LHCGR胞外結構域蛋白的生信分析、原核表達及純化

王蒙蒙 劉雨然 楊慧瑩 張夢圓 王燕 朱曉慶 羅燕 邵永斌 連科迅 谷新利

摘要：目的 為獲得小鼠LHCGR胞外結構域蛋白（LHCGR-1），分析其結構及理化性質，為今后研究該蛋白功能及篩選與之相互作用的小分子化合物奠定基礎。方法 根據(jù)NCBI中小鼠LHCGR氨基酸序列合成目的基因Lhcgr-1，經(jīng)生物信息學分析后，將該基因插入至表達載體pET-28a（+），并轉化至BL21（DE3）感受態(tài)細胞中；經(jīng)IPTG誘導，表達重組蛋白pET-28a-LHCGR-1，利用SDS-PAGE和Western Blot進行鑒定，之后對該蛋白進行純化，并通過分子對接技術預測該蛋白與LH、CG的相互作用。結果 預測LHCGR-1蛋白分子量為40 749.08，由367個氨基酸組成，等電點理論值為5.47；氨基酸序列中有29個絲氨酸位點、10個蘇氨酸位點和5個酪氨酸位點；成功構建了表達載體pET-28a-LHCGR-1并獲得純化的目的蛋白；分子對接結果表明目的蛋白可以與LH、CG通過多種相互作用，形成穩(wěn)定的復合物，有利于其發(fā)揮原有的生物學功能。結論 成功構建了小鼠胞外結構域蛋白LHCGR-1在大腸桿菌內的原核表達體系并獲得了純化蛋白，分子對接預測該蛋白具有生物學功能，提示該蛋白可以用于后續(xù)研究。

關鍵詞：LHCGR；原核表達；蛋白質純化；生信分析；分子對接

中圖分類號：中圖分類號Q786文獻標志碼：A文獻標識碼

Bioinformatics analysis， prokaryotic expression and purification of extracellular

domain protein of LHCGR

WANG? Mengmeng，LIU? Yuran，YANG? Huiying，ZHANG? Mengyuan，WANG? Yan，ZHU? Xiaoqing，

LUO? Yan，SHAO? Yongbin，LIAN? Kexun，GU? Xinli*

（College of Animal Science and Technology， Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China）

Abstract：? Objective In order to obtain mouse LHCGR extracellular domain protein （LHCGR-1）， the structure and physicochemical properties of LHCGR-1 protein were analyzed， which laid a foundation for the study of the function of this protein and the screening of small molecule compounds interacting with it. Method The target gene Lhcgr-1 was synthesized according to the amino acid sequence of mouse LHCGR in NCBI. After bioinformatics analysis， the gene was inserted into the expression vector pET-28a （+） and transformed into BL21（DE3） receptor cells. The recombinant protein pET-28a-LHCGR-1 was induced by IPTG and identified by SDS-PAGE and Western Blot. After that， the protein was purified， and the interaction between the protein and LH and CG was predicted by molecular docking technique. Results The molecular weight of the LHCGR-1 protein was estimated to be 40 749.08， composed of 367 amino acids， and the theoretical isoelectric point value was 5.47. There were 29 serine sites， 10 threonine sites and 5 tyrosine sites in the amino acid sequence. The recombinant plasmid pET-28a-LHCGR-1 was constructed successfully and the purified target protein was obtained. The molecular docking results showed that the target protein could form stable complexes with LH and CG through various interactions， so as to play its original biological functions. Conclusion The prokaryotic expression system of mouse extracellular domain protein LHCGR-1 in Escherichia coli was successfully constructed and the purified protein was obtained. The biological function of the protein was predicted by molecular linkage， suggesting that the protein could be used in subsequent studies.

Key words： LHCGR;prokaryotic expression;protein purification;biogenic analysis;molecular docking

促黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體（LHCGR），屬于G蛋白偶聯(lián)受體中的糖蛋白激素受體，編碼促黃體生成素（LH）和絨毛膜促性腺激素（CG）受體，在雄性和雌性的性別分化和生殖功能中起著關鍵作用。已知的LHCGR天然突變點有34個，可以不同程度地導致受體的持續(xù)性激活或失活。作為排卵前卵泡的一個標志性分子，LHCGR及其異構體的表達在LH調控卵泡生長及排卵中起著核心作用［1］。研究報道，LHCGR是影響牛生育能力的候選基因之一，其多態(tài)性與產犢間隔［2］、每次妊娠需要的人工授精次數(shù)［3］、超排卵特征［4］、取卵收集的卵母細胞數(shù)量［5］和平均產奶量［6］等生育和生產性狀的變化有關。此外，LHCGR在人類生殖疾病中也扮演重要角色，與內分泌系統(tǒng)諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展有關。不同類型的LHCGR突變可能導致不同的功能障礙及臨床表型，如已知的純合突變會導致空卵泡綜合征［7］；在女性多囊卵巢綜合征（PCOS）中，已將該基因作為診斷該疾病的靶基因之一［8］，該基因突變及其表達水平的變化影響PCOS患者的激素水平，并與多毛癥、月經(jīng)少、體重指數(shù)相關［9］；子宮內膜異位癥患者的卵巢顆粒細胞中LHCGR表達降低，導致促性腺激素誘導的環(huán)氧化酶2（COX-2）表達降低，從而會增加子宮內膜異位癥患者發(fā)生未破裂卵泡黃素化綜合征的概率［10］；該基因突變亦可以導致男性家族性限性性早熟［11］。

鑒于LHCGR對生殖具有重要的作用，故深入探究其功能，并積極尋找能與該蛋白結合的小分子化合物，有望為靶向治療與之相關的疾病提供新的思路。LHCGR結構中存在兩個主要的功能單位，即細胞外結構域和跨膜結構域。其中，前者主要在激素的識別和結合方面發(fā)揮作用，后者主要維持受體結構的穩(wěn)定性，特殊的結構增加了該受體體外表達的困難。2002年，成功篩選到第一個靶向LHCGR的小分子激動劑Org 41841，且該分子直接作用于受體的跨膜結構域。因此，本試驗以LHCGR受體的另一個主要功能區(qū)—胞外結構域為研究對象，試圖在體外表達LHCGR胞外結構域蛋白（LHCGR-1）并進行純化，為研究該蛋白的功能及尋找能與之結合的小分子化合物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和菌株

載體pUCm-T、載體pET28a（+）、感受態(tài)細胞TOP10和BL21（DE3）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司（以下簡稱生工）。

1.1.2 主要試劑

Protein Marker，限制性內切酶NdeI、XhoI，購自賽默飛世爾科技公司；DNA Marker，購自TaKaRa公司；HisTrapTM FF Crude，購自美國GE公司；緩沖液A（1×PBS，pH 7.4），IPTG，LB肉湯瓊脂培養(yǎng)基，TBST緩沖液，脫脂奶粉，DAB染色液，均購自北京索萊寶科技有限公司；緩沖液B（8 mol·L-1 Urea，50 mmol·L-1 Tris-HCl，300 mmol·L-1 NaCl，pH 8.0），緩沖液C（8 mol·L-1 Urea，50 mmol·L-1 Tris，300 mmol·L-1 NaCl，0.1% Triton X-100，pH 8.0），考馬斯亮藍染色液，均為本實驗室配制、保存；小鼠抗6X His單克隆抗體，HRP標記的山羊抗小鼠IgG，均購自生工；質粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；Lhcgr-1基因由生工合成。

1.1.3 主要儀器

恒溫水浴鍋（四川賽可隆實驗室設備有限公司）；PCR儀（Eppendorf公司）；超凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司）；培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；離心機（德國SiGMA公司）；凝膠成像儀（美國伯樂公司）；電泳儀（杭州雷琪實驗器材有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 LHCGR蛋白結構預測

利用在線軟件phyre2并結合文獻報道對LHCGR全長蛋白結構進行分析。

1.2.2 目的基因的合成及克隆載體的構建

以NCBI中小鼠LHCGR蛋白的氨基酸序列（GenBank登錄號：NM_013582）為參考，選取編碼該蛋白胞外結構域的氨基酸序列（23-368aa），根據(jù)大腸桿菌對密碼子的偏好特性優(yōu)化稀有密碼子，由生工合成目的基因Lhcgr-1并進行PCR鑒定，PCR反應體系（20 μL）：上、下游引物各0.5 μL，模板2 μL，Mix 7 μL，ddH2O 10 μL；反應條件為：96℃ 3min；95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 20 s，23個循環(huán)，72℃終延伸1min；引物LHCGR（F：CACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCAGCTGCATAGCCCG-GAACTGAGCGGTAGCCGCTGTCCG;R：AGCCGGA-TCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGT-TACACACGCAGAAATGCATAACCCATAATATCTTC-ACA）。將該基因片段與克隆載體pUCm-T相連接，得到重組質粒并轉化至TOP10中，涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板。次日，挑取單菌落進行菌液PCR驗證，對陽性菌株擴大培養(yǎng)，提取質粒做雙酶切驗證，并將陽性菌株送生工測序，將比對正確的重組質粒命名為pUCm-T-LHCGR-1。

1.2.3 LHCGR-1蛋白的生物信息學分析

利用在線分析工具對LHCGR-1蛋白的理化性質、蛋白結構和磷酸化位點進行預測（表1）。

1.2.4 表達載體的構建

分別用限制性內切酶NdeI和XhoI對重組質粒pUCm-T-LHCGR-1和載體pET-28a（+）進行雙酶切，用瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物初步檢測后進行膠回收。將回收的基因片段連接至pET-28a（+）載體并轉化至感受態(tài)細胞BL21（DE3）內，涂布于含卡那霉素的LB平板中于37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單個菌落進行菌液PCR檢測，對陽性菌株擴大培養(yǎng)并提取質粒，進行雙酶切。雙酶切鑒定正確的質粒送至生工測序，并將測序正確的重組質粒命名為pET-28a-LHCGR-1。

1.2.5 LHCGR-1蛋白的誘導表達與鑒定

將保存的pET-28a-LHCGR-1菌株在含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中復蘇、擴繁，當測得OD值約為0.6時，向其中添加IPTG 0.5 mmol·L-1，分別于20℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)過夜和37℃培養(yǎng)6 h以誘導重組蛋白表達，未添加誘導劑IPTG的菌液設為陰性對照。將不同條件下培養(yǎng)的菌液4 000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集菌體，加入緩沖液A進行懸浮，并使用超聲破碎儀使其充分溶解。離心收集上清和沉淀，使用緩沖液B將沉淀溶解，分別對上清和沉淀中的蛋白進行制樣、上樣及SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍染色液染色后用脫色液進行脫色處理。將SDS-PAGE電泳后的膠中蛋白電轉印至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉，經(jīng)TBST洗膜、一抗孵育、TBST洗膜、二抗孵育、TBST洗膜，最后用DAB顯色，完成Western Blot檢測。

1.2.6 LHCGR-1蛋白的純化

將上述誘導表達成功的菌株在含抗性的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，離心收集菌體并用緩沖液C將其溶解，超聲破碎，收集粗蛋白。按His標簽蛋白純化預裝柱HisTrapTM FF Crude操作說明書進行蛋白的純化，對粗蛋白和流出組分進行處理、制樣，根據(jù)SDS-PAGE檢測結果篩選出咪唑洗脫的最佳濃度，對其洗脫后收集的蛋白進行Western Blot檢測。

1.2.7 LHCGR-1與LH、CG的分子對接

為了初步驗證LHCGR-1蛋白的生物學功能，利用分子對接技術評價LHCGR-1與LH、CG之間的相互作用。LHCGR-1蛋白結構根據(jù)其氨基酸序列，利用AlphaFold2進行預測得到，LH以及CG蛋白結構根據(jù)其氨基酸序列利用同源建模軟件Swiss-Model進行模型構建（Homologous template：7FIJ， 1HRP， Identity： 85.97%， 92.24%）（https：//swissmodel.expasy.org/）。在分子操作環(huán)境（MOE 2019.1）中，對3個蛋白進行去除水和離子、質子化、添加丟失的原子、補全缺失基團及蛋白能量最小化的處理，力場選擇為Amber10。

使用HDOCK服務器，通過混合對接策略預測蛋白和蛋白之間的結合復合物。將每個蛋白均設置為剛性，對接接觸位點設置為全表面，對接后產生構象設置為100個，對接打分基于知識的迭代評分函數(shù)ITScorePP計算。對接打分越負，表明兩個蛋白結合越強。本次利用打分函數(shù)，選取能量最負的構象，采用MOE 2019.1軟件中的Minimization模塊進行優(yōu)化，以解決剛性對接可能存在的空間結構不合理接觸的問題。能量最小化的力場選擇為Amber10：ETH，溶劑化模型選擇水分子，優(yōu)化方法分為最陡下降法（Steepest Descent）和共軛梯度（Conjugate Gradient），最大迭代次數(shù)均為5 000次。優(yōu)化結果利用Pymol2.1軟件進行可視化作圖分析模型。

2 結果

2.1 LHCGR蛋白結構預測

利用軟件phyre2，對552個殘基（占序列79%）以100.0%置信度通過單個最高評分模板建模，得到LHCGR全長蛋白三級結構如圖1A。由圖可知該蛋白屬于跨膜蛋白，具有較長的胞外結構域、7個跨膜結構及胞內結構如圖1B。

2.2 Lhcgr-1基因的合成及克隆載體的構建

對小鼠LHCGR-1的氨基酸序列（23-368aa）進行優(yōu)化，優(yōu)化前后的基因序列見附件1，合成的LHCGR-1基因序列如圖2A，經(jīng)PCR擴增后得到約1 113 bp大小的片段，與目的片段大小相符，部分樣品的擴增結果見圖2B。將該基因片段與克隆載體pUCm-T相連接，得到重組質粒，其菌液PCR及雙酶切結果均獲得了與預期大小相符的條帶如圖2C和圖2D，結果表明重組質粒pUCm-T-LHCGR-1構建成功。

A：LHCGR-1基因序列 B：LHCGR-1基因的PCR擴增結果 C：pUCm-T-LHCGR-1菌液PCR擴增結果 D：pUCm-T-LHCGR-1雙酶切結果圖2 Lhcgr-1基因的合成及克隆載體的構建

2.3 LHCGR-1蛋白理化性質和二級結構預測

經(jīng)在線軟件預測，LHCGR-1蛋白質分子式為：C1806H2809N481O559S17，分子量為40 749.08，由367個氨基酸組成（表2）。等電點理論值為5.47，所帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg + Lys）為28，帶負電荷殘基總數(shù)（Asp + Glu）為 40。

預測其半衰期在體外培養(yǎng)哺乳動物網(wǎng)織細胞時可能是30 h，大腸桿菌體內大于10 h，酵母體內大于20 h；不穩(wěn)定系數(shù)為45.41，脂溶指數(shù)為84.01，總平均親水性為-0.237。預測該蛋白的二級結構中包含無規(guī)則卷曲182個（49.59%），α螺旋141個（38.42%），延伸鏈31個（8.45%），β轉角13個（3.45%）（圖3A）。預測該蛋白序列中共有44個磷酸化位點（如圖3B），分別是絲氨酸位點（29個）、蘇氨酸位點（10個）和酪氨酸位點（5個），將這些磷酸化位點中存在的特異性蛋白激酶種類展示如表3所示。

2.4 表達載體的構建

對重組質粒pUCm-T-LHCGR-1和載體pET-28a（+）進行雙酶切，將回收的基因片段和pET-28a（+）載體連接并轉化至感受態(tài)細胞BL21（DE3）內，以菌液PCR方法篩選陽性克隆，得到約1113bp大小的片段，與目的片段大小相符，部分樣品的擴增結果見圖4A；對獲得的陽性菌液提取質粒并雙酶切鑒定，結果表明獲得了與預期大小相符的目的基因條帶（圖4B），經(jīng)測序比對與合成的目的基因一致，表明成功構建了pET-28a-LHCGR-1重組質粒。

2.5 LHCGR-1蛋白的誘導表達

將菌株pET-28a-LHCGR-1經(jīng)IPTG誘導后，使用超聲破碎儀使菌體充分溶解，同時對上清和沉淀中蛋白進行SDS-PAGE和Western Blot檢測。結果顯示，在20℃和37℃的沉淀中，均出現(xiàn)預期大小約40 kDa的目的條帶（圖5），且最佳誘導條件為20℃過夜培養(yǎng)，蛋白含量在沉淀中最高。

2.6 LHCGR-1蛋白的純化

將菌株pET-28a-LHCGR-1經(jīng)IPTG在20℃條件下過夜誘導后，使用超聲破碎儀使菌體充分溶解，對沉淀中蛋白進行純化并進行SDS-PAGE檢測，?? 結果表明，成功獲得目的蛋白，且以500 mM 咪唑洗脫獲得的蛋白濃度最高（圖6A），經(jīng)Western Blot檢測，獲得了與預期大小相符的目的蛋白條帶，如圖6B所示。以上結果表明，成功純化出目的蛋白。

2.7 LHCGR-1與LH、CG的分子對接

通過分子對接技術，模擬LHCGR-1蛋白與LH的相互作用，結果如圖7所示。結果表明，LHCGR-1與LH的結合打分為-362.85 kcal/mol，LHCGR-1蛋白的結合位點包括：GLN-324，SER-213，TYR-164，ASN-132，ALA-253，SER-207，ILE-208和ILE-134氨基酸殘基，LH的結合位點包括VAL-536，TYR-550，TYR-546，CYS-617，CYS-543，THR-580，PHE-576和LEU-622氨基酸殘基。LHCGR-1與LH接觸殘基能夠形成多種相互作用，如氫鍵（GLN-324：VAL-536，SER-213：TYR-550，TYR-164：TYR-546，ASN-132：CYS-617，ALA-253：CYS-543，SER-207：THR-580），疏水（ILE-208：PHE-576，ILE-134：LEU-622）等相互作用，可以有效地提高的LHCGR-1與LH蛋白復合物的穩(wěn)定性。另外，根據(jù)結合表面圖（圖7B）可知，LH與LHCGR-1蛋白表面匹配較好，有利于形成穩(wěn)定的結合作用。

通過分子對接技術，模擬LHCGR-1蛋白與CG的相互作用，結果如圖8所示。結果表明，LHCGR-1與CG的結合打分為-259.62 kcal·mol-1，LHCGR-1蛋白的結合位點包括：GLN-217， LYS-194， GLU-193， GLU-169， GLY-148， GLN-152和PRO-147氨基酸殘基，CG的結合位點包括ASN-15， THR-42， ARG-43， GLN-89， CYS-90， ARG-60和ALA-91氨基酸殘基。LHCGR-1與CG接觸殘基能夠形成多種相互作用，如氫鍵（GLN-217：ASN-15，LYS-194：THR-42，GLU-169：GLN-89，GLY-148：CYS-90，GLN-152：LEU-622），

鹽橋（GLU-193：ARG-43），疏水（PRO-147：ALA-91）等相互作用，可以有效地提高的LHCGR-1與CG復合物的穩(wěn)定性。根據(jù)結合表面圖（圖8B）可知，CG與LHCGR-1蛋白表面匹配較好，有利于形成穩(wěn)定的結合作用。

綜上所述，通過分子對接技術，預測LHCGR-1可以與LH及CG形成相互作用，并形成穩(wěn)定復合物。

3 討論

LHCGR是黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族［12］，糖蛋白激素亞家族，除主要在卵巢和睪丸中表達外，LHCGR的各種異構體在血管內皮細胞和平滑肌細胞、初級和次級生殖器官（如子宮、輸卵管、胎盤和乳房）以及皮膚、大腦、巨噬細胞、淋巴細胞以及胎兒組織在內的各種性腺外組織中均有表達［13-15］。LHCGR在生殖過程中起著關鍵作用，參與類固醇的合成、配子形成和性腺發(fā)育。卵巢顆粒細胞中LHCGR的表達水平是排卵前卵泡對促排卵、卵母細胞成熟和黃體形成的LH激增作出反應所必需的［16-17］，亦與雄激素前體合成相關。動物研究也表明LHCGR與動物的生育和生產性狀等密切相關［6，18］。LHCGR基因易于突變，大量自然發(fā)生的突變和單核苷酸多態(tài)性直接或間接導致了生殖障礙和性發(fā)育障礙，包括男性限性性早熟［19］、睪丸間質細胞發(fā)育不全［20］和女性多囊卵巢綜合征等引起的無排卵或閉經(jīng)［9］。LHCGR的異常激活會導致卵巢過度刺激綜合征，其他因素也會通過影響LHCGR的表達從而影響排卵，例如肥胖與LHCGR的表達水平降低和LH敏感性降低有關，最終對排卵和生育能力產生負面影響。此外，LHCGR也在卵巢癌、子宮內膜癌等惡性腫瘤中異常表達。

由此可見，LHCGR功能紊亂與生殖疾病密切相關，已知60%以上的藥物開發(fā)均以G蛋白偶聯(lián)受體作為藥物靶點。目前，已篩選到靶向LHCGR的小分子激動劑Org 41841，但因Org系列化合物對糖蛋白激素受體均具有親和力，該類化合物的應用受到了一定程度的限制。深入研究LHCGR基因的功能，并積極尋找能與之結合的小分子化合物，有望實現(xiàn)與該基因相關疾病的靶向治療，而體外獲得該蛋白是該項研究工作的基礎。原核表達系統(tǒng)作為體外表達目的蛋白的系統(tǒng)之一，以大腸桿菌系統(tǒng)應用最為廣泛。其遺傳背景清晰，短時間可大量獲得目的蛋白且分離純化較真核表達系統(tǒng)更為容易，一定程度上可以滿足體外研究蛋白結構和功能的需求，又因其成本較低受到了研究者的青睞。

根據(jù)文獻報道及在線軟件的預測分析發(fā)現(xiàn)，LHCGR的N端具有較大的與糖蛋白激素相互作用的胞外結構域，是該受體發(fā)揮識別和結合作用的主要功能區(qū)之一。本試驗選取該蛋白N端胞外結構域為研究對象，參考GenBank中小鼠LHCGR對應的氨基酸序列，依據(jù)大腸桿菌對密碼子偏好性，優(yōu)化密碼子合成目的基因Lhcgr-1，將其插入表達載體pET-28a（+）中，之后轉化到表達菌株內誘導表達。結果表明，20℃過夜培養(yǎng)是誘導該重組蛋白表達的最佳條件，且沉淀中的蛋白含量高于上清中的蛋白含量。利用His標簽蛋白純化預裝柱HisTrapTM FF Crude對蛋白進行純化，我們發(fā)現(xiàn)隨著咪唑緩沖溶液濃度的增高，目的蛋白的濃度增加，且以500 mmol·L-1的高濃度咪唑緩沖液純化的蛋白含量最高。對純化的蛋白通過Western Blot初步驗證其具有生物學活性，分子對接表明該目的蛋白可以與LH及CG發(fā)生多種形式的相互作用，形成穩(wěn)定的復合物，預測其具有與體內相同的生物學功能，從而有利于其發(fā)揮對生殖的調控作用。

預測蛋白質的理化性質對原核表達具有重要的指導意義。本試驗中，利用在線軟件對該蛋白理化性質進行分析，預測到LHCGR-1蛋白質分子量為40 749.08，由367個氨基酸組成，等電點理論值為5.47，是親水性蛋白質，提示原核表達系統(tǒng)可以用于表達該蛋白質［21］。蛋白質磷酸化可以使蛋白質的結構和功能發(fā)生改變，從而影響信號傳導，在生命活動中具有重要意義。大量研究表明蛋白質磷酸化與眾多疾病的發(fā)生和發(fā)展有關，甚至將磷酸化位點作為潛在的治療靶點［22-23］。利用軟件預測LHCGR-1重組蛋白序列的磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列包含29個絲氨酸位點、10個蘇氨酸位點和5個酪氨酸位點，磷酸化位點的激活與失活直接或間接影響該蛋白對激素或其他小分子物質的識別和結合作用，對今后小鼠相關疾病模型中致病機理的研究提供理論基礎。

綜上所述，本試驗成功構建了小鼠LHCGR胞外結構域蛋白LHCGR-1的原核表達系統(tǒng)并獲得純化的目的蛋白，分子對接表明該蛋白能夠與LH和CG形成穩(wěn)定復合物，預測其可以發(fā)揮與體內相同的識別功能。該試驗為后續(xù)研究其他物種的LHCGR蛋白原核表達及純化建立了方法體系，也為后續(xù)深入研究該蛋白的功能及篩選靶向LHCGR-1的小分子藥物奠定基礎。

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（責任編輯：編輯唐慧）