基于體溫?cái)U(kuò)增的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種3 種可視化快速檢測(cè)方法的建立

林志偉，王 帥，蔡 杰，聶丹丹，李 濤，李紅娜，楊艷歌,*，袁 飛,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163000；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品質(zhì)量與安全），北京 100176；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163000；4.長(zhǎng)春海關(guān)技術(shù)中心，吉林 長(zhǎng)春 130062）

唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病菌（Burkholderia gladiolipv.cocovenenans）是唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderiagladioli）中一個(gè)能夠分泌米酵菌酸和毒黃素的致病變種[1-3]，又稱椰毒假單胞菌酵米面亞種、椰酵假單胞菌[4-6]。常被唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病菌污染的食物有變質(zhì)的谷物、濕淀粉、銀耳和木耳等，由該菌引起的食物中毒會(huì)導(dǎo)致呼吸循環(huán)衰竭、腦血腫和尿毒癥等癥狀[7-10]。近年來(lái)，因誤食用被唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種污染食品引發(fā)的中毒事件頻繁發(fā)生[11]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2005—2020年，我國(guó)共報(bào)道唐菖蒲伯克霍爾德氏菌中毒事件30 起，中毒188 例，死亡85 例，病死率為45.21%；其中較大級(jí)別事件占事件總數(shù)的93.33%，病死率53.13%[12]，是迄今為止我國(guó)發(fā)現(xiàn)死亡率最高的食源性致病菌。

目前唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的檢測(cè)方法有培養(yǎng)法[13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-17]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法[18-19]等。其中GB 4789.29—2020《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）檢驗(yàn)》[13]規(guī)定的方法是最經(jīng)典的鑒定方法，但該方法需要經(jīng)過(guò)初篩、生化鑒定，并且需要聯(lián)合GB 5009.189—2016《食品中米酵菌酸的測(cè)定》[20]進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)定，操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，需要11～12 d才可作出判定結(jié)果。質(zhì)譜法、數(shù)字PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR法能夠有效縮短檢測(cè)時(shí)間，但仍存在儀器昂貴、需要豐富操作經(jīng)驗(yàn)的人員測(cè)定等問(wèn)題，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和不發(fā)達(dá)地方檢測(cè)。酶促等溫?cái)U(kuò)增（enzymatic recombinase amplification，ERA）是2019年研發(fā)的一種新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[21]，可替代PCR技術(shù)。ERA與PCR技術(shù)一樣具有特異性，但速度更快，通常在7～10 min即可將核酸模板擴(kuò)增到可以檢出的水平；且ERA不需要熱變性，因此不需要昂貴的熱循環(huán)設(shè)備。另外，ERA比其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)所需要的溫度低，在37～42 ℃條件下即可完成痕量DNA/RNA區(qū)段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，因此又被稱為體溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能在廣泛的環(huán)境溫度下應(yīng)用[22-24]。

本研究根據(jù)唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病型菌株Co14的產(chǎn)毒基因bonM，設(shè)計(jì)并篩選能夠高效檢測(cè)唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的特異性高靈敏ERA引物和探針，依托便攜式實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）儀，結(jié)合顯色劑或試紙條，分別建立顯色法、熒光法和試紙條法3 種ERA現(xiàn)場(chǎng)可視化快速檢測(cè)技術(shù)，以期為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的快速篩查和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供良好的技術(shù)方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用菌分別來(lái)源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）、美國(guó)菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）和中國(guó)檢驗(yàn)檢疫微生物菌種保藏管理中心（Inspection and Quarantine Culture Collections，IQCC），信息詳見表1。市售食品樣品采購(gòu)于2 個(gè)北京的超市。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株信息Table 1 Information of the strains used in this study

GVC增菌液、改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂（modified potato dextrose agar，mPDA）青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；腦心浸液肉湯（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA）培養(yǎng)基 英國(guó)Oxoid公司；PrepManTMUltra樣品制備試劑 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA法）、熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA法）、試紙型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA法）、側(cè)向流檢測(cè)試紙條 蘇州先達(dá)基因科技有限公司；1 000×SYBR Green I 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

便攜式real-time PCR儀 艾濟(jì)遺傳（北京）科技有限公司；Pico 17離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；D1008E掌上離心機(jī) 美國(guó)Scilogex公司；BioSpec-nano紫外-可見分光光度儀 日本島津公司；高壓滅菌鍋 以色列Tuttnauer公司；VORTEX 3渦旋混合器 德國(guó)IKA公司；DH-420電熱恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 引物來(lái)源

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載B.gladiolipv.cocovenenanCo14的bonM基因（序列號(hào)：CP033430.1），通過(guò)序列比對(duì)，設(shè)計(jì)唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種特異性ERA引物和探針，并由北京六合華大基因科技有限公司合成，信息見表2。

表2 引物探針序列信息Table 2 Information of the primers and probes

1.3.2 菌種培養(yǎng)及基因組DNA提取

將表1唐菖蒲伯克霍爾德氏菌接種到GVC增菌液中，其他菌株接種到BHI培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液于1.5 mL離心管中16 000×g離心2 min，去上清液，加入100 μL PrepManTMUltra提取液，混勻后100 ℃金屬浴放置5 min，冷卻后16 000×g離心2 min，取上清液50 μL即為DNA模板，采用紫外-可見分光光度儀測(cè)其濃度后于-20 ℃保存。

1.3.3 反應(yīng)體系與檢測(cè)程序

顯色法反應(yīng)體系參照基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA法）使用說(shuō)明書制備，DNA模板質(zhì)量濃度10 ng/μL，體積均為1 μL（熒光法和試紙條法同）。37 ℃恒溫反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后取25 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V），振蕩混勻后充分離心，上清液用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。其余擴(kuò)增產(chǎn)物加入2 μL 1 000×SYBR Green I觀察顯色情況。

熒光法反應(yīng)體系參照熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA法）使用說(shuō)明書制備，便攜式real-time PCR儀反應(yīng)程序：第1階段37 ℃、1 s；第2階段37 ℃、14 s，共40 個(gè)循環(huán)，第2階段進(jìn)行熒光信號(hào)收集。

試紙條法反應(yīng)體系參照試紙型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA法）使用說(shuō)明書制備，反應(yīng)程序：37 ℃恒溫反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物至1.5 mL離心管，用純水稀釋25 倍；取出試紙條（不要觸碰硝酸纖維素膜），插入離心管中，待試紙條被液體完全浸濕，根據(jù)控制帶和檢測(cè)帶的顯色情況判讀結(jié)果。

1.3.4 引物探針篩選

ERA引物和探針的篩選是開發(fā)靈敏快速的ERA檢測(cè)方法的關(guān)鍵，因此設(shè)計(jì)多組引物探針組合（表2），以表1中3 株唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的基因組DNA作為模板，對(duì)設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行篩選，顯色法6 種引物組合為F1/R1-1、F1/R1-2、F2-1/R2-1、F2-1/R2-2、F2-2/R2-1、F2-2/R2-2。熒光法和試紙條法引物探針篩選采用上述擴(kuò)增效果好的引物分別與熒光探針或試紙條探針組合。選擇特異性好且擴(kuò)增效率高的引物和探針組合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有樣品的基因組DNA質(zhì)量濃度均為10 ng/μL，每個(gè)樣品2 個(gè)平行重復(fù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.5 特異性檢測(cè)

分別以B.gladiolipv.cocovenenanCICC 25108為代表菌株、以唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的其他致病型菌株（CGMCC 1.2892、CGMCC 1.3360）及其他種屬10 株菌株的基因組DNA作為模板進(jìn)行ERA反應(yīng)，對(duì)篩選的引物和探針特異性進(jìn)行檢測(cè)。所有樣品的基因組DNA質(zhì)量濃度均為10 ng/μL，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.6 靈敏度檢測(cè)

為進(jìn)一步分析建立的ERA顯色法、熒光法和試紙條法的靈敏度，以B.gladiolipv.cocovenenanCICC 25108為代表菌株，將其基因組DNA分別稀釋至101、100、10-1、10-2、10-3ng/μL，按照1.3.3節(jié)反應(yīng)程序進(jìn)行靈敏度分析，每個(gè)樣品2 個(gè)平行重復(fù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.7 市售樣品檢測(cè)

對(duì)15 份食品樣品，種類包括面條、湯圓、餃子、燒麥、粉絲、木耳、銀耳，按GB 4789.29—2020[13]的步驟進(jìn)行樣品前處理，加入GVC增菌液中培養(yǎng)24 h，采用1.3.2節(jié)的方法進(jìn)行基因組DNA提取。分別用本研究建立的ERA顯色法、熒光法和試紙條法進(jìn)行檢測(cè)，以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，每個(gè)樣品2 個(gè)平行重復(fù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。采用GB 4789.29—2020[13]檢驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行生化鑒定和米酵菌酸毒性成分檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

電泳結(jié)果有明顯的目的條帶，且顯色結(jié)果為綠色，則為檢出靶標(biāo)菌核酸成分，如無(wú)明顯的目的條帶或顯色結(jié)果為橙色，則為未檢出靶標(biāo)菌核酸成分。從擴(kuò)增儀導(dǎo)出擴(kuò)增圖譜和檢測(cè)數(shù)據(jù)，如有典型擴(kuò)增曲線，且有檢出數(shù)據(jù)，則為檢出靶標(biāo)菌核酸成分，若無(wú)報(bào)告值或無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則為未檢出靶標(biāo)菌核酸成分。試紙條控制帶與檢測(cè)帶都出現(xiàn)明顯的條帶，為檢出靶標(biāo)菌核酸成分；只有控制帶出現(xiàn)條帶，則未檢出靶標(biāo)菌核酸成分；控制帶沒有出現(xiàn)條帶，判定檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。

2 結(jié)果與分析

2.1 ERA檢測(cè)引物探針篩選結(jié)果

2.1.1 顯色法引物篩選結(jié)果

傳統(tǒng)基礎(chǔ)型E R A 分析需采用電泳檢測(cè)和凝膠呈像，為滿足現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè)的需求，前期研究對(duì)中性紅、羥基萘酚藍(lán)、苯酚紅、鈣黃綠素和1 000×SYBR Green I 5 種顯色劑在ERA反應(yīng)中的顯色效果進(jìn)行比較，確定了用SYBR Green I作為顯色法的顯色劑。本實(shí)驗(yàn)以菌株B.gladiolipv.cocovenenanCICC 25108 DNA為模板對(duì)6 種組合的基礎(chǔ)型ERA引物進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示F2-2/R2-1引物組合的擴(kuò)增效果最好（圖1），因此初步擬定其作為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種基礎(chǔ)型顯色法ERA候選引物。

圖1 顯色法引物篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of primers for chromogenic method

2.1.2 熒光法引物探針篩選結(jié)果

在上述擴(kuò)增效果較好的基礎(chǔ)型引物靶序列區(qū)域設(shè)計(jì)了熒光探針P1和P2，形成4 組ERA熒光法引物探針組合：F1/R1-1/P1、F1/R1-2/P1、F2-2/R2-1/P2和F2-2/R2-2/P2，進(jìn)行擴(kuò)增效果分析。結(jié)果顯示，4 組引物探針均能擴(kuò)增3 種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種，但F1/R1-1/P1的熒光強(qiáng)度最低（圖2A），其他3 組熒光強(qiáng)度差異不大（圖2B、C、D），其中F2-2/R2-1/P2引物探針組合的擴(kuò)增效果最好（圖2C），起峰時(shí)間較其他2 組早，因此初步以F2-2/R2-1/P2作為熒光法ERA檢測(cè)的候選引物探針組合。

圖2 熒光法引物探針篩選結(jié)果Fig.2 Screening results of primers and probes for fluorescence method

2.1.3 試紙法引物探針篩選結(jié)果

為建立ERA試紙條法，以FAM-生物素報(bào)告基因進(jìn)行免疫層析檢測(cè)，并設(shè)計(jì)4 種組合的試紙條引物探針：F1/R1-1/P1-試紙條、F1/R1-2/P1-試紙條、F2-2/R2-1/P2-試紙條、F2-2/R2-2/P2-試紙條，對(duì)其檢測(cè)效果進(jìn)行了篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1/R1-2/P1-試紙條引物探針組合無(wú)法檢出B.gladiolipv.cocovenenanCICC 25132（圖3B），F(xiàn)2-2/R2-1/P2-試紙條引物探針組合對(duì)空白對(duì)照檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)弱帶（圖3C），F(xiàn)1/R1-1/P1-試紙條和F2-2/R2-2/P2-試紙條引物探針組合對(duì)3 種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種均有擴(kuò)增（圖3A、D），但F2-2/R2-2/P2-試紙條較F1/R1-1/P1-試紙條的顯色較強(qiáng)，因此初步以其用于后續(xù)ERA試紙法檢測(cè)的引物探針。

圖3 試紙條法引物探針篩選結(jié)果Fig.3 Screening results of primers and probes for test strip method

2.2 特異性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)初步篩選的顯色法、熒光法、試紙條法檢測(cè)的引物和探針進(jìn)一步進(jìn)行特異性分析，檢測(cè)結(jié)果顯示僅B.gladiolipv.cocovenenanCICC 25108為陽(yáng)性，而唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的其他菌株（CGMCC 1.2892、CGMCC 1.3360）及其他常見的10 株食源性致病菌檢測(cè)均為陰性（圖4），表明篩選的引物和探針對(duì)唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種具有良好的特異性。

圖4 引物探針特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Specificity evaluation of primers and probes

2.3 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

如圖5所示，除模板質(zhì)量濃度為10-3ng/μL的實(shí)驗(yàn)組沒有檢出外，其他質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)均為陽(yáng)性。因此，本實(shí)驗(yàn)建立的ERA顯色法、熒光法、試紙條法檢測(cè)檢出限均為10-2ng/μL，靈敏度較好。

圖5 3 種ERA可視化快速檢測(cè)方法靈敏度分析結(jié)果Fig.5 Sensitivity analysis of three ERA-based rapid visual detection methods

2.4 市售樣品檢測(cè)

如表3所示，15 種市售食品樣品中有2 個(gè)湯圓樣品檢測(cè)出唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種，檢出率為13.3%，且建立的ERA顯色法、熒光法、試紙條法檢測(cè)結(jié)果與GB 4789.29—2020方法的檢測(cè)結(jié)果一致，生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合且檢出米酵菌酸毒性成分。證實(shí)了本研究建立的3 種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種ERA可視化快速檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

表3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of detection of actual samples

3 討論

PCR法是替代傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行菌種鑒定的有力手段，而靶基因的選擇是保證PCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵因素之一。目前基于PCR技術(shù)對(duì)唐菖蒲伯克霍爾德氏菌進(jìn)行鑒定的研究中有選用16S～23S rRNA基因[19,25]，也有選用bonM[26]產(chǎn)毒基因。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌存在多種致病型，選用16S～23S rRNA基因序列難以將椰毒致病型與其他致病型進(jìn)行較好的區(qū)分，而bonM基因是米酵菌酸毒素合成所必需的基因[27]，是準(zhǔn)確檢測(cè)唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病型的良好選擇。本研究以唐菖蒲伯克霍爾德菌椰毒致病型菌株Co14[28]的bonM基因?yàn)榘谢?，分別篩選了顯色法、熒光法和試紙條法3 種ERA方法最適的引物探針。在篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，引物F2-2/R2-1以及與探針P2的組合在顯色法和熒光法檢測(cè)中的擴(kuò)增效率最高。然而該組合采用試紙條法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，空白對(duì)照會(huì)出現(xiàn)弱陽(yáng)性，這可能與試紙條的靈敏度更強(qiáng)有關(guān)，或者是因?yàn)榭瞻捉M產(chǎn)生的弱陽(yáng)性熒光信號(hào)值過(guò)低，導(dǎo)致熒光儀將其識(shí)別為噪音信號(hào)，閾值線設(shè)定稍高，將其判定為陰性。因此，在建立ERA顯色法、熒光法和試紙條法的過(guò)程中，所篩選的引物和探針并非是完全通用的，還要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

與PCR技術(shù)相比，ERA檢測(cè)技術(shù)在無(wú)需變溫設(shè)備的基礎(chǔ)上，反應(yīng)時(shí)間更短且檢測(cè)靈敏度與PCR技術(shù)相同[29-32]。本研究彌補(bǔ)了利用ERA技術(shù)進(jìn)行唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種可視化快速檢測(cè)報(bào)道的缺失，同時(shí)為便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，分別建立了顯色法、熒光法和試紙條法3 種快速篩查方法，裸眼即可直接對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，且在37 ℃的體溫下即可反應(yīng)，因此顯色法和試紙條法可在手心或者腋窩下10～20 min完成擴(kuò)增，也可采用項(xiàng)目組前期研究使用的熱帖[33]進(jìn)行反應(yīng)，解決對(duì)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備依賴的問(wèn)題，并能快速判斷致病菌的有無(wú)。而熒光法僅需依托便攜式real-time PCR儀或熒光等溫?cái)U(kuò)增儀即可完成檢測(cè)，可快速對(duì)致病菌的含量進(jìn)行半定量，還可以進(jìn)行多重檢測(cè)。本研究可為食源性致病微生物的可視化快速檢測(cè)提供一種新的思路。

4 結(jié)論

本研究以唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的米酵菌酸生物合成基因簇中的bonM基因序列為靶點(diǎn)，通過(guò)對(duì)關(guān)鍵致病菌靶基因序列的比對(duì)分析，分別設(shè)計(jì)了高特異性、高靈敏度的ERA基礎(chǔ)型檢測(cè)引物，以及熒光法和顯色法檢測(cè)探針，并通過(guò)對(duì)其特異性、靈敏度分析，分別建立了顯色法、熒光法和試紙條法3 種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種現(xiàn)場(chǎng)可視化快速檢測(cè)方法。本研究建立的方法從DNA提取到檢測(cè)結(jié)果完成僅需30 min左右，對(duì)其他唐菖蒲伯克霍爾德氏致病型以及常見的食源性致病菌無(wú)任何交叉，靈敏度可達(dá)為10－2ng/μL，具有特異性好、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、現(xiàn)場(chǎng)可視等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可為食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的快速鑒別、溯源和檢測(cè)開辟新的途徑。