核桃多肽結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性

張子杰，田益玲，夏君霞，馬愛進(jìn),*

（1.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；3.河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司，河北 衡水 053000）

核桃是一種廣泛分布在世界各地的堅(jiān)果，在全球范圍內(nèi)被商業(yè)化種植[1]，其主要成分包括脂肪和蛋白質(zhì)[2]。在壓榨核桃油的過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的核桃粕，其中富含各種蛋白質(zhì)[3]。核桃蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，可以滿足成年人的基本氨基酸需求。然而，與核桃蛋白相比，核桃肽具有更好的溶解性、吸濕性、乳化性和胃腸消化的穩(wěn)定性等優(yōu)良特性[4-6]。此外，核桃多肽具有多種生物功能，在抗氧化、降血脂、抗腫瘤、改善記憶和降低患阿爾茨海默癥風(fēng)險(xiǎn)以及改善腸道菌群等方面具有顯著的效果[7-15]。

近年來，越來越多的研究致力于從植物蛋白中提取抗氧化活性肽[16]。植物抗氧化肽有諸多優(yōu)勢，如改善與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病[17-18]。以往的研究表明，天然抗氧化劑可以減緩食品的氧化過程[19-20]，提高質(zhì)量并延長保質(zhì)期[21-22]。將植物蛋白作為天然抗氧化肽的來源進(jìn)行探索和商業(yè)化，能夠促進(jìn)自然資源的可持續(xù)利用。核桃粕所富含的蛋白質(zhì)資源顯示出制備抗氧化肽的巨大潛力[23-24]。一些文獻(xiàn)報(bào)道了核桃多肽的抗氧化活性，如郭勇等[25]測定了長白山核桃源五肽對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。然而，目前關(guān)于核桃多肽抗氧化作用和結(jié)構(gòu)表征的系統(tǒng)性研究報(bào)道較少。因此需要更多的研究以深入了解核桃多肽在抗氧化過程中的具體機(jī)制，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的表征和分析。這將有助于揭示核桃多肽的結(jié)構(gòu)特征與其抗氧化活性之間的關(guān)聯(lián)，為其進(jìn)一步應(yīng)用于食品工業(yè)等領(lǐng)域提供科學(xué)依據(jù)。

本研究以核桃粕作為原料，通過復(fù)合酶酶解的方法制備核桃多肽，對(duì)其進(jìn)行抗氧化性分析、結(jié)構(gòu)表征，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索核桃多肽對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用。以期為核桃高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃粕 河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測定試劑盒、還原型谷胱甘肽酶（glutathione reductase，GSHRx）測定試劑盒、總谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；羥自由基清除能力檢測試劑盒 蘇州格銳思生物科技有限公司；胰蛋白酶、堿性蛋白酶、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美國Biotopped公司；過硫酸鉀 上海Aladdin公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī) 日本日立公司；多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；精密pH計(jì)、電子分析天平 梅特勒托利多科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ABTS陽離子自由基清除能力測定

將0.35 mL ABTS陽離子自由基溶液（7.4 mmol/L）與0.35 mL過硫酸鉀溶液（2.6 mmol/L）混合，將其避光放置12～16 h，得到ABTS陽離子自由基工作液。用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液稀釋混合液（體積比約1∶35），測得734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。每個(gè)孔中加入160 μL的ABTS陽離子自由基工作液。在樣品孔中加入40 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，輕輕混合，并在室溫條件下避光環(huán)境孵育6 min。在734 nm波長處測量吸光度[26]。用無水乙醇替代樣品作為空白組，用無水乙醇替代ABTS陽離子自由基工作溶液作為對(duì)照組，ABTS陽離子自由基清除率按式（1）計(jì)算：

式中：Ab為空白組的吸光度；As為樣品組的吸光度；Ac為對(duì)照組的吸光度。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

將100 μL樣品溶液和100 μL的0.1 mmol/L DPPH溶液（無水乙醇配制）加入到96 孔板中，混合均勻，在室溫黑暗條件下孵育30 min后，測量517 nm波長處吸光度As；用蒸餾水與DPPH溶液混合反應(yīng)作為空白組，測量吸光度Ab；無水乙醇代替DPPH溶液混合反應(yīng)，測量吸光度Ac[27]。DPPH自由基清除率按式（2）計(jì)算：

1.3.3 羥自由基清除能力的測定

使用試劑盒測定羥自由基清除能力。根據(jù)說明書設(shè)置空白組、對(duì)照組和樣品組，并依次加入試劑。在37 ℃條件下反應(yīng)20 min，測量510 nm波長處吸光度。羥自由基清除率按式（3）計(jì)算：

式中：Ab為空白組的吸光度；As為樣品組的吸光度；Ac為對(duì)照組的吸光度。

1.3.4 核桃多肽的制備

核桃粕蛋白提取采用堿提酸沉法，將脫脂核桃粕低溫粉碎、過篩，與蒸餾水以一定比例混合，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.6，堿溶1 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液，調(diào)pH值至4.6，酸沉1 h，8 000 r/min離心，水洗3 次，調(diào)節(jié)pH值為7.0，冷凍干燥，得核桃蛋白。

核桃多肽制備方法參考文獻(xiàn)[28]并略作修改。將100 g核桃蛋白加入1.9 L去離子水中，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?。將pH值調(diào)至8.0，加入堿性蛋白酶400 000 U和胰蛋白酶200 000 U，并在50 ℃水解4 h。在4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，凍干。凍干后的核桃蛋白水解產(chǎn)物粉末在-20 ℃條件下保存。

1.3.5 核桃多肽的超濾分級(jí)

核桃蛋白水解產(chǎn)物溶液在超濾過程中通過3 個(gè)特定分子質(zhì)量超濾膜。首先，核桃蛋白水解產(chǎn)物溶液經(jīng)過截留分子質(zhì)量為10 kDa的超濾膜，允許分子質(zhì)量＜10 kDa的核桃蛋白水解產(chǎn)物通過。再使用截留分子質(zhì)量為3 kDa的超濾膜進(jìn)一步分離，最后使用截留分子質(zhì)量為1 kDa的超濾膜，以獲得不同分子質(zhì)量的餾分。分別收集到＜1 kDa、1～3 kDa、3～10 kDa和＞10 kDa 4 個(gè)不同分子質(zhì)量范圍的核桃蛋白水解產(chǎn)物餾分。在真空下干燥，以獲得這些特定分子質(zhì)量范圍內(nèi)的核桃蛋白水解產(chǎn)物粉末。

1.3.6 掃描電鏡觀察

將干燥的核桃多肽樣品用導(dǎo)電膠固定在樣品座上，置于掃描電鏡觀察臺(tái)，調(diào)節(jié)掃描電鏡焦距至清晰，分別觀察放大5 000 倍和1 000 倍的圖像。

1.3.7 紫外全波長掃描

稱取核桃多肽粉末溶于蒸餾水，使其終質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL。蒸餾水作為空白組，與多肽樣品溶液分別在200～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長掃描。

1.3.8 熒光光譜分析

測定核桃多肽組分的熒光光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。稱取核桃多肽粉末溶于蒸餾水，使其終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。激發(fā)波長為285 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，研究核桃多肽樣品在發(fā)射光譜300～400 nm波長范圍的熒光光譜，掃描5 次。

1.3.9 圓二色光譜分析

使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將樣品溶解至質(zhì)量濃度0.2 mg/mL。在波長190～260 nm范圍測定圓二色光譜，步長1 nm。以PBS作為空白對(duì)照，空白對(duì)照與樣品溶液上樣量均為300 μL，測試后保存數(shù)據(jù)，計(jì)算樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.10 HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

HepG2細(xì)胞在由10%胎牛血清和90%高糖DMEM培養(yǎng)基組成的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，加入胰酶細(xì)胞消化液進(jìn)行傳代。將對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞在6 孔板或96 孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.10.1 核桃多肽對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

取生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，消化細(xì)胞，輕輕吸打使細(xì)胞重懸。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，之后將HepG2細(xì)胞接種到96 孔板中，密度為1×105個(gè)/mL，每孔100 μL。然后將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。在細(xì)胞面積達(dá)到70%～80%后，吸去原來的培養(yǎng)基。設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白組、未經(jīng)處理HepG2細(xì)胞的對(duì)照組以及在各孔中加入質(zhì)量濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL核桃肽溶液的樣品組，培養(yǎng)24 h。引入CCK-8溶液并進(jìn)一步培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀測量各組在490 nm波長處的OD值。細(xì)胞存活率按式（4）計(jì)算：

1.3.10.2 H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白組、未經(jīng)處理HepG2細(xì)胞的對(duì)照組以及在各孔中加入終濃度62.5、125、250、500、1 000 μmol/L H2O2溶液的模型組，培養(yǎng)4 h。引入CCK-8溶液并進(jìn)一步培養(yǎng)2 h，按1.3.10.1節(jié)方法測定細(xì)胞存活率。

1.3.10.3 核桃多肽預(yù)處理對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞存活率的影響

設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白組、未經(jīng)處理HepG2細(xì)胞的對(duì)照組、未經(jīng)處理HepG2細(xì)胞的模型組以及在各孔中加入0.4、0.6、0.8 mg/mL核桃肽溶液的樣品組，培養(yǎng)24 h。吸去原有培養(yǎng)基，在模型組及樣品組中加入800 μmol/L H2O2溶液，培養(yǎng)4 h。引入CCK-8溶液并進(jìn)一步培養(yǎng)2 h，按1.3.10.1節(jié)方法測定細(xì)胞存活率。

1.3.10.4 核桃多肽預(yù)處理對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

細(xì)胞培養(yǎng)方法同上。設(shè)置只加培養(yǎng)基的空白組、未經(jīng)處理的HepG2細(xì)胞對(duì)照組、未經(jīng)處理的HepG2細(xì)胞模型組以及在各孔中加入終質(zhì)量濃度0.4、0.6、0.8 mg/mL核桃肽溶液樣品組，培養(yǎng)24 h。吸去原有培養(yǎng)基，在模型組及樣品組中加入800 μmol/L H2O2溶液，培養(yǎng)4 h。根據(jù)ROS測定試劑盒說明書測定ROS含量。

1.3.10.5 核桃多肽預(yù)處理對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞抗氧化酶活力的影響

參照1.3.10.4節(jié)設(shè)置空白組、對(duì)照組、模型組和樣品組，消化細(xì)胞。通過加入DMEM完全培養(yǎng)基（1 mL），消化反應(yīng)停止。將所得的細(xì)胞懸液移到離心管中離心，棄上清液后，重新懸浮細(xì)胞。在冰水浴中，使用300 W的細(xì)胞超聲處理，制備均勻的細(xì)胞勻漿，超聲30 s，重復(fù)4 次，每次間隔5 s。根據(jù)CAT活性測定試劑盒、SOD活性測定試劑盒、GSH-Rx活性測定試劑盒、總GSH-Px活性檢測試劑盒的說明書，在合適的條件下進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組數(shù)據(jù)進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。GraphPad Prism 9.0軟件用于繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性

如圖1a所示，核桃蛋白水解產(chǎn)物的羥自由基清除率與0～30 mg/mL的質(zhì)量濃度呈劑量依賴性，半抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）值為13.20 mg/mL。這表明此蛋白水解產(chǎn)物濃度對(duì)羥自由基具有明顯的抑制作用。如圖1b所示，核桃蛋白水解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率在0～200 μg/mL范圍內(nèi)呈劑量依賴性，IC50值為36.07 μg/mL。結(jié)果表明，核桃蛋白水解產(chǎn)物具有清除DPPH自由基的能力。如圖1c所示，在0～150 μg/mL范圍內(nèi)，底物質(zhì)量濃度與ABTS陽離子自由基清除率之間存在顯著的劑量依賴關(guān)系。在底物質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，水解產(chǎn)物的ABTS陽離子自由基清除率為90.13%，IC50值為52.02 μg/mL。核桃蛋白的酶解可能導(dǎo)致肽的空間構(gòu)象、氨基酸組成和分子排列的變化，從而提高清除ABTS陽離子自由基的能力。

圖1 核桃蛋白水解產(chǎn)物對(duì)羥自由基（a）、DPPH自由基（b）以及ABTS陽離子自由基（c）清除率的影響Fig.1 Hydroxyl (a),DPPH (b) and ABTS radical cation (c) scavenging capacity of walnut protein hydrolysates

2.2 核桃多肽不同分子質(zhì)量組分抗氧化活性

將超濾后得到不同分子質(zhì)量的核桃多肽進(jìn)行ABTS陽離子自由基清除能力比較，結(jié)果如圖2所示。隨著核桃多肽分子質(zhì)量的逐漸減小，核桃多肽的ABTS陽離子自由基清除率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。其中分子質(zhì)量＜1 kDa抗氧化肽組分的ABTS陽離子自由基清除率最高，為90.95%。結(jié)果表明，核桃多肽的ABTS陽離子自由基清除率與肽分子質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。

圖2 不同超濾組分對(duì)ABTS陽離子自由基清除率的影響Fig.2 ABTS radical cation scavenging capacity of different ultrafiltration fractions

2.3 核桃多肽＜1 kDa組分抗氧化活性

由圖3a可知，＜1 kDa組分對(duì)羥自由基有較好的清除作用，在0～30 mg/mL范圍內(nèi)，核桃多肽組分的羥自由基清除率隨質(zhì)量濃度增大而增大，IC50值為11.47 mg/mL。核桃肽的特點(diǎn)是分子質(zhì)量小，含有豐富的供氫體，可以通過提供氫質(zhì)子有效減少高度氧化的自由基[29]。如圖3b所示，在底物質(zhì)量濃度0～600 μg/mL范圍內(nèi)，核桃多肽的DPPH自由基清除率隨底物質(zhì)量濃度增大而逐漸增大，IC50值為35.67 μg/mL。這可能歸因于核桃蛋白被酶解后釋放作為質(zhì)子供體的特定物質(zhì)，這些質(zhì)子供體與DPPH自由基發(fā)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的反磁性分子，從而顯示出強(qiáng)大的抗氧化活性[30]。如圖3c所示，在0～150 μg/mL范圍內(nèi)，核桃多肽的ABTS陽離子自由基清除率隨底物質(zhì)量濃度增大而增大，隨后趨于穩(wěn)定，在100 μg/mL時(shí)，其ABTS自由基清除率為90.45%，IC50值為49.72 μg/mL。核桃多肽表現(xiàn)出強(qiáng)大的清除ABTS陽離子自由基能力。盡管核桃多肽的抗氧化能力比VC弱，但這種天然的功能性活性物質(zhì)可以安全地長期食用，并且沒有表現(xiàn)出毒副作用。以上結(jié)果與李漢洋等[31]的研究結(jié)果一致。

圖3 ＜1 kDa核桃多肽組分對(duì)羥自由基（a）、DPPH自由基（b）以及ABTS陽離子自由基（c）清除率的影響Fig.3 Hydroxyl radical (a),DPPH radical (b) and ABTS radical cation (c)scavenging capacity of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

2.4 核桃多肽＜1 kDa組分的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 微觀結(jié)構(gòu)觀察

由圖4可看出，核桃多肽形狀不規(guī)則、表面光滑、結(jié)構(gòu)致密，有大量粗糙紋路和孔隙，這種結(jié)構(gòu)能夠極大地增加核桃多肽的表面積。這可能是由于核桃蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)因蛋白酶酶解而被破壞，使得疏水性基團(tuán)暴露在多肽表面，進(jìn)而提高核桃多肽疏水性，提升抗氧化活性。分子質(zhì)量、疏水性、氨基酸組成和肽序列被認(rèn)為是影響肽抗氧化活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征[32]。有研究人員對(duì)具有抗氧化活性的植物來源肽與其疏水性作用的關(guān)系進(jìn)行了綜述，得出疏水性作用是多肽抗氧化活性的決定因素之一[33]。

圖4 ＜1 kDa核桃多肽組分的微觀結(jié)構(gòu)Fig.4 Microstructure of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

2.4.2 紫外全波長掃描分析

如圖5所示，核桃多肽的最大吸收峰位于225 nm波長處，表明該波長范圍產(chǎn)生價(jià)電子躍遷，最大吸收峰的吸光度為8.94。這可能是因?yàn)椋? kDa核桃多肽在酶解過程中部分肽鏈被水解，使游離氨基酸含量提高以及多肽中生色團(tuán)和助色團(tuán)的偏光性而形成。

圖5 核桃多肽＜1 kDa組分的的紫外全波長掃描Fig.5 Ultraviolet absorption spectrum of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

2.4.3 熒光光譜掃描

有研究表明色氨酸（Trp）殘基與最大發(fā)射波長（λmax）有關(guān)[34]，如圖6所示，核桃多肽的λmax分布在345 nm處，當(dāng)λmax＞330 nm時(shí)，這說明核桃多肽中的Trp殘基主要暴露在多肽分子表面的極性環(huán)境中。同時(shí)，熒光強(qiáng)度與暴露在極性環(huán)境中Trp殘基的數(shù)量呈正相關(guān)。Trp殘基暴露在極性環(huán)境中的程度和數(shù)量能夠反映核桃多肽的表面疏水性，這可能是核桃多肽具備抗氧化活性的原因之一。有研究表明，Trp、脯氨酸等疏水氨基酸在消除自由基中起著重要作用[35]。

圖6 ＜1 kDa核桃多肽組分的的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectrum of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

2.4.4 圓二色光譜分析

圓二色光譜可以表征核桃多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖7、表1所示。核桃多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含多種構(gòu)象，主要為β-折疊（相對(duì)含量為36.6%）和無規(guī)卷曲（相對(duì)含量為36.5%），其中反平行式β-折疊相對(duì)含量為33.7%，平行式β-折疊為2.9%。β-折疊及無規(guī)卷曲含量較高，α-螺旋結(jié)構(gòu)（緊密的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)）含量較低，這能夠反映出多肽表面的疏水性增強(qiáng)。核桃多肽表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，原因可能是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由于酶解而發(fā)生改變，肽鍵被蛋白酶切斷，使其空間結(jié)構(gòu)打開，這種結(jié)構(gòu)變化意味著蛋白質(zhì)分子內(nèi)無序結(jié)構(gòu)（β-折疊和無規(guī)卷曲）的含量變高，從而使疏水性位點(diǎn)暴露在多肽分子外部的極性環(huán)境中[36]。疏水性對(duì)多肽的抗氧化活性具有重要影響。當(dāng)疏水性氨基酸殘基暴露在多肽表面時(shí)，其有助于多肽在脂質(zhì)-水界面處溶解，進(jìn)而更有效地清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用[37]。

表1 核桃多肽＜1 kDa組分的二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 1 Secondary structure composition of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

圖7 核桃多肽＜1 kDa組分的的圓二色光譜Fig.7 Circular dichroism spectrum of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa

2.5 ＜1 kDa核桃多肽組分及H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

為了確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中核桃多肽組分的作用濃度，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度的核桃多肽組分對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果見圖8a。與空白組相比，＜1 kDa核桃多肽組分的質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活率無影響。因此，選取0.4、0.6、0.8 mg/mL的＜1 kDa核桃多肽組分進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖8 不同濃度＜1 kDa核桃多肽組分（a）及H2O2（b）對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.8 Effects of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa (a) and H2O2 (b) on the survival rate of HepG2 cells

ROS的主要成分之一是H2O2，能夠誘發(fā)氧化應(yīng)激，破壞細(xì)胞的氧化還原平衡，在氧化應(yīng)激條件下最終導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡或組織損傷。如圖8b所示，經(jīng)過不同濃度H2O2孵育4 h后，隨著H2O2濃度的增加，細(xì)胞存活率持續(xù)降低，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。當(dāng)H2O2濃度為1 000 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率僅為47.28%。經(jīng)過計(jì)算，細(xì)胞的IC50為804.9 μmol/L，因而選擇800 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的H2O2濃度。

2.6 ＜1 kDa核桃多肽組分對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞存活率及ROS的影響

如圖9a所示，與對(duì)照組相比，模型組的細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），從而證實(shí)了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒?。用不同質(zhì)量濃度的核桃多肽樣品培育24 h后，其細(xì)胞存活率呈濃度依賴性增加趨勢，這表明核桃多肽可以減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，并保護(hù)細(xì)胞存活。當(dāng)核桃多肽質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，可以顯著提高HepG2細(xì)胞的存活率（P＜0.05）。

圖9 ＜1 kDa核桃多肽組分對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞存活率（a）及ROS水平（b）的影響Fig.9 Effect of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa on the survival rate (a) and ROS level (b) of oxidatively damaged HepG2 cells

ROS的過度產(chǎn)生可能破壞細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致組織損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)通過測定細(xì)胞內(nèi)的ROS水平評(píng)估細(xì)胞內(nèi)氧化損傷程度。如圖9b所示，與對(duì)照組相比，模型組的ROS水平度顯著增加（P＜0.05），表明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀行Ы?。與模型組相比，0.8 mg/mL核桃多肽組的ROS水平顯著減少（P＜0.05），為107.81。這與Liu Chunlei等[29]的研究結(jié)果一致，核桃多肽能夠提高細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞中ROS的生成。

2.7 ＜1 kDa核桃多肽組分對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的影響

如圖10a所示，模型組的SOD活性顯著降低。然而，當(dāng)用不同質(zhì)量濃度的＜1 kDa核桃肽組分預(yù)處理HepG2細(xì)胞時(shí)，SOD活性呈明顯的劑量依賴性增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，SOD活力為172.20 U/mg。由此表明，＜1 kDa核桃多肽組分能夠提高HepG2細(xì)胞中SOD的活力水平，表明其具有增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化活性的潛力。如圖10b所示，與對(duì)照組相比，模型組的CAT活力下降；與模型組相比，樣品組的CAT活力均提高，并隨著多肽組分濃度的增加而增加。由此表明，＜1 kDa核桃多肽組分能夠提高HepG2細(xì)胞中CAT的活力水平。GSH-Px的主要功能是清除過氧化氫和脂類氫過氧化物，從而保持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。如圖10c所示，與空白組相比，模型組的GSH-Px的活力水平顯著下降；與模型組相比，經(jīng)＜1 kDa核桃多肽組分預(yù)處理樣品組的GSH-Px的活力水平均提高，并隨著多肽組分濃度提高而提高。氧化型谷胱甘肽能夠被GSHRx還原成GSH，提供清除ROS所需的還原力，從而保護(hù)生物系統(tǒng)免受氧化損傷。如圖10d所示，模型組的GSHRx的活力顯著下降；與模型組相比，樣品組的GSH-Rx活力水平均提高，并隨著多肽組分濃度提高而提高。上述結(jié)果與Zhao Fanrui等[38]的研究結(jié)果相似。

圖10 ＜1 kDa核桃多肽組分對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的影響Fig.10 Effect of walnut peptide with molecular mass less than 1 kDa on H2O2-induced antioxidant enzymes in HepG2 cells

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以核桃肽為研究對(duì)象，分析了超濾后不同分子質(zhì)量核桃肽的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量＜1 kDa核桃多肽組分的抗氧化活性最強(qiáng)，其羥自由基清除能力的IC50值為11.47 mg/mL、DPPH自由基清除能力的IC50值為35.67 μg/mL、ABTS陽離子自由基清除能力的IC50值為49.72 μg/mL，均呈現(xiàn)出濃度依賴性。同時(shí)，＜1 kDa核桃多肽組分對(duì)H2O2引起的HepG2細(xì)胞氧化損傷具有一定的保護(hù)作用，能夠減少HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量，提高HepG2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活力水平。核桃多肽形狀不規(guī)則、表面光滑、結(jié)構(gòu)致密，有大量粗糙紋路和孔隙。核桃多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)以多種構(gòu)象并存，主要為β-折疊（相對(duì)含量為36.6%）和無規(guī)卷曲（相對(duì)含量為36.5%）。核桃多肽具有良好的抗氧化活性，可用于開發(fā)核桃肽功能食品，本研究對(duì)實(shí)現(xiàn)核桃粕的高值化利用有一定參考價(jià)值。