不同富硒方式對(duì)甘薯葉蛋白抗氧化活性的影響

高 琦，段文瀚，彭 雪，王 寧，盧雅婷，張 倩，薛友林,*

（1.遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2.中共遼寧省委黨校，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

甘薯在我國(guó)是一種重要的農(nóng)作物，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[1-2]。人們對(duì)甘薯的利用目前大多集中于其塊根，但甘薯葉也頗具研究?jī)r(jià)值。在粗蛋白含量方面，甘薯葉高于甘薯塊根[3]，約為芹菜、黃瓜的4 倍。甘薯葉含有豐富的胡蘿卜素、VB1、VB2、VC以及鐵、鈣、鎂等礦質(zhì)元素[4-5]，目前已有很多利用甘薯葉研制出的保健飲料或茶在售[6-7]。此外，甘薯莖、葉等地上部分還可取代面包中10%～15%的淀粉，具有改善食品特性的潛質(zhì)[8-9]。同時(shí)甘薯葉中蛋白質(zhì)含量高、必需氨基酸種類豐富、氨基酸比例較好[10]。甘薯葉的抗氧化性往往與其中酚類、花青素等多種成分的含量正相關(guān)，其對(duì)于癌癥、哮喘、糖尿病、心血管疾病等的預(yù)防具有重要的作用[11]。因此，科學(xué)地開(kāi)發(fā)新型甘薯葉產(chǎn)品具有一定的意義。植物葉蛋白是世界上最大的可再生資源之一，具有很高的開(kāi)發(fā)價(jià)值[12]。從綠葉中提取的葉蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的新型蛋白資源，未來(lái)在飼料、醫(yī)療等多個(gè)方面具有很廣的應(yīng)用前景[13]。甘薯葉也含有豐富的蛋白質(zhì)，其粗蛋白含量約為21.1%～25.1%。不同種甘薯葉的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量差異較大，一般綠葉尖甘薯葉粗蛋白質(zhì)、VC、Ca、Na含量高于紫綠色甘薯葉，而紫綠色甘薯葉的葉綠素和類胡蘿卜素含量高于綠葉尖甘薯葉[9]。本實(shí)驗(yàn)采用葉尖顏色為綠色的甘薯葉，因此具有較多的粗蛋白與維生素，經(jīng)提取后可作為添加劑用以豐富產(chǎn)品口感、提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，這種可再生蛋白資源的開(kāi)發(fā)可以提高資源利用率，為可持續(xù)發(fā)展與資源的合理利用提供可行方案[14]。

硒對(duì)于人體有著重要的作用，在免疫、抗氧化、解毒等[15]方面均有重要作用。對(duì)于成人，世界衛(wèi)生組織設(shè)定的每日硒攝入量為30～40 μg[16]，而很多地區(qū)居民的硒攝入量不達(dá)標(biāo)，我國(guó)國(guó)土面積近72%的地區(qū)為貧硒地帶，其中30%的地區(qū)嚴(yán)重缺硒，因此很多地區(qū)克山病等疾病發(fā)病率很高。在免疫方面，硒能夠提高機(jī)體巨噬細(xì)胞對(duì)病原體的吞噬作用，增強(qiáng)殺菌能力，還能提升機(jī)體淋巴細(xì)胞的分化能力。在抗氧化方面，硒能通過(guò)參與硒蛋白合成的方式在生物體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，如參與谷胱甘肽過(guò)氧化酶、硫氧還蛋白還原酶的合成。此外，硒還具有預(yù)防克山病、抗腫瘤和解毒等功效[17]。研究表明，施硒具有影響植物生長(zhǎng)的效果?？刂坪线m的施硒濃度，不僅能提高水稻的硒含量，還具有促進(jìn)水稻增產(chǎn)的作用[18]。此外，施硒可抑制獼猴桃果實(shí)中有害元素的積累，能對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分含量、香氣、風(fēng)味及外觀特性等多個(gè)方面產(chǎn)生積極影響[19]。研究表明，對(duì)紅富士蘋果外源富硒可提高其VC含量，并使其口感更為甜美[20]。在甘薯方面，施硒可以使甘薯硒含量顯著提高[21]，并能提高甘薯塊可溶性蛋白含量及甘薯產(chǎn)量[22]。

本研究采用葉面噴淋與土壤灌注兩種方法對(duì)甘薯進(jìn)行富硒，并設(shè)定富硒質(zhì)量濃度梯度，待植株成熟采摘其葉片，提取其葉蛋白，測(cè)定甘薯葉總硒含量、蛋白硒含量及葉蛋白的多項(xiàng)抗氧化活性指標(biāo)，以期解釋不同富硒方式對(duì)甘薯葉蛋白產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)使用甘薯種植于遼寧省沈陽(yáng)市沈北新區(qū)華實(shí)生態(tài)基地石佛寺實(shí)驗(yàn)田，實(shí)驗(yàn)中對(duì)甘薯采用葉面噴淋與土壤灌注兩種方式進(jìn)行富硒。葉面富硒方法為先種植甘薯，之后在甘薯葉面噴灑亞硒酸鈉溶液；土壤富硒則是以亞硒酸鈉作為外源硒對(duì)土壤施硒，富硒質(zhì)量濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)以穴播方式種植甘薯，在5月中旬進(jìn)行種植，于7、8、9月分3 次分別對(duì)不同試驗(yàn)田中的葉面與土壤每次施硒約333 mL（共1.0 L），施硒地塊面積為162 m2。于當(dāng)年10月10日收獲甘薯植株，共歷時(shí)148 d。試驗(yàn)田每個(gè)方塊3 m×3 m，共18 個(gè)方塊。將每個(gè)方塊分為17 壟，共種植3 行。每個(gè)方塊種植50 株幼苗，株距為0.3 m[23]。

鹽酸、氫氧化鈉 天津永大化學(xué)試劑有限公司；磷酸、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺天津市大茂化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán) 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；沒(méi)食子酸 上海研恬生物科技有限公司；蘆丁、福林-酚試劑、甘氨酸 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-250紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；MC-SP2115多功能電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司；MD8H型微波消解儀、AFS-9800型雙道原子熒光分光光度計(jì) 上海奧普樂(lè)儀器有限公司；TG16G臺(tái)式高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FB124電子電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SZ-500A-3超高速多功能粉碎機(jī) 永康市善竹貿(mào)易有限公司；PHS-3CB型pH計(jì)上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

采摘新鮮的富硒甘薯葉，除去其表面的泥土污垢等雜質(zhì)，按不同富硒質(zhì)量濃度及不同富硒方式進(jìn)行分類包裝，并在-20 ℃冰箱中保藏。

1.3.2 富硒甘薯葉蛋白提取

利用甘薯葉中大部分蛋白可溶于稀堿溶液的性質(zhì)，將新鮮的甘薯葉去除葉柄，加入0.3%的亞硫酸氫鈉溶液進(jìn)行打漿，離心以去除不溶性物質(zhì)。取上清液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.5，此時(shí)甘薯葉蛋白達(dá)到等電點(diǎn)絮凝沉淀，經(jīng)離心分離便可得到蛋白沉淀物，再以稀氫氧化鈉溶液復(fù)溶，經(jīng)過(guò)冷凍干燥可得到甘薯葉可溶性分離蛋白粉[23]。

1.3.3 甘薯葉硒含量測(cè)定

稱取0.1 g干葉，將葉片放置于聚四氟乙烯消化瓶中，在瓶中加入6.0 mL的混合酸（由5.0 mL的純硝酸溶液與1.0 mL的純氫氟酸溶液混合而成）后密封，將瓶放入微波消化儀中進(jìn)行消化操作，在10 min內(nèi)升溫至90 ℃，在7 W條件下（后同）消化10 min，繼續(xù)升溫至130 ℃消化10 min，冷卻。冷卻后加入5.0 mL濃鹽酸，200 ℃加熱至溶液清亮無(wú)色并有白煙出現(xiàn)，繼續(xù)加熱至剩余2～3 mL，冷卻至室溫，定容至25 mL。消化完成后，使用原子熒光光譜法對(duì)待測(cè)液中的硒含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 甘薯葉蛋白硒含量測(cè)定

取0.1 g甘薯葉蛋白樣品，按1.3.3節(jié)方法進(jìn)行消化，升溫至100 ℃，在7 W條件下消化5 min，后續(xù)升溫至120 ℃，再次在7 W條件下消化8 min。將反應(yīng)后的溶液定容至20 mL，最終以熒光光譜法測(cè)定硒含量。

1.3.5 甘薯葉蛋白總酚含量測(cè)定

總酚含量測(cè)定參照Z(yǔ)hang Lihua等[24]的方法，稱取0.010 g沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品定容于50 mL容量瓶中，分別吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3.0 mL移入試管中加水稀釋至10 mL，吸取1 mL稀釋液，依次加入2 mL 10%福林-酚試劑、4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%碳酸鈉溶液，加水定容至25 mL，于45 ℃條件下避光反應(yīng)1 h，于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取0.2 g不同富硒質(zhì)量濃度的甘薯葉蛋白樣品（葉面富硒后的未富硒（0 mg/mL）、低硒（0.4 mg/mL）、高硒樣品（2.0 mg/mL），后同）于離心管中，加入5 mL 50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液，55 ℃密封水浴浸提3 h，之后于10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液保存，即為樣品提取液。

吸取樣品提取液1 mL，再次進(jìn)行上述操作后，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得甘薯葉蛋白樣品中總酚含量，結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示，單位為mg/g。

1.3.6 甘薯葉蛋白總黃酮含量測(cè)定

總黃酮含量測(cè)定參照張一鳴等[25]的方法，稱取0.010 g蘆丁，于體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液中溶解并定容至100 mL容量瓶中，制成0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取剛配制好的蘆丁溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于6 個(gè)大試管中，用50%乙醇溶液補(bǔ)至10 mL后，加入0.8 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液搖勻，靜置6 min，加入0.8 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3)3溶液后搖勻，靜置6 min后加入10 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻后靜置15 min，于分光光度計(jì)510 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取1.3.5節(jié)所制備樣品提取液1 mL，再次進(jìn)行上述操作后，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得甘薯葉蛋白樣品中總黃酮含量，結(jié)果以蘆丁當(dāng)量表示，單位為mg/g。

1.3.7 甘薯葉蛋白抗氧化活性測(cè)定

1.3.7.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定

參考van Amsterdam等[26]的方法，將2 mL不同富硒質(zhì)量濃度的蛋白樣品（未富硒樣品，葉面富硒后的低硒、高硒樣品，土壤富硒后的低硒、高硒樣品，下同）加入2 mL 0.06 mg/mL DPPH-乙醇溶液中，避光30 min后測(cè)定吸光度，并與VC和亞硒酸鈉進(jìn)行對(duì)比。未添加樣品的空白組吸光度記為A1，添加樣品或VC或亞硒酸鈉的實(shí)驗(yàn)組吸光度記為A2，DPPH自由基清除率按照式（1）計(jì)算：

1.3.7.2 羥自由基清除能力測(cè)定

在試管中加入0.5 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、5 mL過(guò)氧化氫溶液和1 mL不同富硒質(zhì)量濃度的蛋白樣品，充分混勻后37 ℃恒溫水浴20 min，并在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，用純水做對(duì)照實(shí)驗(yàn)[27]，并與VC和亞硒酸鈉進(jìn)行對(duì)比。添加樣品或VC或亞硒酸鈉的實(shí)驗(yàn)組吸光度記為A1，不加過(guò)氧化氫的空白組吸光度記為A2，不加樣品的空白組吸光度記為A0，羥自由基清除率按照式（2）計(jì)算：

1.3.7.3 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

分別配制不同富硒質(zhì)量濃度的蛋白樣品溶液1 mL，與4.5 mL Tris-HCl緩沖溶液（0.05 mol/L pH 8.2）、1 mL去離子水混合，25 ℃水浴20 min，加入0.5 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，25 ℃水浴5 min，加入1 mL 8 mol/L HCl，在320 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度Ax，用0.5 mL的蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，所測(cè)得吸光度記為A0；取1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為對(duì)照組，所測(cè)得吸光度記為Ax0，并分別以VC和Na2SeO3作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，超氧陰離子自由基清除率按照式（3）計(jì)算[28]：

1.3.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

根據(jù)Backman等[29]的方法稍作修改，配制15%的分離膠和5%的濃縮膠。選擇富硒質(zhì)量濃度為0、0.4、2.0 mg/mL的甘薯葉蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。樣品添加樣品緩沖液和β-巰基乙醇后用渦旋振蕩器混勻，之后將樣品和Marker（分子質(zhì)量14.4～97.4 kDa）置于沸水中煮沸6 min，冷卻后進(jìn)行電泳，樣品的上樣量為15 μL，Marker上樣量為10 μL。電泳電壓設(shè)置為80 V，待樣品和Marker指示條帶進(jìn)入分離膠時(shí)，上調(diào)電壓至120 V，直至電泳結(jié)束，將凝膠染色1 h左右隨后脫色（更換3 次脫色液），照膠成像。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2010、SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用±s表示。相關(guān)性分析采用雙變量Spearman檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同富硒方式對(duì)甘薯葉總硒含量及葉蛋白硒含量的影響

葉面富硒與土壤富硒之后，甘薯葉的總硒含量都有所提高（圖1A），其中葉面富硒情況下甘薯葉的總硒含量在多數(shù)情況下高于土壤富硒。相較于土壤富硒，葉面富硒的葉總硒含量受富硒質(zhì)量濃度變化影響更為明顯，變化幅度更大。在富硒質(zhì)量濃度達(dá)到1.6 mg/mL時(shí)，葉面富硒后的總硒含量最大，為4.37 mg/g，而1.2 mg/mL條件下，土壤富硒的總硒含量達(dá)到最大，為1.66 mg/g。由此可見(jiàn)，甘薯葉在富硒質(zhì)量濃度增加到極限值后便不會(huì)繼續(xù)提高，其極限富硒質(zhì)量濃度為1.2～1.6 mg/mL，葉面富硒甘薯葉極限硒含量為4.37 mg/g，土壤富硒樣品極限硒含量?jī)H為1.66 mg/g。相比之下，花生葉的極限富硒質(zhì)量濃度也在1.6 mg/mL左右[30]；葡萄則無(wú)極限富硒質(zhì)量濃度，在2.0 mg/mL范圍內(nèi)硒含量不斷提升[31]。研究表明甘薯施硒過(guò)量會(huì)導(dǎo)致甘薯中硒含量反而降低[32]，本實(shí)驗(yàn)與該研究結(jié)果基本相符。而葉面富硒相較于土壤富硒，受過(guò)量施硒的影響更小。

圖1 不同富硒質(zhì)量濃度兩種富硒方式甘薯葉總硒含量（A）與葉蛋白硒含量（B）Fig.1 Total Se (A) and protein-bound Se contents (B) in Se-enriched sweet potato leaves with two Se application methods at different concentrations

如圖1B所示，在蛋白硒含量方面，葉面富硒后甘薯葉的蛋白硒含量總體緩慢上升，而土壤富硒后蛋白硒含量則受富硒質(zhì)量濃度影響很小。在富硒質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，蛋白硒含量最高，為22.00 mg/g。而對(duì)于土壤富硒，在富硒質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，蛋白硒含量最高，為2.71 mg/g。在富硒質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時(shí)，兩種富硒處理組蛋白硒含量分別達(dá)到20.10 mg/g與1.68 mg/g。綜上，葉面富硒對(duì)甘薯葉蛋白硒含量有顯著提升，即葉面富硒更有利于硒與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

2.2 不同富硒方式對(duì)甘薯葉蛋白總酚、總黃酮含量的影響

如表1所示，對(duì)不同富硒質(zhì)量濃度甘薯葉蛋白的總酚、總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，用于后續(xù)分析富硒過(guò)程中總酚與總黃酮含量是否會(huì)對(duì)葉蛋白抗氧化活性產(chǎn)生影響。

表1 葉面富硒甘薯葉蛋白總酚、總黃酮含量Table 1 Contents of total polyphenols and flavonoids in leaf proteins from sweet potato with foliar Se application

2.3 不同富硒方式對(duì)甘薯葉蛋白抗氧化活性的影響

2.3.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基因具有良好的接受電子與氫自由基形成穩(wěn)定化合物的能力，其清除能力能夠較好地反映物質(zhì)的抗氧化活性[33]。由圖2可知，VC對(duì)DPPH自由基具有很強(qiáng)的清除能力，而相比之下無(wú)機(jī)硒（亞硒酸鈉）的清除能力則較低。隨著蛋白溶液質(zhì)量濃度的增大，未施硒對(duì)照組的DPPH自由基清除率逐漸增大，在溶液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，其DPPH自由基清除率達(dá)到（48.67±4.36）%。

圖2 葉面富硒（A）與土壤富硒（B）甘薯葉蛋白在不同質(zhì)量濃度條件下的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging capacity of various concentrations of leaf proteins from sweet potato with foliar (A) and soil (B) application

在兩種方式富硒后，甘薯葉蛋白對(duì)DPPH自由基的清除率都相較無(wú)硒對(duì)照組更高，在溶液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，土壤富硒后高硒質(zhì)量濃度溶液的DPPH自由基清除率達(dá)到（92.87±1.03）%，葉面高硒質(zhì)量濃度溶液的DPPH自由基清除率也達(dá)到（91.22±0.64）%。因此，富硒能夠提高甘薯葉蛋白的DPPH自由基清除率。從富硒質(zhì)量濃度角度看，葉面富硒與土壤富硒在高富硒質(zhì)量濃度時(shí)的DPPH自由基清除能力均強(qiáng)于低富硒質(zhì)量濃度時(shí)的清除能力。

2.3.2 羥自由基清除能力

如圖3所示，隨著蛋白溶液質(zhì)量濃度的增大，幾組樣品羥自由基清除能力均不同程度增強(qiáng)。VC的羥自由基清除能力最強(qiáng)，在蛋白溶液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，達(dá)到（98.71±0.43）%，無(wú)機(jī)硒（亞硒酸鈉）的羥自由基清除能力也很強(qiáng)，在蛋白溶液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)達(dá)到（87.93±0.01）%。而甘薯葉蛋白也具有一定的羥自由基清除能力，在0.2 mg/mL質(zhì)量濃度條件下，未富硒甘薯葉蛋白的羥自由基清除率為（12.25±0.57）%。在施硒處理后，甘薯葉蛋白的羥自由基清除率小幅度增加。且在高硒情況下，羥自由基的清除率高于低硒時(shí)的清除率。在0.2 mg/mL質(zhì)量濃度條件下，葉面高硒質(zhì)量濃度溶液羥自由基清除率為（14.07±0.20）%，土壤高硒質(zhì)量濃度溶液的羥自由基清除率為（17.49±0.85）%。綜上，無(wú)機(jī)硒對(duì)甘薯葉蛋白的羥自由基清除能力有一定影響，通過(guò)富硒可以使甘薯葉蛋白羥自由基清除能力提升。

圖3 葉面富硒（A）與土壤富硒（B）甘薯葉蛋白在不同質(zhì)量濃度條件下的羥自由基清除率Fig.3 Hydroxyl radical scavenging capacity of various concentrations of leaf proteins from sweet potato with foliar (A) and soil (B)Se application

2.3.3 超氧陰離子自由基清除能力

如圖4所示，VC的超氧陰離子自由基清除能力在各種樣品中最強(qiáng)，在0.2 mg/mL質(zhì)量濃度條件下，其清除率為（89.92±0.48）%，而無(wú)機(jī)硒（亞硒酸鈉）對(duì)于超氧陰離子自由基的清除能力很弱，在0.2 mg/mL時(shí)僅為（6.54±0.40）%，富硒后的甘薯葉蛋白的超氧陰離子自由基清除能力相比未施硒的葉蛋白都有所提升，在溶液質(zhì)量濃度0.20 mg/mL條件下，相比未富硒甘薯葉蛋白，高硒甘薯葉蛋白的超氧陰離子自由基清除率提升了19.17%。這說(shuō)明在硒與蛋白結(jié)合后，能夠提高甘薯葉蛋白的抗氧化活性，超氧陰離子自由基清除能力是通過(guò)與蛋白結(jié)合而提升。

圖4 葉面富硒（A）與土壤富硒（B）甘薯葉蛋白在不同質(zhì)量濃度條件下的超氧陰離子自由基清除率Fig.4 Superoxide anion radical scavenging capacity of various concentrations of leaf proteins from sweet potato with foliar (A) and soil Se (B) application

由圖4可知，高硒葉蛋白的超氧陰離子自由基清除能力均高于低硒葉蛋白。葉面高硒質(zhì)量濃度樣品在0.2 mg/ mL 時(shí)超氧陰離子自由基清除率為（83.48±0.69）%，而土壤高硒質(zhì)量濃度樣品在0.2 mg/ mL 時(shí)超氧陰離子自由基清除率為（88.29±2.41）%，均高于無(wú)機(jī)硒組。

2.4 SDS-PAGE分析結(jié)果

由圖5可以看出，3 個(gè)質(zhì)量濃度蛋白所得條帶之間無(wú)明顯差異。電泳條帶在28～40 kDa范圍內(nèi)比較集中。可以看出富硒后甘薯葉蛋白出現(xiàn)了8 條較明顯的條帶，說(shuō)明甘薯葉蛋白中蛋白質(zhì)種類豐富。研究表明，甘薯葉蛋白在53 kDa存在條帶，且為主要條帶，此條帶對(duì)應(yīng)1,5-二磷酸羧化酶[34-35]，是植物光合作用中固定二氧化碳的酶，本實(shí)驗(yàn)中53 kDa處的蛋白與上述研究結(jié)果相符。

圖5 葉面富硒甘薯葉蛋白的SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE patterns of leaf proteins from sweet potato with foliar Se application

2.5 相關(guān)性分析

通過(guò)對(duì)硒含量的測(cè)定，已得出葉面富硒后甘薯葉蛋白中硒含量更高的結(jié)論，因此選取葉面富硒的甘薯葉蛋白在質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL時(shí)的抗氧化活性與甘薯葉蛋白中主要成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析。由表2可知，葉蛋白中各組分含量與抗氧化活性間有不同程度的相關(guān)性。DPPH自由基清除率與各組分含量均無(wú)顯著相關(guān)性；羥自由基清除率與葉硒含量極顯著相關(guān)，并與葉蛋白中總多酚含量顯著相關(guān)；超氧陰離子自由基清除率與葉蛋白硒含量、總黃酮含量極顯著相關(guān)，與蛋白質(zhì)含量顯著相關(guān)?？傊?，對(duì)甘薯葉蛋白抗氧化活性影響更強(qiáng)的因素為硒含量，而總多酚、總黃酮含量也對(duì)甘薯葉蛋白抗氧化活性有一定影響。有研究表明，土壤中的亞硒酸根部分會(huì)被植物根部轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒化合物而留在根部，部分會(huì)通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸運(yùn)至其他組織中，在葉片中，亞硒酸根會(huì)參與硒代半胱氨酸（SeCys）與硒代蛋氨酸（SeMet）等有機(jī)硒化物的合成[36]。此外，硒也能夠促進(jìn)植物多酚類與花青素的積累[37]，具體機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。綜上，富硒會(huì)影響植物中蛋白合成等多個(gè)代謝過(guò)程，從而對(duì)代謝產(chǎn)物含量產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響葉蛋白的抗氧化活性。從相關(guān)性分析也可得出，甘薯葉蛋白的抗氧化活性的變化是富硒對(duì)多種物質(zhì)含量影響共同導(dǎo)致的。

表2 甘薯葉蛋白中各組分含量與其抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between components in and antioxidant activity of sweet potato leaf proteins

3 結(jié)論

相對(duì)于土壤富硒，葉面富硒是更為有效的富硒方式。葉面富硒后，甘薯葉蛋白的總硒含量與蛋白硒含量都高于土壤富硒，即葉面富硒后，既能提升甘薯葉中硒含量，也能讓硒更好地與甘薯葉蛋白結(jié)合。而在抗氧化活性方面，葉面與土壤富硒后的甘薯葉蛋白DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力均高于未富硒樣品，高富硒質(zhì)量濃度樣品在超氧陰離子自由基與羥自由基清除方面也強(qiáng)于低富硒質(zhì)量濃度樣品。因此，富硒可以更好地提升甘薯葉蛋白的抗氧化活性。從SDS-PAGE結(jié)果分析，不同富硒質(zhì)量濃度對(duì)甘薯蛋白種類無(wú)顯著影響。在實(shí)際生產(chǎn)甘薯時(shí)，高富硒質(zhì)量濃度能讓甘薯葉蛋白具有更好的抗氧化活性，葉面施硒可顯著提升甘薯葉硒含量，葉面富硒效果更佳，是值得推廣的富硒方式。