獼猴桃果實(shí)后熟軟化過程中己糖激酶基因的表達(dá)分析

董文娟，陳 明，向妙蓮，陳金印，曾教科

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西省果蔬保鮮與無(wú)損檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

獼猴桃（ActinidiachinensisPlanch.）原產(chǎn)自中國(guó)，其在中國(guó)種植面積和產(chǎn)量均穩(wěn)居世界第一位，素有“VC之王”之稱[1-3]。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實(shí)，采后生理代謝旺盛，伴隨果實(shí)快速軟化，商品性喪失。應(yīng)用保鮮技術(shù)可延緩獼猴桃后熟軟化，但消費(fèi)者購(gòu)買后往往無(wú)法即食，果實(shí)硬度較高、口感酸澀，放至完全軟化則易腐爛，這已成為獼猴桃產(chǎn)業(yè)采后貯運(yùn)最為突出的問題[4]。因此，加深獼猴桃果實(shí)后熟軟化生理機(jī)制的研究，對(duì)促進(jìn)獼猴桃綠色保鮮技術(shù)的開發(fā)利用和減少采后品質(zhì)劣變具有重要的科學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)意義。

對(duì)獼猴桃果實(shí)后熟軟化屬性的研究主要集中在乙烯合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及組分的變化、淀粉含量、淀粉降解酶活性及相關(guān)基因表達(dá)等方面[5-6]。其中，淀粉快速水解是獼猴桃貯藏前期軟化的主要原因[7-8]。淀粉水解成己糖后，經(jīng)過己糖激酶（hexokinase，HXK）（EC 2.7.1.1）的磷酸化作用才能參與下游的糖酵解和呼吸代謝[9-10]。因此，HXK在糖代謝和植物生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[11]。目前，HXK基因已在多種植物中被分離和鑒定。番茄中至少有4 個(gè)HXK基因[12]，擬南芥中有6 個(gè)HXK基因[13]，梨中有10 個(gè)HXK基因[14]，蘋果中有9 個(gè)HXK基因[15]，桃中有5 個(gè)HXK基因[16]。Nardozza等[17]從獼猴桃EST數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出3 個(gè)HXK基因，其中HK3與己糖磷酸化有關(guān)，并參與獼猴桃果實(shí)早期發(fā)育。然而，獼猴桃基因組發(fā)表后，關(guān)于獼猴桃HXK基因家族成員的研究和報(bào)道卻相對(duì)較少。

HXK是一種雙功能酶，可磷酸化己糖或作為葡萄糖信號(hào)感應(yīng)器，在糖酵解、淀粉降解、細(xì)胞壁合成途徑和戊糖磷酸途徑等代謝途徑中發(fā)揮作用[18-20]。HXK可調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及各種生物和非生物脅迫過程，如環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)脅迫[21-22]、植株生長(zhǎng)[23-24]、種子發(fā)育[25]和果實(shí)病害防御[16,26]等。HXK也被報(bào)道能夠影響果實(shí)生理代謝和后熟軟化過程[27]。Hu Dagang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，外源葡萄糖激活MdHXK1的表達(dá)，使下游轉(zhuǎn)錄因子MdbHLH3磷酸化，進(jìn)而上調(diào)MdMYB1和ANS等基因表達(dá)，促進(jìn)蘋果花青苷合成。在碳源缺乏的情況下，花青苷合成抑制子MYB27被顯著激活，果肉花青苷積累受抑制[29]。李成梁等[30]研究發(fā)現(xiàn)，香蕉后熟過程中甘露糖上調(diào)HXK活性和HXK基因的表達(dá)，而N-乙酰-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，NAG）（HXK抑制劑）則抑制HXK活性的升高和內(nèi)源乙烯的合成，說(shuō)明HXK在果實(shí)后熟軟化中發(fā)揮重要作用。然而，目前有關(guān)HXK參與獼猴桃后熟軟化的報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)以‘紅陽(yáng)’獼猴桃為試材，研究10 mmol/L NAG處理對(duì)獼猴桃果實(shí)常溫貯藏期間軟化特性、品質(zhì)、呼吸速率和乙烯釋放量、HXK活性以及AcHXKs基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡釋獼猴桃后熟軟化調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為獼猴桃果實(shí)采后貯藏保鮮技術(shù)的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘紅陽(yáng)’獼猴桃采自江西宜春奉新縣獼猴桃果園，果實(shí)采摘時(shí)為八成熟（平均單果質(zhì)量62.81 g，硬度73.64 N，總可溶性固形物（total soluble solid，TSS）質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.29%），當(dāng)天運(yùn)回江西省果蔬保鮮與無(wú)損檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，挑選無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械損傷、大小均勻的獼猴桃果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料。

NAG 上海源葉生物科技有限公司；HXK活性檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；植物淀粉含量測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所；獼猴桃總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混液 翌圣生物科技（上海）股份有限公司。其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TMS-Touch 質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)F TC公司；糖度計(jì)日本ATAGO公司；SpectraMax190酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；Check point便攜式O2/CO2測(cè)定儀丹麥PBI Dansensor公司；GC-2014氣相色譜儀 日本島津公司；BioDrop超微量核酸蛋白分析儀 英國(guó)柏點(diǎn)公司；CFX96TMPCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 果實(shí)處理

將獼猴桃果實(shí)隨機(jī)分成兩組，即處理組（NAG組，10 mmol/L NAG浸泡10 min）和對(duì)照組（CK組，清水浸泡10 min），每組210 個(gè)果實(shí)。果實(shí)室溫晾干后分裝入低密度聚乙烯袋（39 cm×30 cm，厚度0.03 mm）中，置于（20±1）℃、相對(duì)濕度85%的環(huán)境下貯藏12 d，每2 d取樣測(cè)定果實(shí)硬度、呼吸速率、乙烯釋放量和TSS含量。同時(shí)取果肉組織（去除果皮、中柱和帶籽部分）放于液氮中速凍，在-80 ℃條件下貯藏，用于后續(xù)測(cè)定可滴定酸（titritable acidity，TA）、VC、淀粉、果膠、還原糖含量、HXK活性和提取總RNA。10 個(gè)果實(shí)為1 個(gè)重復(fù)，共3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 硬度測(cè)定

每組隨機(jī)抽取30 個(gè)果實(shí)，使用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定硬度（質(zhì)構(gòu)剖面分析模式）。單個(gè)獼猴桃果實(shí)在赤道面去皮后，測(cè)定赤道面180°兩個(gè)點(diǎn)的果肉硬度。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)設(shè)置為探頭直徑2 mm、穿刺距離8 mm、測(cè)試速率100 mm/min、起始力0.5 N。以每次測(cè)定的最大力值為硬度，取平均值，單位為N。

1.3.3 呼吸速率和乙烯釋放量測(cè)定

每組隨機(jī)選取15 個(gè)果實(shí)，分3 次放入1 L的容器中，密封2 h后在容器頂部抽取氣體測(cè)定呼吸速率和乙烯釋放量，測(cè)定重復(fù)3 次，取平均值。使用Check point便攜式O2/CO2測(cè)定儀測(cè)定CO2體積分?jǐn)?shù)，以CO2釋放速率表示呼吸速率，單位為mL/（kg·h）。抽取密封容器頂部1 mL氣體，使用氣相色譜儀測(cè)定乙烯釋放量，單位為nL/（kg·h）。

1.3.4 TSS、TA和VC含量測(cè)定

將測(cè)硬度的30 個(gè)果實(shí)隨機(jī)分成3 組，即3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每組取位于果實(shí)赤道部的外果肉混合榨汁，采用手持?jǐn)?shù)字糖度計(jì)測(cè)定TSS含量。

TA含量測(cè)定參照曹建康等[31]的方法。將2.0 g果肉于液氮中研磨成粉末，后加入25 mL蒸餾水，靜置30 min后吸取上清液10 mL于三角瓶中，加入2～3 滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%酚酞溶液，用已標(biāo)定的NaOH溶液滴定至溶液變粉紅色且30 s內(nèi)不褪色。

VC含量測(cè)定參照曹建康等[31]的方法。將2.0 g果肉于液氮中研磨成粉末，后加入25 mL 20 g/L的草酸溶液混合，過濾后吸取10 mL濾液于三角瓶，用已標(biāo)定的2,6-二氯靛酚溶液滴定至微紅色且15 s內(nèi)不褪色，記錄滴定液體積，VC含量單位為mg/100 g。

1.3.5 淀粉、果膠和還原糖含量測(cè)定

淀粉含量采用植物淀粉含量測(cè)試盒進(jìn)行測(cè)定。利用酸水解法將淀粉分解成葡萄糖，再使用蒽酮比色法進(jìn)行定量，測(cè)定620 nm波長(zhǎng)處的吸光度，從而計(jì)算淀粉的含量，結(jié)果表示為淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

果膠含量的測(cè)定用咔唑比色法，還原糖含量測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸法，具體步驟參照曹建康等[31]的方法。

1.3.6 HXK活性測(cè)定

HXK活性使用HXK活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定，以每克果肉每分鐘生成1 nmol的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸定義為1 個(gè)酶活力單位。HXK活性單位為U/g。

1.3.7HXKs基因篩選與序列分析

利用Kiwifruit Genome Database（https://kiwifruitgenome.org/organism/5）從紅陽(yáng)獼猴桃基因組中篩選獲得14 個(gè)HXKs基因。通過獼猴桃基因組序列比對(duì)，查找到這14 個(gè)HXKs的氨基酸序列，利用鄰接法聯(lián)配后通過Clustal X（v1.81）軟件進(jìn)行比對(duì)，再導(dǎo)入到FigTree（v1.3.1）軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.8HXKs基因表達(dá)分析

獼猴桃果肉RNA提取按照RNAprep Pure Plant Plus Kit（Polysaccharides &Polyphenolics-rich）RNA提取試劑盒說(shuō)明書操作。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，利用BioDrop超微量核酸蛋白分析儀檢測(cè)總RNA純度和濃度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Hifair?III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

基因表達(dá)研究采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）方法。利用Primer 3在線軟件設(shè)計(jì)引物，詳見表1，根據(jù)溶解曲線驗(yàn)證引物的特異性。逆轉(zhuǎn)錄real-time PCR應(yīng)用CFX96TMPCR儀，反應(yīng)體系（10 μL）和反應(yīng)程序參照試劑盒（HieffR qPCR SYBR Green Master Mix (NO ROX)）說(shuō)明書進(jìn)行?；虮磉_(dá)以獼猴桃AcActin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，將0 d設(shè)為1?；虮磉_(dá)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 NAG處理對(duì)獼猴桃呼吸速率和乙烯釋放量的影響

呼吸和乙烯釋放是獼猴桃后熟軟化過程中主要的生理特性。如圖1A所示，對(duì)照與處理組的呼吸速率變化趨勢(shì)基本一致。貯藏前2 d呼吸速率呈下降趨勢(shì)，推測(cè)是因?yàn)楣麑?shí)較高的田間熱引起采收時(shí)的高呼吸作用。兩組果實(shí)呼吸速率均在貯藏第6天達(dá)到峰值，NAG處理可顯著降低呼吸峰前后的呼吸速率，但呼吸峰值無(wú)顯著差異。如圖1B所示，乙烯釋放量主要在貯藏后期呈上升趨勢(shì)，貯藏第8天開始，CK組與NAG組乙烯釋放量出現(xiàn)顯著差異，NAG處理顯著延緩了乙烯的釋放。由此可知，NAG處理可有效降低果實(shí)呼吸速率和乙烯釋放量。

圖1 NAG處理對(duì)獼猴桃果實(shí)呼吸速率（A）和乙烯釋放量（B）的影響Fig.1 Effect of NAG treatment on the respiration rate (A) and ethylene production (B) of kiwifruit

2.2 NAG處理對(duì)紅陽(yáng)獼猴桃果實(shí)品質(zhì)的影響

硬度作為果實(shí)后熟軟化的重要指標(biāo)，是評(píng)價(jià)獼猴桃果實(shí)品質(zhì)和可食性的關(guān)鍵因子之一。如圖2A所示，獼猴桃果實(shí)硬度隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，與CK組相比，NAG處理可顯著延緩貯藏4～10 d硬度的下降。TSS主要由可溶性糖構(gòu)成，TA則由果酸和酸式鹽組成，它們是評(píng)價(jià)果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)。如圖2B、C所示，與CK組相比，NAG組在貯藏2～12 d顯著抑制了果實(shí)TSS含量的上升，并顯著維持TA含量在較高水平，說(shuō)明NAG處理有利于延緩獼猴桃果實(shí)糖酸轉(zhuǎn)變和維持品質(zhì)。VC是獼猴桃果實(shí)重要的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)之一。如圖2D所示，NAG組和CK組VC含量隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，處理間無(wú)顯著差異。

圖2 NAG處理對(duì)獼猴桃果實(shí)硬度（A）、TSS（B）、TA（C）和VC含量（D）的影響Fig.2 Effect of NAG treatment on the firmness (A),TSS (B),TA (C) and VC content (D) of kiwifruit

2.3 NAG處理對(duì)獼猴桃多糖含量的影響

獼猴桃果實(shí)后熟軟化伴隨著淀粉水解和細(xì)胞壁多糖的降解。從圖3可知，淀粉和原果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)總體呈下降趨勢(shì)，與CK組相比，NAG處理可顯著延緩貯藏4～12 d獼猴桃果肉淀粉和原果膠的下降。兩組果肉中還原糖和可溶性果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈上升趨勢(shì)，且在貯藏過程中、后期NAG組的還原糖和可溶性果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著低于CK組。以上結(jié)果表明，獼猴桃在常溫貯藏過程中NAG處理能顯著抑制淀粉和果膠的水解，延緩果實(shí)的后熟軟化過程。

圖3 NAG處理對(duì)獼猴桃果實(shí)多糖含量的影響Fig.3 Effect of NAG treatment on the polysaccharide contents of kiwifruit

2.4 NAG處理對(duì)獼猴桃HXK活性的影響

HXK是己糖磷酸化的關(guān)鍵酶，葡萄糖和果糖經(jīng)過HXK磷酸化，進(jìn)一步參與下游糖酵解和呼吸代謝過程[9]。如圖4所示，CK組HXK活性隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，而NAG處理后的獼猴桃HXK活性始終低于CK組，并在貯藏2 d后出現(xiàn)顯著差異。結(jié)果表明，NAG處理可以顯著抑制HXK活性，進(jìn)而延緩淀粉水解和糖酵解過程。

圖4 NAG處理對(duì)獼猴桃果實(shí)HXK活性的影響Fig.4 Effect of NAG treatment on the HXK activity of kiwifruit

2.5 獼猴桃HXK基因序列分析

從獼猴桃基因組中篩選獲得14 個(gè)AcHXKs基因，分別命名為AcHXK1～AcHXK14。將獼猴桃HXK與擬南芥、番茄的HXK基因進(jìn)行聚類分析，如圖5所示，14 個(gè)AcHXKs基因分成2大類型。其中，A-型包括10 個(gè)AcHXK，分別與擬南芥的AtHXK3、AtHKL1、AtHKL2、AtHKL3和番茄SlHXK4同源；B-型包括4 個(gè)AcHXK，分別與擬南芥AtHXK1、AtHXK2和番茄SlHXK1、SlHXK2、SlHXK3同源。推測(cè)AcHXKs可能具有與其同源基因類似的功能。

圖5 獼猴桃與擬南芥、番茄的HXKs聚類分析Fig.5 Phylogenetic analysis of kiwifruit arabidopsis and tomato HXKs

2.6 NAG處理對(duì)獼猴桃AcHXKs基因表達(dá)的影響

由圖6可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，AcHXKs呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢(shì)。其中AcHXK1～AcHXK3相對(duì)表達(dá)量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)整體呈上升趨勢(shì)，與CK組相比，NAG處理可顯著抑制貯藏中、后期AcHXK1～AcHXK3的表達(dá)，說(shuō)明AcHXK1～AcHXK3可能通過糖代謝介導(dǎo)獼猴桃后熟軟化。CK組果實(shí)AcHXK4～AcHXK6相對(duì)表達(dá)量在貯藏0～6 d逐漸上升，隨后開始下降，且NAG處理總體顯著降低了貯藏4～12 d果實(shí)AcHXK4～AcHXK6的相對(duì)表達(dá)量。CK組和NAG處理果實(shí)AcHXK7～AcHXK12相對(duì)表達(dá)量在貯藏0～10 d逐漸下降，NAG處理顯著上調(diào)了AcHXK7～AcHXK9基因的相對(duì)表達(dá)量，說(shuō)明AcHXK7～AcHXK9可能作為糖信號(hào)分子參與獼猴桃后熟軟化。AcHXK13、AcHXK14基因表達(dá)量無(wú)規(guī)律性波動(dòng)。

圖6 NAG處理對(duì)獼猴桃果實(shí)AcHXK基因表達(dá)活性的影響Fig.6 Effect of NAG treatment on the expression of AcHXK genes in kiwifruit

2.7 相關(guān)性分析

NAG處理后，獼猴桃果實(shí)后熟軟化特性、HXK活性和AcHXKs基因表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果如圖7所示。果肉硬度與淀粉、AcHXK4、AcHXK7～AcHXK12基因表達(dá)顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），與可溶性果膠含量、乙烯釋放量以及AcHXK3表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01）。乙烯釋放量與可溶性果膠含量、AcHXK3表達(dá)水平顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），與AcHXK10顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。淀粉含量與還原糖、TSS含量和AcHXK2、AcHXK3表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.0 5，P＜0.0 1），與AcHXK4、AcHXK7～AcHXK10表達(dá)水平顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.001）。原果膠含量與AcHXK7、AcHXK8、AcHXK11、AcHXK12表達(dá)水平顯著正相關(guān)（P＜0.05）。由此說(shuō)明，獼猴桃果實(shí)軟化與淀粉、果膠水解以及AcHXKs基因表達(dá)水平的變化密切相關(guān)。

圖7 獼猴桃后熟軟化特性與AcHXKs基因表達(dá)量的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis between postharvest softening properties and AcHXKs gene expression

3 討論

獼猴桃后熟軟化是一個(gè)復(fù)雜的生理代謝過程，呼吸速率和乙烯釋放是衡量其生理代謝強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[5-6]。相關(guān)研究表明，獼猴桃果實(shí)達(dá)到可食成熟度（常溫貯藏8～12 d）時(shí)，呼吸速率和乙烯釋放量迅速增加，耐貯性下降[6,8]。HXK是糖酵解途徑的第一個(gè)限速酶，兼具催化和調(diào)節(jié)雙重功能，在呼吸代謝和乙烯信號(hào)中發(fā)揮重要的作用[33]。本實(shí)驗(yàn)中，NAG處理顯著降低呼吸速率和貯藏后期內(nèi)源乙烯的釋放，且乙烯與硬度顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。說(shuō)明HXK正向作用于內(nèi)源乙烯的生物合成，并參與獼猴桃后熟軟化過程，這與對(duì)香蕉的研究結(jié)果[30]一致。李成梁等[30]研究發(fā)現(xiàn)，NAG推遲內(nèi)源乙烯生物合成，且在香蕉后熟過程中乙烯和HXK之間存在相互作用。在擬南芥中也報(bào)道了HXK參與調(diào)控乙烯合成和信號(hào)反應(yīng)[33]。

獼猴桃是典型的淀粉積累型水果，后熟軟化主要由淀粉水解和細(xì)胞壁降解所導(dǎo)致。其中，淀粉水解主要在貯藏前、中期影響果實(shí)軟化，而果膠水解則在貯藏中、后期果實(shí)軟化中發(fā)揮重要作用[8]。HXK是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將淀粉水解后的己糖磷酸化成己糖-6-磷酸，為呼吸代謝和生命活動(dòng)提供能量和中間代謝物[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，NAG可抑制HXK活性，顯著延緩獼猴桃貯藏中期淀粉向還原糖的轉(zhuǎn)變，以及貯藏中后期原果膠向可溶性果膠的轉(zhuǎn)變（圖3、4）。這與Han Peipei等[26]的研究報(bào)道一致，NAG處理顯著抑制HXK活性，延緩己糖含量的上升。此外，NAG處理可顯著延緩TSS含量的上升，并維持TA含量在較高水平，且TSS含量與淀粉含量極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。說(shuō)明NAG處理可延緩可溶性糖的積累，進(jìn)而延緩后熟進(jìn)程，該結(jié)果與NAG處理香蕉果實(shí)后熟延緩的結(jié)果相似[24]。說(shuō)明HXK可正向調(diào)控獼猴桃淀粉、果膠的水解，促進(jìn)后熟軟化過程。

HXK不僅調(diào)控多糖代謝，也直接參與糖信號(hào)感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)[18-19]。植物根據(jù)亞細(xì)胞定位有4 種類型的HXK，其中A-型HXK定位于葉綠體，主要在高淀粉植物中積累，也是葡萄糖傳感器；B-型HXK定位于線粒體和細(xì)胞核，具有催化和調(diào)節(jié)活性的雙重功能。HXK不同類型對(duì)其活性和傳感器功能至關(guān)重要[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，AcHXK7～AcHXK9為A-型HXK，受NAG處理其表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)量與硬度顯著正相關(guān)（P＜0.05）。聚類分析表明AcHXK7～AcHXK9與擬南芥AtHKL1等同源，而AtHKL1可能作為糖信號(hào)分子，通過抑制ACO基因的表達(dá)參與調(diào)控乙烯合成途徑[33]。AcHXK3為B-型HXK，與SlHXK1、SlHXK2、AtHXK1、AtHXK2等同源；并且受NAG處理其表達(dá)下調(diào)，且表達(dá)量與硬度、淀粉含量顯著負(fù)相關(guān)，與還原糖、可溶性果膠含量顯著正相關(guān)（P＜0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)HXK1顯著誘導(dǎo)番茄和擬南芥中β-淀粉酶和細(xì)胞壁松弛相關(guān)基因XTH等的表達(dá)下調(diào)，這表明HXK正向調(diào)控園藝植物成熟衰老的過程[21,32]。Kim等[35]也發(fā)現(xiàn)B-型NtHXK1對(duì)維持煙草呼吸代謝過程中的糖酵解至關(guān)重要，同時(shí)也調(diào)節(jié)淀粉的降解過程。說(shuō)明AcHXK3具有類似的功能，可能通過調(diào)控淀粉和細(xì)胞壁代謝，參與獼猴桃后熟軟化。以上結(jié)果表明，AcHXK3、AcHXK7～AcHXK9可能是參與調(diào)控獼猴桃后熟軟化的關(guān)鍵基因。而這4 個(gè)基因是如何參與獼猴桃后熟軟化，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

4 結(jié)論

綜上，與對(duì)照相比，NAG處理可延緩獼猴桃硬度下降、淀粉和原果膠的水解，降低呼吸速率和乙烯釋放量，延緩TSS含量的上升，并維持較高的TA含量。說(shuō)明NAG處理可延緩獼猴桃后熟軟化進(jìn)程。一方面，NAG處理可能通過抑制AcHXK3的表達(dá)水平和HXK活性，延緩獼猴桃呼吸代謝和后熟進(jìn)程；另一方面，NAG維持AcHXK7～AcHXK9相對(duì)較高的表達(dá)水平，而AcHXK7～AcHXK9可能作為糖信號(hào)分子，進(jìn)而抑制乙烯的合成，或參與細(xì)胞壁和淀粉的降解，從而調(diào)節(jié)獼猴桃后熟軟化。因此，AcHXK3、AcHXK7～AcHXK9可能通過不同的代謝途徑參與調(diào)控獼猴桃后熟軟化過程。本研究結(jié)果有助于加深對(duì)獼猴桃后熟軟化機(jī)理的理解，同時(shí)為研發(fā)獼猴桃后熟軟化調(diào)控技術(shù)提供理論依據(jù)。