富硒油菜粉抗氧化特性及其與化學(xué)成分相關(guān)性

楊 迪，閔立風(fēng)，張 睿，張涵鳴，熊 坤，莊 洋，傅 琴，莫開菊,*

（1.湖北民族大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.國家富硒產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000；3.恩施硒圣植物科技有限公司，湖北 恩施 445000）

硒（Se）是一種微量元素，具有重要的生物學(xué)功能，對人體健康具有重要意義[1]。硒通過修飾谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶和碘甲狀腺原氨酸脫碘酶等至少30 種蛋白的表達影響著人體的生理功能[2]。這些硒代酶能夠作為抗氧化劑調(diào)節(jié)人體的生理功能、調(diào)節(jié)甲狀腺激素代謝和免疫系統(tǒng)功能、預(yù)防癌癥等[3]。因此，硒具有較高的營養(yǎng)和醫(yī)療價值。

此外，硒可以通過參與植物體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝影響植物體內(nèi)化合物的合成[4-6]，進而改變植物體系的抗氧化活性及功能特性。如不同種類的富硒茶在茶多酚、茶多糖、黃酮、總氮等化學(xué)成分含量上與相對應(yīng)的普通茶具有顯著差異[4]，而這些化學(xué)成分含量的不同可能會帶來抗氧化能力的差異。因此，富硒植物提取物可能比未富硒植物提取物具有更強的抗氧化活性[7]。有研究表明油菜具有較強的富硒能力[8]，并且用油菜粉（以硒質(zhì)量計0.36 mg/kgmb）喂養(yǎng)大鼠30 d后沒有受到明顯毒害作用[9]，因此食用富硒油菜粉可能成為補硒的一條有效途徑。然而，富硒油菜粉是否具有抗氧化活性及存在何種抗氧化活性物質(zhì)鮮見研究，因此本研究測定了富硒油菜粉提取物和普通油菜粉提取物中的總氮、總糖、多酚、黃酮、皂苷、總硒、多糖和多糖硒的含量以及抗氧化活性，并分析其相關(guān)性和偏相關(guān)性，進一步了解各物質(zhì)獨立的抗氧化活性，以期為開發(fā)富硒油菜粉產(chǎn)品提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒油菜粉提取物和普通油菜粉提取物由恩施硒圣植物科技有限公司提供。

苯酚、冰醋酸、福林-酚試劑、過硫酸鉀、過氧化氫、鄰苯三酚、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、沒食子酸、氫氧化鈉、三氯化鐵、無水醋酸鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖 美國Sigma公司；2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ）、6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-甲酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）東京化成工業(yè)株式會社；蘆丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；齊墩果酸 上海源葉生物科技有限公司；香草醛 天津光復(fù)精細化工研究所；硫酸亞鐵 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；三羥甲基氨基甲烷天津市博迪化工有限公司；高氯酸 天津市東方化工廠；水楊酸 天津市福晨化學(xué)試劑廠；無水碳酸鈉天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；硼酸、無水乙醇和鹽酸武漢市中天化中有限責任公司。所有試劑均為化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite M200 Pro多功能酶標儀 瑞士帝肯公司；RC-HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 北京睿誠永創(chuàng)科技有限公司；GL224I-1SCN電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總氮含量的測定

采用凱氏定氮法[4]測定總氮含量。

1.3.2 總糖和多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[4]測定樣品溶液中的總糖含量。以葡萄糖為標準品在490 nm波長處測定吸光度并計算樣品中總糖含量。提取液加入無水乙醇使乙醇終體積分數(shù)為80%，4 ℃靜置過夜后4 000 r/min離心得沉淀，將沉淀用無水乙醇洗兩次得到多糖，得到的多糖同樣用苯酚-硫酸法測定并計算提取液中的多糖含量。

1.3.3 多酚含量測定

采用福林-酚法[4]測定樣品溶液中多酚含量。以沒食子酸為標準品于765 nm波長處測定吸光度，并計算樣品中多酚含量。

1.3.4 總黃酮含量測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁體系測定樣品溶液中的總黃酮含量[4]。以蘆丁為標準品，在510 nm波長處測定吸光度，并計算樣品中總黃酮含量。

1.3.5 總皂苷含量測定

采用香草醛-高氯酸法[10]測定總皂苷含量。以齊墩果酸為標準品，在560 nm波長處測定吸光度，并計算標準曲線和樣品中總皂苷含量。

1.3.6 總硒和多糖硒含量測定

采用原子熒光法[4]測定樣品溶液中總硒和多糖硒的含量。

1.3.7 總鐵離子還原力測定

采用鐵離子還原/抗氧化能力法（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）[11]測定總鐵離子還原力。將300 mmol/L、pH 3.6醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L三氯化鐵溶液以體積比10∶1∶1配制成FRAP工作液。分別取150 μL FRAP工作液和50 μL樣液于酶標板中，37 ℃孵育10 min后于593 nm波長處測定吸光度，同時以蒸餾水為對照，以Trolox標準液繪制標準曲線y＝0.003 4x+0.005 5，R2＝0.999 1，并計算小藻提取物的總鐵離子還原能力。

1.3.8 提取物抑制氫原子轉(zhuǎn)移能力測定

參考郭麗麗等[10]的方法并略作修改。取8.0 mg DPPH溶于用30 mL 70%乙醇溶液中，超聲溶解5 min后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液定容得到DPPH自由基工作液，取DPPH自由基溶液100 μL于酶標板中，再加入100 μL樣液，混勻靜置30 min后測定520 nm波長處吸光度，同時以純水作為空白，測定樣品底物吸光度，每個樣品重復(fù)3 次。DPPH自由基清除率的計算如下式所示：

式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為加入樣品后的吸光度；A2為以純水替代自由基工作液的吸光度。

1.3.9 提取物抑制電子轉(zhuǎn)移能力測定

將濃度為7 mmol/L ABTS陽離子自由基溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫25 ℃避光反應(yīng)12～16 h，制備ABTS陽離子自由基儲備液。使用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）將儲備液稀釋至適宜吸光度，備用。取各濃度樣品50 μL，加入150 μL ABTS陽離子自由基溶液，于暗處反應(yīng)5 min，測定其在734 nm波長處的吸光度[10]。以蒸餾水代替樣品作為空白。每個樣品重復(fù)3 次。ABTS陽離子自由基清除率按1.3.8節(jié)公式計算。

1.3.10 羥自由基清除能力測定

在比色管中依次先加入20 μL 9 mmol/L FeSO4溶液、20 μL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、100 μL樣液、40 μL蒸餾水和20 μL 8.8 mmol/L H2O2溶液。37 ℃孵育15 min后于510 nm波長處測其吸光度，同時測定參比溶液吸光度，參比溶液以蒸餾水替代H2O2[10]。每個樣品重復(fù)3 次。羥自由基清除率按1.3.8節(jié)公式計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行Pearson相關(guān)性分析與偏相關(guān)性分析；采用Duncan法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜粉提取物中基本化學(xué)成分

從表1可以看出，普通油菜粉提取物中總糖、多糖和皂苷質(zhì)量濃度明顯高于富硒油菜粉提取物，而富硒油菜粉提取物中含氮化合物、多酚、黃酮、總硒以及多糖硒含量明顯高于普通油菜粉提取物。有研究表明富硒培養(yǎng)會改變植物體內(nèi)化學(xué)成分的含量[4-5]，這可能是因為在植物生長過程中，硒參與植物體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝，從而促進作物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的生成[5-6]?？傊瑑煞N提取物中化學(xué)成分含量有所差異，且富硒油菜粉提取物中含氮化合物、多酚、黃酮、總硒和多糖硒含量更高。

表1 油菜粉提取物中各化學(xué)成分的含量Table 1 Chemical components content in rape powder extracts

2.2 油菜粉提取物抗氧化能力

機體內(nèi)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的自由基可以穿過細胞膜，并容易與生物分子包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷或細胞死亡[12]。由圖1可以看出，富硒和普通油菜粉提取物還原Fe3+以及清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的能力均隨質(zhì)量濃度的增加而上升。當提取物質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時，富硒油菜粉提取物與普通油菜粉提取物還原Fe3+的能力以及清除羥自由基的能力接近。當提取物質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時，富硒油菜粉提取物和普通油菜粉提取物還原Fe3+的能力以及清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的能力接近。除此之外，富硒油菜粉提取物還原Fe3+以及清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的能力均明顯高于普通油菜粉提取物。一般而言，抗氧化活性物質(zhì)通過給予電子及氫原子阻斷自由基的鏈式反應(yīng)，達到抗氧化的目的[13-15]。

圖1 富硒和普通油菜粉提取物與抗氧化活性的量效關(guān)系Fig.1 Concentration-dependent antioxidant activity of seleniumenriched and regular rape powder extracts

從圖1可以看出，油菜粉提取物還原Fe3+以及清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的能力有所差異。DPPH自由基分析法適用于疏水性抗氧化系統(tǒng)[13]；ABTS陽離子自由基分析法可以廣泛應(yīng)用于親水性和親脂性抗氧化系統(tǒng)[16-17]。羥自由基清除實驗是利用抗氧化劑清除由芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基[18]；FRAP法的原理是在酸性條件下，抗氧化劑將Fe3+-TPTZ還原成藍色的Fe2+-TPTZ，根據(jù)其吸光度變化測定樣品的總還原能力[11]，經(jīng)常被用于快速評估各種食品、飲料以及各種植物提取物的總抗氧化能力[11,19-20]。因此，兩種油菜粉提取物在不同測定方法中具有不同的抗氧化活性。一般來說，體外測定可以評估特定反應(yīng)系統(tǒng)中的抗氧化活性[21]，對某一樣品可以使用多種抗氧化劑測定法確定其抗氧化活性。與天然油菜粉提取物相比，富硒樣品顯著提高了還原Fe3+以及清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的能力，具有更強的抗氧化活性。富硒油菜粉提取物中含有更多的含氮化合物、多酚、黃酮、總硒以及多糖硒等物質(zhì)，這些物質(zhì)都具有一定的抗氧化能力[22-24]。因此，富硒油菜粉較高的抗氧化活性可能也與這些抗氧化活性物質(zhì)含量較高有關(guān)。

2.3 油菜粉提取物基本化學(xué)成分與抗氧化能力相關(guān)性分析

2.3.1 化學(xué)成分與抗氧化特性的Pearson相關(guān)性分析

由表2可知，總氮、多酚和總黃酮含量的增加均能顯著或極顯著增加Fe3+還原能力以及DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由清除能力，表明總氮、多酚和總黃酮可能是兩種油菜粉提取物中最重要的抗氧化物質(zhì)；其次，皂苷和多糖硒含量可以正相關(guān)地影響3 種抗氧化活性，表明皂苷和多糖對油菜粉提取物的抗氧化能力也有重要影響；最后，總糖、總硒和多糖含量的上升分別能顯著增加1～2 種抗氧化活性指標水平，表明總糖、總硒和多糖對油菜粉的抗氧化能力具有一定的貢獻。有研究表明，蛋白、多酚和黃酮與抗氧化活性之間呈顯著正相關(guān)[22-26]，而皂苷和還原糖以及硒多糖都具有一定的抗氧化活性[23,27-28]。相關(guān)性分析中總氮、總糖、多酚、總黃酮、皂苷、總硒、多糖和多糖硒均與油菜粉提取物的抗氧化能力存在一定的正相關(guān)性，表明這些物質(zhì)含量的增加有利于提高油菜粉提取物的抗氧化能力。

表2 化學(xué)成分與抗氧化性的Pearson相關(guān)性Table 2 Pearson correlation analysis between chemical components and antioxidant activity

Pearson相關(guān)性可以簡潔地反映兩個變量間的相關(guān)性和線性關(guān)系[29]。但在多變量分析中，兩個變量間的關(guān)系會受到其他變量的影響，Pearson相關(guān)性可能無法正確反映兩個變量間的內(nèi)在聯(lián)系，而偏相關(guān)分析通過控制其他變量，在多變量分析中能有效量化選定變量間的相關(guān)性[30-31]，因此采用偏相關(guān)分析油菜粉提取物中化學(xué)成分與抗氧化性之間的關(guān)系。

2.3.2 化學(xué)成分與抗氧化特性的偏相關(guān)分析

從表3可以看出，在偏相關(guān)分析中總氮、總糖、多酚、總黃酮、皂苷和總硒均被排除，F(xiàn)e3+還原能力和DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基清除能力僅與多糖和多糖硒相關(guān)，且多糖硒與4 種能力均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），多糖含量與Fe3+還原能力、DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01）。表明油菜粉提取物的主要抗氧化活性可能與多糖和多糖硒有關(guān)。

表3 化學(xué)成分與抗氧化性的偏相關(guān)性Table 3 Partial correlation analysis between chemical components and antioxidant activity

有研究表明硒化后的多糖會增加ABTS陽離子自由基清除能力和Fe3+還原能力，但是單純的無機硒+多糖干預(yù)并不會增強多糖的抗氧化活性[27-28,32]，這是由于硒多糖中氫硒基（SeH）或硒酸酯基團可以激活異構(gòu)碳上的氫原子，基團的活化程度越高，貢獻氫原子的能力越強[33-34]。糖醛酸含量較高的多糖具有更強的抗氧化潛力[35]，而硒多糖含有更多的糖醛酸并具有更高的抗氧化能力[36]。因此，硒的引入可能改變油菜粉中多糖的組成，降低多糖的分子質(zhì)量，從而增加富硒提取物的抗氧化活性?？傊m然普通油菜粉中的總糖或總多糖含量較高，但富硒油菜粉中的硒或多糖中硒含量較高，即可能含有更高含量的硒多糖，使其擁有較高的抗氧化活性。因此，油菜粉提取物中硒多糖的含量可能是影響其抗氧化活性的主要因素。

3 結(jié)論

兩種油菜粉提取物中，富硒油菜粉提取物含氮化合物、多酚、黃酮和總硒以及多糖硒含量明顯高于普通油菜粉提取物，但總糖、多糖和總皂苷含量相對較低。Fe3+還原能力以及DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基清除能力均隨提取物質(zhì)量濃度的增加而增大，并且富硒油菜粉提取物還原Fe3+以及清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的能力均強于普通油菜粉提取物。相關(guān)性分析表明提取物中含氮化合物、總糖、多酚、黃酮、皂苷、多糖、總硒以及多糖硒含量的增加均能在一定程度上增強提取物的抗氧化活性，尤其是總氮、多酚和黃酮。但偏相關(guān)性分析表明多糖和多糖硒可能是油菜粉提取物抗氧化能力的主要因素，即多糖和多糖硒含量的差異可能是造成兩種油菜粉提取物抗氧化能力差異的主要因素。