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    殼聚糖-透明質(zhì)酸鈉-益生菌水凝膠的制備、表征及胃腸道緩釋作用

    2024-05-20 07:17:04厲佳怡王紅磊李婭婕郭婷婷倪乙丹周泉城盛桂華
    食品科學(xué) 2024年9期
    關(guān)鍵詞:益生菌消化凝膠

    厲佳怡,王紅磊,李婭婕,郭婷婷,倪乙丹,周泉城,盛桂華

    (山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院,山東 淄博 255200)

    水凝膠是一種具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的親水性物質(zhì),其在吸收大量的水后依然不溶,且能夠保持交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)、鏈的纏結(jié)或結(jié)晶區(qū)域的穩(wěn)定性[1]。由于具有較好的生物相容性、生物降解性和結(jié)構(gòu)可調(diào)性,水凝膠被廣泛應(yīng)用于輸送活性物質(zhì)、組織工程、生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域[2-4]。根據(jù)交聯(lián)類型,水凝膠可以分為化學(xué)交聯(lián)和物理交聯(lián)。其中化學(xué)交聯(lián)水凝膠雖具有較好的質(zhì)構(gòu)特性和穩(wěn)定性,但是由于存在對生物活性有害的反應(yīng),限制了其在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展[5-6]。相較之下,物理交聯(lián)水凝膠通過離子相互作用、蛋白質(zhì)相互作用、氫鍵等形成,在制備過程中不需要交聯(lián)劑,安全性高[7],且其交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)具有可逆性[8]。多糖是物理交聯(lián)水凝膠常見的基質(zhì)成分之一,其能提供物理屏障,保護攜帶的物質(zhì)免受胃酸和膽汁的影響[9]。目前,常見荷載益生菌的方法有微膠囊包埋法,但在實際應(yīng)用中,常常需要多層的包埋才能避免益生菌受損[10]。物理交聯(lián)水凝膠制備工藝簡單,其特有的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及溶脹特性有助于益生菌與外界營養(yǎng)物質(zhì)的交換,便于在加工貯藏過程中維持益生菌的存活及繁殖[11]。因此,采用物理交聯(lián)水凝膠特有的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)作為載體,有望成為荷載益生菌的新方法以及新的研究方向。

    殼聚糖(chitosan,CS)是目前自然界中唯一的天然陽離子多糖,含有游離的氨基,來源廣泛,具有優(yōu)異的生物相容性、生物降解性、抗菌性、成膜性等特點[12]。透明質(zhì)酸鈉(sodium hyaluronate,SH)是一種天然的高分子聚合物,有較好的生物相容性,且具有抗衰老、抗炎癥、保濕潤滑等作用[13]。由于SH分子鏈的一側(cè)暴露著大量羥基,使SH具有很強的親水性[14],可以與質(zhì)子化CS鏈上的氨基結(jié)合,通過靜電相互作用形成物理交聯(lián)水凝膠。Sheila等[15]以CS和SH為原料,制備了具有自愈性能和藥物緩釋特性、可3D打印的聚電解質(zhì)水凝膠,其具有優(yōu)異的生物相容性以及抗機械損傷的耐久性。益生菌是指能夠定植于人體腸道和生殖系統(tǒng)內(nèi)對宿主有正面效益的活性微生物,具有抑制腸道炎癥、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)等作用[16]。然而,益生菌在食品加工、后期貯存以及食用的過程中易受到各種外界環(huán)境因素的影響,導(dǎo)致其活性降低甚至喪失,從而無法發(fā)揮應(yīng)有的功能特性。因此,如何保證定植在人體腸道內(nèi)益生菌的活性及數(shù)量一直是研究的重點[17],也是本研究的主要內(nèi)容。

    基于上述情況,本實驗選擇鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)以及乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)為荷載對象,以CS、SH作為主要材料,通過SH羧酸基(—COO-)和CS質(zhì)子化氨基(—NH3+)之間的靜電相互作用形成物理交聯(lián)水凝膠,對水凝膠質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率及溶脹動力學(xué)曲線進行分析,并研究其功能特性;同時以水凝膠為載體荷載益生菌,研究益生菌及培養(yǎng)基對水凝膠質(zhì)構(gòu)特性及微觀結(jié)構(gòu)的影響,分析水凝膠的載菌性能,探究其胃腸消化特性,研究其在模擬胃腸液中的釋放動力學(xué),探尋益生菌水凝膠的釋放機制及作用機理,以期為CS-SH物理交聯(lián)水凝膠的制備及其載菌性能提供一定的材料依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    SH(分子質(zhì)量97 kDa)華熙生物科技股份有限公司;CS(脫乙酰度85%,分子質(zhì)量100 kDa)上海愛純生物科技有限公司;L.rhamnosus、P.acidilactici菌粉西安榮甄生物科技有限公司;MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;乙酸、氯化鈉等其他常用分析純試劑 國藥集團(上海)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;全溫立式振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;FD-1A-50型冷凍干燥機 博醫(yī)康(北京)儀器有限公司;物性測試儀 北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司;D8-02型X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)儀 德國Bruker公司;Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform-infrared spectroscopy,F(xiàn)T-IR)美國Thermo Nicolet公司;Quanta 250型場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

    1.3 方法

    1.3.1 CS-SH水凝膠的制備

    參考Sheila等[15]的方法。為使CS-SH水凝膠具有較好載菌性能,需要其在實現(xiàn)高溶脹度的同時具有足夠的機械強度[18],前期研究了多個因素對水凝膠硬度和溶脹度的影響,通過響應(yīng)面法確定最佳條件:采用體積分?jǐn)?shù)為0.75%的醋酸溶液溶解CS,配制成1.60 g/100 mL的CS溶液,SH質(zhì)量濃度為1.60 g/100 mL,將兩種溶液按體積比1∶1混合,反應(yīng)60 min,2 000 r/min離心15 min,棄上清液,即得CS-SH水凝膠。在此條件下制備的水凝膠具有優(yōu)良的性能和適合的溶脹度,適合作為載菌體系的基礎(chǔ)材料。將新鮮制備水凝膠冷凍干燥備用。

    1.3.2 益生菌水凝膠的制備

    稱取一定量的益生菌凍干粉,加入無菌的MRS肉湯培養(yǎng)基(簡稱MRS)中,配制成質(zhì)量濃度為1g/L的菌懸液,37 ℃培養(yǎng)14 h。稱取0.20 g干燥水凝膠于上述溶液中,在37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)10 h至其溶脹平衡,取出后用濾紙吸干表面菌液,即得荷載益生菌L.rhamnosus、P.acidilactici水凝膠(分別記為CS-SH-LR、CS-SH-PA)。

    1.3.3 水凝膠的質(zhì)構(gòu)特性

    參考馮傳興等[19]的方法,將制備好的濕凝膠表面處理平滑,用TPA模式測定凝膠的硬度、彈性、內(nèi)聚性、膠黏性以及回彈性5 個指標(biāo)。TPA測試條件:P/75探頭,測試速率及測后速率為1 mm/s,壓縮程度為5 mm,停留時間為5 s。

    1.3.4 水凝膠微觀結(jié)構(gòu)表征

    1.3.4.1 掃描電子顯微鏡(scanningelectron microscope,SEM)分析

    用液氮脆斷凍干的樣品,利用SEM觀察復(fù)合材料縱截面的形貌,加速電壓5 kV。

    1.3.4.2 FT-IR分析

    將樣品與溴化鉀粉末以質(zhì)量比1∶100充分混合,用球形研磨機研磨均勻,抽空下壓成透明薄片,裝入壓片夾,以溴化鉀空白壓片作對照,在4 000~400 cm-1范圍內(nèi)掃描。

    1.3.4.3 XRD測試

    將樣品置于15 mm×20 mm×1.5 mm的鋁片孔中,隨后壓緊進行測定。XRD的測試條件:掃描范圍20°~80°,掃描速率為5°/min,測角精度2θ≤±0.01°,角分辨率≤±0.1,角度重現(xiàn)性為±0.000 1°。

    1.3.5 水凝膠的孔隙率

    參考朱孟臻[20]的方法,采用溶劑置換法測定CS-SH凝膠的孔隙率,以無水乙醇為介質(zhì),水凝膠經(jīng)冷凍干燥后,稱其干質(zhì)量m1(g);測量干燥凝膠顆粒的高度和直徑,計算體積V(cm3);樣品經(jīng)無水乙醇溶脹平衡后,用濾紙吸取水凝膠表面的液體,測質(zhì)量m2(g);無水乙醇密度為ρ(g/cm3),按式(1)計算多孔水凝膠的孔隙率:

    1.3.6 水凝膠的溶脹度

    參考行云逸等[21]的方法并稍作修改。將新鮮制備的CS-SH水凝膠放入-20 ℃冷凍24 h后取出,凍干48 h。將凍干后的水凝膠置于37 ℃蒸餾水中12 h以上直至質(zhì)量恒定,用濾紙吸干水分后稱質(zhì)量,按式(2)計算水凝膠的溶脹度:

    式中:m3為凍干后水凝膠質(zhì)量/g;m4為溶脹平衡時水凝膠的質(zhì)量/g。

    1.3.7 益生菌的荷載量及荷載率

    參考Cristina等[22]的方法并稍作修改。將凍干的水凝膠放入對數(shù)生長期的L.rhamnosus、P.acidilactici菌液中,并以同生長時期等體積的菌液作為空白對照,振蕩培養(yǎng)12 h后,用平板涂布法測定菌液中的菌落總數(shù),荷載后的菌液菌落總數(shù)記為X1(CFU),空白單因素優(yōu)化組的菌液菌落總數(shù)記為X2(CFU),荷載量及荷載率分別按式(3)、(4)計算:

    1.3.8 游離益生菌的模擬胃腸液耐受性分析

    參考Xiao Yao等[14]的方法并稍作修改。人工模擬胃液(simulated gastric fluid,SGF):取16.4 mL濃鹽酸與10 g胃蛋白酶混合均勻后定容至1 000 mL,pH 2;人工模擬腸液(simulated intestinal fluid,SIF):稱取6.8 g KH2PO4、10 g胰蛋白酶,另加3號膽鹽10 g綜合模擬腸道的腐蝕性環(huán)境,加水稀釋至900 mL,并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8后,定容至1 L。

    收集對數(shù)期生長的游離L.rhamnosus、P.acidilactici(分別記為LR組、PA組)并在8 000 r/min條件下離心,用生理鹽水洗滌3 次,調(diào)節(jié)終濃度約為108CFU/mL。將9 mL預(yù)熱好的SGF和SIF分別加到1 mL菌懸液中,以生理鹽水組作為對照。由于成人的胃腸道消化時間一般不超過4 h,因此各組樣品在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 h。孵育結(jié)束后,用MTT法測試LR與PA組的細(xì)胞存活率,用酶標(biāo)儀在492 nm波長處測其吸光度。

    1.3.9 體外胃腸消化模擬

    在模擬消化環(huán)境條件下研究水凝膠中L.rhamnosus與P.acidilactici的存活和釋放特性。取新鮮制得的益生菌水凝膠置于10 mL SGF中37 ℃消化2 h,并在0、20、40、60、80、100、120 min時取樣,取樣后立即稀釋涂布。以菌懸液作為空白對照,操作步驟相同。SGF消化結(jié)束后將剩余水凝膠取出轉(zhuǎn)移至37 ℃的10 mL SIF中,充分混合,在37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中消化4 h,并在0、40、80、120、160、200、240 min時取樣,取樣后立即稀釋涂布??瞻讓φ战M經(jīng)過SGF消化后,離心取沉淀物,將其投入10 mL SIF中,充分混合,進行腸道消化模擬。測定各組的細(xì)胞活性和菌落數(shù)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 水凝膠的質(zhì)構(gòu)特性

    荷載益生菌時,為了提高益生菌的存活率及活性,將凍干后的水凝膠放入含MRS肉湯培養(yǎng)基的菌液中浸泡(記為CS-SH-MRS組),所以額外探究MRS對水凝膠結(jié)構(gòu)及理化特性的影響。內(nèi)聚性是指介質(zhì)的內(nèi)部結(jié)合強度[23],由表1可知,各組之間內(nèi)聚性沒有顯著差異,說明益生菌及MRS對凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響較小。各組水凝膠之間的硬度、彈性、膠黏性、回彈性均存在差異,其中CS-SH-MRS組的硬度、彈性、膠黏性與CS-SH組相比均顯著降低,這可能是由于MRS對水凝膠組分之間的鍵造成影響。與CS-SH組相比,CS-SH-LR組的硬度、彈性、膠黏性、回彈性均顯著降低,CS-SH-PA組的彈性、膠黏性、回彈性也均顯著降低。然而,CS-SH-LR組和CS-SHPA組的硬度、彈性、膠黏性均高于CS-SH-MRS組,這說明MRS對水凝膠質(zhì)構(gòu)特性有顯著降低的作用,而荷載益生菌能降低MRS對水凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響,這一結(jié)果與Beckwith等[24]的研究結(jié)果相似。

    表1 水凝膠及益生菌水凝膠的質(zhì)構(gòu)特性Table 1 Texture properties of free and probiotic-loaded hydrogels

    2.2 水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)分析

    如圖1A、B所示,CS-SH水凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較均勻,孔洞較大,孔洞壁較薄,結(jié)構(gòu)較脆,這可能與其高溶脹度、低硬度的特性有關(guān)。圖1C、E為荷載L.rhamnosus的CS-SH水凝膠的微觀結(jié)構(gòu),由圖1E可以明顯看出水凝膠壁上附有很多桿狀益生菌,這與L.rhamnosus的形態(tài)相符合;圖1D、F為荷載P.acidilactici的CS-SH水凝膠的微觀結(jié)構(gòu),P.acidilactici呈球狀,附著在CS-SH壁表面,P.acidilactici的荷載密度較L.rhamnosus更高,緊密附著在水凝膠壁上。由圖1E、F可以看出,益生菌附著在水凝膠壁上,表明CS-SH水凝膠成功荷載益生菌,且該荷載方式并未明顯改變益生菌的表面形態(tài),CS-SH水凝膠可以為L.rhamnosus及P.acidilactici提供一個生物相容性較好的環(huán)境。

    圖1 CS-SH水凝膠及CS-SH載菌水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of free and bacteria-loaded CS-SH hydrogels

    2.3 水凝膠的FT-IR分析

    由圖2可知,各組在3 000~3 750 cm-1處存在強且寬的吸收峰,該區(qū)域一般對應(yīng)O—H、N—H的伸縮振動,與CS和SH組相比,CS-SH組吸收峰紅移,為靜電相互作用導(dǎo)致的伸縮振動,這表明CS聚陽離子和SH聚陰離子之間形成離子鍵;與CS-SH組相比,CS-SH-MRS組吸收峰藍(lán)移,透光率降低,說明MRS會影響水凝膠的交聯(lián)程度,這與質(zhì)構(gòu)特性分析結(jié)果一致;CS-SH-LR組、CS-SHPA組藍(lán)移距離較少,說明益生菌有助于緩解MRS對水凝膠結(jié)構(gòu)的影響。2 700~3 000 cm-1處的吸收峰為醛基C—H的伸縮振動,荷載益生菌的CS-SH水凝膠,吸收峰減弱消失,這說明益生菌的包埋會影響水凝膠的靜電相互作用。1 500~1 680 cm-1以及1 380~1 500 cm-1處為雙鍵C=O(酰胺I帶)的對稱伸縮振動和羧基的特征峰,均是SH的特征峰[25],交聯(lián)后所有組別透光率均升高,其中1 500~1 680 cm-1處,與CS組相比,其余組(除SH組外)的吸收峰均紅移,可能是由于交聯(lián)后兩種材料之間的靜電相互作用導(dǎo)致;1 000~1 200 cm-1是C—O—C伸縮振動峰,為CS的特征峰[26],各組均有此峰,與CS組相比,其余組(除SH組外)吸收峰略紅移,這可能是由于分子內(nèi)電子的躍遷。綜上所述,CS和SH通過靜電相互作用形成水凝膠,這與Sheila等[15]的研究結(jié)果一致,而MRS會降低CS、SH之間的靜電相互作用,荷載益生菌可以有效緩解該影響。

    圖2 CS-SH水凝膠及CS-SH載菌水凝膠的FT-IRFig.2 FT-IR spectra of free and bacteria-loaded CS-SH hydrogels

    2.4 水凝膠的XRD分析

    從圖3可以看出,CS和SH在10.71°和19.94°處有較強的特征衍射峰,其中CS在19.94°處的強度較高,這可能是CS的特征衍射峰,說明CS有明顯的晶體結(jié)構(gòu)。CS和SH交聯(lián)后,兩處特征峰強度均降低,特別是CS-SH-MRS組和CS-SH-PA組在10.71°處的衍射峰強度較低,峰寬減小,說明這兩組水凝膠的結(jié)構(gòu)更松散;其余各組在兩峰處的強度與SH相似,說明CS和SH之間具有較強的相互作用,從而使得各物質(zhì)的特征衍射峰降低或者消失,同時也說明水凝膠結(jié)晶度低,為非結(jié)晶態(tài),證明CS-SH物理交聯(lián)水凝膠具有良好的相容性[27]。

    2.5 水凝膠的溶脹性能

    CS-SH水凝膠的溶脹度為(743.48±24.60)%,孔隙率為(59.01±3.84)%。圖4為37 ℃ CS-SH水凝膠在蒸餾水、SGF、SIF中的溶脹動力學(xué)曲線。在溶脹初期,水凝膠迅速吸水膨脹,溶脹度增長速度較快,大約在20 min左右,水凝膠在蒸餾水和SGF中的溶脹速率逐漸減緩,并趨于平衡,最終溶脹度分別穩(wěn)定在735.28%和744.55%,即吸水能力分別為7.353 g/g和7.446 g/g。30 min后,水凝膠在SGF中溶脹度降低,這可能是因為CS在酸性條件下容易形成帶正電的陽離子,破壞了CS與SH之間的靜電相互作用,導(dǎo)致外圍不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)被破壞。在30~150 min之間,CS-SH水凝膠在SIF中的溶脹度均高于在SGF中的溶脹度。在180 min后,水凝膠的溶脹度增長速率減緩,逐漸達到平衡,這可能是由于外界的H+與CS交互達到平衡。SIF中的水凝膠溶脹度在60 min左右最高,約1 202.27%,即吸水能力為12.02 g/g。隨后,溶脹度逐漸降低并達到平衡,約為552.27%,即吸水能力為5.52 g/g。這是因為SH成功接枝到水凝膠中,賦予了CS大量的—COOH官能團,在中性或堿性條件下—COOH會電離成—COO-,可能會導(dǎo)致水凝膠的吸水性能短暫升高,這一特性有助于載菌CS-SH水凝膠在腸液中的釋放;但在酸性條件下,—COOH基團不易解離,而是趨向與SH鏈上的羥基形成離子鍵,從而阻止水分子進入凝膠網(wǎng)絡(luò),使得水凝膠的平衡溶脹度大大下降,這一特性與行云逸等[21]的研究結(jié)果相似。

    圖4 CS-SH水凝膠的溶脹動力學(xué)曲線Fig.4 Swelling porosity of CS-SH hydrogel

    2.6 水凝膠的荷載量及荷載率

    水凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于與外界進行物質(zhì)交換,是一種較好的荷載益生菌的材料[28]。如圖5所示,0.2 g干燥水凝膠的L.rhamnosus、P.acidilactici荷載量分別為1.15×109CFU和1.25×109CFU,荷載率分別為93.36%和88.04%,兩組之間的荷載量無顯著差異,這說明CS-SH水凝膠具有較好的生物相容性;但CS-SH-LR組的荷載率顯著高于CS-SH-PA組(P<0.05),這可能是由于L.rhamnosus菌粉的濃度較低,導(dǎo)致相同時間培養(yǎng)條件下原菌液濃度較低,從而使其荷載率較高。綜上,CS-SH水凝膠具有良好的載菌性能和高生物相容性。

    圖5 CS-SH載菌水凝膠的荷載量及荷載率Fig.5 Loading amounts and loading rates of probiotics into CS-SH hydrogel

    2.7 模擬胃腸液耐受性分析

    一般認(rèn)為,益生菌必須以足量活性狀態(tài)轉(zhuǎn)移到腸道中才能發(fā)揮其理想的益生作用,而大多數(shù)乳酸菌對胃腸道強酸性和高濃度膽鹽環(huán)境的耐受力普遍較弱,很難在這種惡劣環(huán)境下生存。本實驗選用L.rhamnosus、P.acidilactici測定其經(jīng)模擬胃腸液孵育后的存活率。如圖6所示,在SGF中孵育4 h后,L.rhamnosus與P.acidilactici全部喪失活性。此外,這些乳酸菌對腸道消化液也很敏感,孵育后存活的細(xì)胞分別減少94.18%和87.58%。這與大量研究結(jié)果[14,29]一致,絕大多數(shù)益生菌在通過人體胃腸道時會顯著喪失生存能力。

    圖6 游離L.rhamnosus(A)和P.acidilactici(B)在模擬胃腸道中的活性Fig.6 Survival rates of free L.rhamnosus (A) and P.acidilactici (B) in simulated gastrointestinal conditions

    2.8 胃腸消化模擬動力學(xué)曲線

    如圖7A所示,在經(jīng)歷模擬胃腸液孵育后,LR及PA組的活菌數(shù)量均急速降低,約40 min時細(xì)胞存活率分別為3.80%以及4.23%,說明這兩種益生菌對SGF的耐受力較弱。除此之外,包封在水凝膠中的L.rhamnosus、P.acidilactici的釋放量較少,約120 min時分別為18.72%和13.16%,這意味著水凝膠可以提高益生菌在SGF中的存活率。從圖7B可以看出,游離益生菌的活性整體呈降低趨勢,在消化4 h后,細(xì)胞活性約為0.59%,而L.rhamnosus在120 min時,活性消失,說明這兩種益生菌對SIF的耐受性較差,相比之下L.rhamnosus的耐受性更差。包封后的L.rhamnosus、P.acidilactici在SIF中的活性明顯增強,其中CS-SH-LR組在SIF中持續(xù)釋放,細(xì)胞活性維持在20%左右,在120 min后逐漸降低,在240 min時細(xì)胞活性約為3.96%;相比之下CS-SH-PA組的細(xì)胞活性更強,在40 min時細(xì)胞活性達到最大值,約為46.51%,隨后細(xì)胞活性逐漸降低。

    圖7 游離益生菌及CS-SH載菌水凝膠在模擬胃腸液中的動力學(xué)曲線Fig.7 Kinetic curves of free probiotics and bacteria-loaded CS-SH hydrogel in simulated gastroenteric fluid

    游離益生菌及益生菌水凝膠在模擬胃腸液中連續(xù)消化的涂布結(jié)果如圖7C、D所示。與細(xì)胞活性結(jié)果不同的是,游離益生菌在SGF中消化60 min后已全部失活,這可能是由于胃液消化導(dǎo)致細(xì)胞損傷,使其無法在平板上生長形成菌落;益生菌水凝膠在120 min內(nèi)均未在平板上形成菌落(圖7C),這可能是由于水凝膠外圍不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)在消化過程中逐漸掉落,但荷載的益生菌仍黏附在水凝膠壁上,這些益生菌仍具有一定的活性,從而導(dǎo)致MTT法測定結(jié)果具有一定的細(xì)胞活性。游離益生菌在模擬腸消化過程中全部失活,而益生菌水凝膠進入SIF時立即溶脹,釋放益生菌,在模擬腸消化初期,益生菌數(shù)量逐漸減少,這可能是由于腸液中膽鹽的作用;CS-SH-LR組以及CS-SH-PA組益生菌數(shù)量分別在80 min及120 min時逐漸增加,分別在200 min及160 min時達到最大值,菌落數(shù)分別為6.30(lg(CFU/mL))和6.12(lg(CFU/mL))(圖7D),這是由于水凝膠中益生菌在SIF中釋放繁殖,隨后活菌數(shù)便逐漸下降。

    與游離益生菌相比,益生菌水凝膠在經(jīng)過模擬胃腸液連續(xù)孵育后仍能保持腸道中的細(xì)胞活力在20%以上,SIF中的菌落數(shù)均能維持在5(lg(CFU/mL))左右,有利于益生菌在人體腸道中定植。相比之下,游離的益生菌對這種連續(xù)性損傷高度敏感,幾乎沒有活菌殘留。這些結(jié)果證實了水凝膠封裝技術(shù)在L.rhamnosus、P.acidilactici應(yīng)對胃腸道挑戰(zhàn)時所提供的巨大生存優(yōu)勢。

    2.9 動力學(xué)模型

    益生菌水凝膠的體外釋放機制可分為3 種,分別是擴散控制、降解溶蝕控制以及溶脹控制[30]。利用Origin軟件對CS-SH-LR組及CS-SH-PA組的腸消化涂布結(jié)果進行擬合,建立其在SIF中釋放動力學(xué)方程。如表2所示,益生菌水凝膠的體外釋放Weibull分布方程模型擬合效果最好,CS-SH-LR和CS-SH-PA的決定系數(shù)R2分別為0.868 1以及0.907 0,釋放機制主要為表面侵蝕釋放作用[30]。

    表2 CS-SH載菌水凝膠在腸液中的釋放動力學(xué)模型擬合Table 2 Kinetic models for the release of bacteria-loaded CS-SH hydrogel in simulated intestinal fluid

    3 結(jié)論

    本研究采用物理交聯(lián)方法制備了CS-SH水凝膠。該水凝膠設(shè)計依據(jù)是在酸性環(huán)境下CS分子鏈上的氨基易電離,帶有大量正電荷,而SH的表面帶有羧基,可以與電離的CS通過靜電相互作用結(jié)合,形成物理交聯(lián)水凝膠。將水凝膠浸沒在對數(shù)生長期的L.rhamnosus、P.acidilactici菌液中,共同培養(yǎng)12 h,即得荷載益生菌的CS-SH水凝膠。在1 500~1 680 cm-1處,與CS組相比,CS-SH水凝膠吸收峰紅移,與SH組相比,其吸收峰藍(lán)移,說明CS、SH成功通過靜電相互作用交聯(lián)。載菌性能結(jié)果表明MRS對水凝膠質(zhì)構(gòu)特性影響最大,但不影響水凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu),且荷載益生菌可以緩解該影響;水凝膠結(jié)晶度低、非結(jié)晶態(tài),載菌后水凝膠結(jié)構(gòu)更松散,各物質(zhì)之間具有良好的相容性;CS-SH水凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較均勻,孔洞較大,孔洞壁較薄,結(jié)構(gòu)較脆,益生菌附著在水凝膠壁上,形態(tài)良好。在30~150 min之間,CS-SH水凝膠在SIF中的溶脹度均高于在SGF中的溶脹度,有助于益生菌的控釋。CS-SH水凝膠對L.rhamnosus和P.acidilactici的荷載量分別為1.15×109CFU和1.25×109CFU,荷載率分別為93.36%和88.04%,兩組之間的荷載量無顯著差異,這說明CS-SH水凝膠具有較好的生物相容性,是一種較好的荷載益生菌材料;模擬胃腸消化結(jié)果顯示,CS-SH水凝膠對益生菌具有保護作用,具有較好的腸道緩釋特性,其釋放機制為表面侵蝕釋放作用。物理交聯(lián)水凝膠荷載益生菌在實際應(yīng)用中有重要意義,天然生物成分通過物理交聯(lián)合成水凝膠,并對荷載益生菌進行靶向運輸,這可能成為益生菌遞送體系研究的突破點。

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