比色和熒光雙響應(yīng)的探針對(duì)魚(yú)肉新鮮度雙通道指示，可提升評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2022年，Liu Xiuying等[26]開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)三文魚(yú)新鮮度的比率熒光傳感標(biāo)簽，當(dāng)標(biāo)簽顏色從粉色變?yōu)樯钏{(lán)色，熒光由粉紅色變?yōu)樗{(lán)色，表明三文魚(yú)魚(yú)肉由新鮮變?yōu)楦瘮。p通道顏色明顯變化可準(zhǔn)確辨別魚(yú)肉所處鮮度等級(jí)。2023年，Zhang Jin等[27]基于間苯二酚開(kāi)發(fā)了一種雙通道智能標(biāo)簽，當(dāng)標(biāo)簽顏色從無(wú)色到粉紅色，并伴有強(qiáng)烈的紅色熒光時(shí)，表明魚(yú)蝦由新鮮變?yōu)楦瘮?，這種標(biāo)簽在實(shí)時(shí)顯示新鮮度方面具有較好的應(yīng)用潛力。可見(jiàn)，開(kāi)發(fā)能夠比色和對(duì)胺敏感的熒光探針，可構(gòu)建新鮮度雙通道指示標(biāo)簽，其具有更好的應(yīng)用前景[28-29]。

本研究旨在構(gòu)建一種新穎的熒光探針萘酚-苯并噻唑衍生物（naphthol-benzothiazole derivative，HBO），利用該分子中酚羥基具有給電子性質(zhì)，苯并噻唑磺酸鹽具有吸電子性質(zhì)，通過(guò)雙鍵連接后形成給體-π-受體結(jié)構(gòu)，這種延長(zhǎng)的共軛體系可使HBO的發(fā)射波長(zhǎng)增大，同時(shí)磺酸鹽還可增加HBO的水溶性。此外，HBO中萘環(huán)上的酚羥基具有酸性，可以與魚(yú)肉腐敗過(guò)程中產(chǎn)生的多數(shù)胺發(fā)生反應(yīng)，失去氫質(zhì)子后，形成的氧負(fù)離子具有更好的給電子能力，使分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移更容易發(fā)生，因此，HBO識(shí)別胺后會(huì)表現(xiàn)出明顯的顏色和熒光變化。最后，以凝膠為固體載體，通過(guò)混合法制備負(fù)載熒光探針HBO的傳感凝膠用于魚(yú)肉新鮮度檢測(cè)，以期為熒光探針在食品檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮三文魚(yú)購(gòu)于錦州市林西路水產(chǎn)市場(chǎng)，平均質(zhì)量（2 500±50）g。

6-羥基-2-萘醛、2-甲基苯并噻唑、瓊脂糖、氧化鎂、哌啶購(gòu)自上海安耐吉化學(xué)有限公司，無(wú)需純化直接使用；化合物4a按照文獻(xiàn)[30]合成；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水；其他所用試劑均購(gòu)自天津永大公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY1200電子天平 德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；FSH-2高速均質(zhì)機(jī) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Kjeltec 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀 上海浦予工業(yè)科技有限公司；400 MH核磁共振儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；F-4700熒光分光光度計(jì) 鄭州今時(shí)邁科技有限公司；U-T1810DS紫外分光光度計(jì) 上海屹譜儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 探針HBO的合成

向圓底燒瓶中加入化合物4 a（406.5 mg，1.5 mmol）、6-羥基-2-萘甲醛（172 mg，1 mmol）無(wú)水乙醇（5 mL）和0.08 mL哌啶，回流過(guò)夜。將析出的固體過(guò)濾，用冰乙醇洗滌3 次，得到棕黃色固體HBO（310 mg，73%）。1H NMR（400 MHz，氘代二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6））δ10.31（s，1H），8.46～8.21（m，6H），7.91～7.77（m，4H），7.22～7.17（m，2H），5.12（t，J＝8.0 Hz，2H），2.69～2.67（m，2H），2.23（s，2H）。高分辨質(zhì)譜（正離子模式），分子式C22H19NO4S2[M+H]+，計(jì)算值：426.082 8，實(shí)測(cè)值：426.083 9。探針HBO的合成和傳感凝膠HBO瓊脂糖凝膠（HBO agarose gel，HBOAL）的制備方法如圖1所示。

圖1 探針HBO和傳感凝膠HBOAL的制備方法Fig.1 Preparation methods for HBO and HBOAL

1.3.2 胺溶液的配制

測(cè)試所用不同胺溶液均用蒸餾水配制成50 mmol/L，以異丙胺為例，取異丙胺29.5 mg，振蕩溶解后定容至10 mL容量瓶，即為50 mmol/L的異丙胺溶液。其他胺溶液（環(huán)己二胺、二乙胺、正丙胺、異丙胺、三乙胺、乙胺、精胺、尸胺、腐胺、2-苯乙胺、酪胺、色胺）用相同方法配制，測(cè)試所用其他濃度用蒸餾水稀釋即可。

1.3.3 探針HBO溶液的配制

稱(chēng)量4.3 mg HBO固體，用DMSO溶解并定容到10 mL容量瓶中，即得到所需的1 mmol/L的HBO儲(chǔ)備液，吸取1 mL至100 mL容量瓶中，用EtOH/H2O（1∶9，V/V）的混合溶液定容于100 mL，得到濃度為10 μmol/L的HBO溶液，用于測(cè)試。熒光測(cè)試的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，電壓為700 V，激發(fā)波長(zhǎng)為430 nm。

1.3.4 傳感凝膠HBOAL的制備

將0.3 g瓊脂糖溶解于15 mL蒸餾水中，加入0.2 mL甘油，將混合溶液在攪拌下加熱至澄清透明，冷卻至60 ℃時(shí)，將0.01 g HBO固體用2 滴DMSO溶解后，迅速加入到瓊脂糖溶液中，繼續(xù)攪拌至混合均勻，然后將混合液快速倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，氣泡用玻璃棒趕至培養(yǎng)皿邊緣，用滴管吸出。瓊脂糖溶液冷卻至室溫后凝固成塊，將其分割成直徑為1 cm的傳感凝膠HBOAL，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 魚(yú)肉樣品TVB-N和pH值的測(cè)定

室溫條件下將5 g魚(yú)肉樣品用絞肉機(jī)絞碎，加入35 mL蒸餾水，用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)5 min。靜置30 min后過(guò)濾，取其上層清液用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定TVB-N值，用pH計(jì)測(cè)定pH值，所有操作重復(fù)3 次。

1.3.6 傳感凝膠HBOAL對(duì)魚(yú)肉新鮮度的檢測(cè)

購(gòu)買(mǎi)的冰鮮三文魚(yú)快速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，去除三文魚(yú)表皮，將魚(yú)肉切成質(zhì)量為10 g的測(cè)試樣品，放入一次性培養(yǎng)皿中，用帶孔的薄膜密封，將傳感標(biāo)簽HBOAL置于孔隙處，蓋上頂蓋并用皮筋固定。在4 ℃條件下貯藏，每隔24 h取出魚(yú)肉樣品測(cè)試其TVB-N值、pH值，并拍照記錄傳感凝膠的顏色。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，使用Origin 2021軟件繪圖，采用華為Nova7拍攝照片。

2 結(jié)果與分析

2.1 探針HBO對(duì)不同胺的紫外-可見(jiàn)和熒光光譜分析

為了探究HBO對(duì)不同胺是否有比色和熒光響應(yīng)，進(jìn)行紫外-可見(jiàn)和熒光光譜測(cè)試。紫外吸收光譜如圖2a所示，探針HBO（10 μmol/L）的EtOH/H2O（1∶9，V/V）溶液在425 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)強(qiáng)吸收，向HBO溶液中加入不同胺溶液后，最大吸收峰紅移至535 nm，溶液顏色由淺黃色變?yōu)榉凵▓D3a）。在430 nm波長(zhǎng)的激發(fā)下，探針HBO溶液（10 μmol/L）在605 nm波長(zhǎng)處有微弱熒光，向HBO溶液中加入不同胺溶液后，在545 nm波長(zhǎng)處均表現(xiàn)出一定程度的熒光增強(qiáng)且發(fā)射峰藍(lán)移（圖2b），伴隨著熒光顏色由弱熒光變?yōu)椴煌伾膹?qiáng)熒光（圖3b），這些結(jié)果表明，探針HBO對(duì)不同胺溶液有較好的比色和熒光響應(yīng)。

圖2 探針HBO（10 μmol/L）的EtOH/H2O（1∶9，V/V）溶液加入不同胺溶液的紫外吸收光譜（a）和熒光光譜（b）Fig.2 UV absorption spectra (a) and fluorescence spectra (b) of HBO(10 μmol/L) in EtOH/H2O (1:9,V/V) solution added with different amine solutions

圖3 HBO溶液中加入不同胺溶液后的顏色變化Fig.3 Color changes of HBO solution after adding different amine solutions

2.2 探針HBO在不同pH值條件下的紫外吸收光譜和熒光光譜分析

如圖4a 所示，在pH 5～7 范圍內(nèi)，HBO 溶液（10 μmol/L）在430 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化不大，而pH值由8增大至10時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)變?yōu)?05 nm，且吸收強(qiáng)度不斷增強(qiáng)。HBO溶液的熒光強(qiáng)度（595 nm）在pH 5～10范圍內(nèi)不斷減弱（圖4b），在pH 5～7范圍內(nèi)減弱程度相對(duì)較小，結(jié)合紫外吸收譜圖，pH值在5～7范圍內(nèi)HBO受pH值影響較小，說(shuō)明探針HBO在只能在微酸性條件下使用。

圖4 HBO（10 μmol/L）的EtOH/H2O（1∶9，V/V）溶液在不同pH值條件下的紫外吸收光譜（a）和熒光光譜（b）Fig.4 UV absorption spectra (a) and fluorescence spectra (b) of HBO(10 μmol/L) in EtOH/H2O (1:9,V/V) solution at different pH conditions

2.3 探針HBO識(shí)別胺的靈敏度及響應(yīng)時(shí)間

如圖5a所示，向HBO溶液（10 μmol/L）中加入不同濃度（0～250 μmol/L）的精胺，HBO溶液的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并且熒光強(qiáng)度與精胺濃度在40～240 μmol/L范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系（R2＝0.994，圖5a內(nèi)插圖），利用公式（檢出限（limit of detection，LOD）＝3S/K（S為空白樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差；K為熒光強(qiáng)度與精胺濃度線性關(guān)系的斜率））計(jì)算出HBO的LOD為0.4 μmol/L，表明HBO檢測(cè)精胺具有較好的靈敏度。另外，向HBO溶液（10 μmol/L）中加入250 μmol/L的精胺，其熒光強(qiáng)度（545 nm波長(zhǎng)處）隨時(shí)間的變化結(jié)果如圖5b所示。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，HBO熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在75 s后達(dá)到平衡，說(shuō)明HBO對(duì)胺有較快的識(shí)別響應(yīng)速率，為實(shí)現(xiàn)快速實(shí)時(shí)檢測(cè)魚(yú)肉新鮮度奠定了基礎(chǔ)。

圖5 HBO（10 μmol/L）的EtOH/H2O（1∶9，V/V）溶液識(shí)別精胺的靈敏度及響應(yīng)時(shí)間Fig.5 Sensitivity and response time of spermine recognition by HBO(10 μmol/L) in EtOH/H2O (1:9,V/V) solution

2.4 探針HBO的細(xì)胞毒性及對(duì)精胺的細(xì)胞成像

將不同濃度（1、5、10、30、50 μmol/L）的HBO溶液與MCF-7細(xì)胞共同培育24 h后，即使HBO濃度為30 μmol/L時(shí)，細(xì)胞成活率仍接近80%，說(shuō)明HBO具有較低的毒性（圖6a），可應(yīng)用到生物體系中。將MCF-7細(xì)胞與HBO共同孵育30 min后，向其中加入不同濃度的精胺（100、200、500 μmol/L），在37 ℃條件下繼續(xù)孵育30 min，隨著精胺濃度的增加，在紅色及綠色通道中可觀察到熒光強(qiáng)度均逐漸增強(qiáng)（圖6b），表明探針HBO能夠穿透細(xì)胞膜，在細(xì)胞中對(duì)胺化合物進(jìn)行熒光成像。

圖6 HBO的細(xì)胞毒性及其在活細(xì)胞中對(duì)精胺的熒光成像Fig.6 Cytotoxicity of HBO and its fluorescence images in living cells exposed to spermine

2.5 真實(shí)魚(yú)肉樣品檢測(cè)

根據(jù)GB/T 18108—2019《鮮海水魚(yú)通則》規(guī)定，海水魚(yú)中TVB-N最高限量為30 mg/100 g。當(dāng)樣品TVB-N值≤15 mg/100 g時(shí)為優(yōu)級(jí)，15 mg/100 g＜TVB-N值≤30.0 mg/100 g時(shí)為合格，TVB-N值＞30.0 mg/100 g時(shí)為不合格。為了探究傳感凝膠HBOAL的顏色與三文魚(yú)新鮮度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，將HBOAL與三文魚(yú)魚(yú)肉在4 ℃貯藏，測(cè)定TVB-N值和pH值，結(jié)果如圖7a所示。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，符合魚(yú)肉微生物分解劣變趨勢(shì)。TVB-N值從起始的（7.00±0.06）mg/100 g整體呈上升趨勢(shì)，在第4天達(dá)到（15.10±1.20）mg/100 g，表明此時(shí)魚(yú)肉樣品合格；在第8天達(dá)到（30.30±0.06）mg/100 g，表明此時(shí)魚(yú)肉樣品已腐敗。同時(shí)，記錄HBOAL在不同時(shí)間的顏色變化，結(jié)果如圖7b所示。當(dāng)魚(yú)肉新鮮時(shí)，傳感凝膠日光顏色為暗粉色，熒光顏色為藍(lán)色。第4～7天魚(yú)肉處于合格狀態(tài)時(shí)，HBOAL的日光顏色變?yōu)闇\粉色，熒光顏色變?yōu)榫G色。第8天后魚(yú)肉腐敗，HBOAL日光顏色變?yōu)闇\紅色，熒光顏色為黃色，由此建立了HBOAL顏色與三文魚(yú)魚(yú)肉新鮮度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖7 4 ℃貯藏條件下三文魚(yú)魚(yú)肉的pH值和TVB-N值隨貯藏時(shí)間的變化（a）及HBOAL在日光和熒光下的顏色隨貯藏時(shí)間的變化（b）Fig.7 Changes in TVB-N and pH of salmon fish with storage time (a),and changes in HBOAL color under daylight and fluorescence (b) during storage at 4 ℃

最后，根據(jù)三文魚(yú)新鮮度與傳感凝膠HBOAL顏色之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，制作了標(biāo)準(zhǔn)比色卡（圖8）。將HBOAL與魚(yú)肉4 ℃條件下共同貯藏，監(jiān)測(cè)HBOAL顏色變化，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)比色卡判斷魚(yú)肉的新鮮程度等級(jí)，結(jié)果如圖9所示。HBOAL在日光下為暗粉色，在熒光下為藍(lán)色時(shí)，表明三文魚(yú)肉為新鮮狀態(tài)；HBOAL在日光下為淺粉色，在熒光下為綠色熒光時(shí)，表明三文魚(yú)肉處于合格狀態(tài)；HBOAL在日光下變成淺紅色，在熒光下變成黃色時(shí)說(shuō)明三文魚(yú)肉已腐敗，這些結(jié)果表明HBOAL可通過(guò)日光和熒光雙通道響應(yīng)，準(zhǔn)確判斷三文魚(yú)魚(yú)肉所處的鮮度等級(jí)。消費(fèi)者可根據(jù)HBOAL的變色情況及時(shí)判斷魚(yú)肉的新鮮程度，在生鮮、肉類(lèi)市場(chǎng)具有較好的應(yīng)用潛力，同時(shí)也為食品智能標(biāo)簽的研究提供一定的理論參考依據(jù)。

圖8 傳感凝膠HBOAL的標(biāo)準(zhǔn)比色卡Fig.8 Standard colorimetric cards of HBOAL

圖9 4 ℃貯藏條件下傳感凝膠HBOAL監(jiān)測(cè)三文魚(yú)魚(yú)肉新鮮度的顏色變化及評(píng)定的鮮度等級(jí)Fig.9 Monitoring of color changes indicating salmon freshness and freshness classification by HBOAL under 4 ℃ storage condition

3 結(jié)論

本研究基于萘酚合成的熒光探針HBO在EtOH/H2O（1∶9，V/V）體系中可對(duì)12 種胺快速響應(yīng)（75 s），對(duì)精胺有較低的LOD（0.4 μmol/L），并可在活細(xì)胞中對(duì)精胺進(jìn)行熒光成像?；贖BO構(gòu)建的傳感凝膠成功應(yīng)用于三文魚(yú)魚(yú)肉新鮮度的檢測(cè)，HBOAL在日光下由暗粉色變成淺紅色，在熒光下由綠熒光變成黃熒光，表明魚(yú)肉由新鮮變?yōu)楦瘮?，?shí)現(xiàn)了比色和熒光雙通道指示。這種無(wú)損、雙通道可視化判定魚(yú)肉鮮度等級(jí)的方法可為商家和消費(fèi)者提供及時(shí)有效的新鮮度信息，具有較好的應(yīng)用前景。