合成生物學(xué)在中藥現(xiàn)代化中的應(yīng)用

李超靜 王平平 楊成帥 王燕 嚴(yán)興 周志華

摘 要 中藥以藥用植物為主，在我國已有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，為中華民族的健康與繁衍做出了重要貢獻(xiàn)。中藥的活性成分是中藥發(fā)揮功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，明確中藥中的活性成分組成并建立各活性成分的綠色、低成本獲取技術(shù)是推進(jìn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展及其在植物天然化合物綠色制造領(lǐng)域中的應(yīng)用，合成生物技術(shù)不僅為中藥活性成分的綠色、低成本、規(guī)?；a(chǎn)提供了新途徑，也將為明確中藥的活性成分組成及其藥效機(jī)制提供技術(shù)支撐與物質(zhì)基礎(chǔ)。本文以青蒿素、人參皂苷和淫羊藿素等中藥活性成分的合成生物技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用為例，探討合成生物學(xué)在推動中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中的作用。

關(guān)鍵詞 合成生物學(xué) 中藥現(xiàn)代化 天然化合物 異源定向合成

中圖分類號：Q819； O629.71 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）07-0032-09

引用本文 李超靜， 王平平， 楊成帥， 等. 合成生物學(xué)在中藥現(xiàn)代化中的應(yīng)用[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（7）： 32-40； 80.

Application of synthetic biology in modernization of traditional Chinese medicine

LI Chaojing1， WANG Pingping2， YANG Chengshuai2， WANG Yan2， YAN Xing2， ZHOU Zhihua2

[1. SynBioTech （Shanghai） Co.， Ltd.， Shanghai 201321， China； 2. CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 200032， China]

ABSTRACT Traditional Chinese medicine， primarily based on medicinal plants， has been used for thousands of years in China and has made significant contributions to the health and proliferation of the Chinese nations. The bioactive compounds are the pharmaceutical basis for Chinese medicine. The identification of the composition of active components in Chinese medicine and the establishment of their green， low-cost manufacturing technoogies would play key roles in the promotion of the modernization of Chinese medicine. The recent development of synthetic biology not only provides new avenues for the green， low-cost and large-scale production of bioactive components of Chinese medicine but also offers technical support and necessary compounds for clarifying the composition of active components and their pharmacological mechanisms. This article reviews the development and application of synthetic biology in the production of bioactive components of Chinese medicine， such as artemisinin， ginsenosides and icaritin， and the potential roles of synthetic biology in promoting the modernization of Chinese medicine.

KEY WORDS synthetic biology； modernization of Chinese medicine； natural products； heterologous directed synthesis

中藥是指在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，用于預(yù)防和治療疾病并具有康復(fù)與保健作用的植物、動物、礦物及其制品。在我國悠久的歷史長河中，中醫(yī)藥為中華民族的生命健康、繁衍生息和文化傳承做出了巨大貢獻(xiàn)。以《黃帝內(nèi)經(jīng)》《傷寒雜病論》《神農(nóng)本草經(jīng)》等中醫(yī)藥典籍為支撐，中醫(yī)藥形成了系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)、防治理念和技術(shù)體系，在應(yīng)對傷寒、瘟病等方面發(fā)揮了重要作用。近來，中醫(yī)藥在應(yīng)對非典、新冠疫情等重大傳染性疾病中也發(fā)揮了不可或缺的作用。尤其是在新冠疫情期間，中醫(yī)藥的使用率和防治有效率都達(dá)到了90%以上[1]。當(dāng)然，中醫(yī)藥也是隨著中華文明的發(fā)展歷程而在不斷完善的。自《黃帝內(nèi)經(jīng)》伊始，我們的祖祖輩輩都在不斷挖掘、嘗試、分析與總結(jié)可以治病救人的中藥材，從中藥材的性能、功效的分析到其分類、炮制和配伍規(guī)律的總結(jié)，逐漸形成了中藥學(xué)體系。

不過，隨著科學(xué)的進(jìn)步、社會文明的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的變化，我國傳統(tǒng)中藥在應(yīng)用、發(fā)展與推廣過程中面臨著以下幾個方面的問題[2]：①中藥的成分復(fù)雜，許多中藥中的活性成分組成及其作用機(jī)制都未完全明確。②中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)問題，包括中藥的活性成分、致敏性/慢性毒性成分，以及中藥材種植與后處理過程中引入的污染物的含量控制問題。中藥材的活性成分含量易受環(huán)境、種植、采收和加工等因素的影響，其控制缺乏可靠的手段，故中藥的治療效果多受中藥材道地性的影響，很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。③中藥還面臨著與現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)體系如何對接的問題。中醫(yī)藥的理論體系和治療方法，如診斷參考“望、聞、問、切”，用藥依據(jù)“君臣佐使，以君藥為主，以臣藥為輔，佐藥共同煎，使藥調(diào)和諸藥”，都與現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)存在差異。④中藥很難獲得知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)，使得其市場競爭力較弱。以上問題都極大限制了中藥的開發(fā)、應(yīng)用和市場推廣，特別是海外市場的開發(fā)。因此，亟需有新的科學(xué)方法和技術(shù)來幫助中藥實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化的飛躍。推進(jìn)中藥現(xiàn)代化研究，是保護(hù)、發(fā)掘、發(fā)展和傳承中醫(yī)藥的重要途徑。早在1996年，中共中央、國務(wù)院就明確提出了“實(shí)現(xiàn)中藥與中藥生產(chǎn)現(xiàn)代化”的目標(biāo)，中藥現(xiàn)代化逐漸上升到國家產(chǎn)業(yè)戰(zhàn)略高度[3]。中藥現(xiàn)代化是指將傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，通過科學(xué)研究、技術(shù)創(chuàng)新和工業(yè)化生產(chǎn)等手段，提高中藥的療效、質(zhì)量和安全性，推動中醫(yī)藥的傳承和發(fā)展。

1 合成生物學(xué)研究可推動中藥現(xiàn)代化發(fā)展

21世紀(jì)以來，合成生物學(xué)引領(lǐng)了生命科學(xué)領(lǐng)域的第三次革命，成為國際前沿科學(xué)的研究熱點(diǎn)。合成生物學(xué)融合了生物學(xué)、工程學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)和計算機(jī)科學(xué)等學(xué)科的相關(guān)知識，應(yīng)用其技術(shù)可對生物體進(jìn)行有目標(biāo)的設(shè)計、改造乃至人工合成全新的生物體[4-6]。合成生物學(xué)研究采用理性設(shè)計實(shí)現(xiàn)從生物元器件、合成途徑到復(fù)雜的生物合成網(wǎng)絡(luò)的搭建，最后到構(gòu)建具有特定功能的人工生物體系，這種“自下而上”的研究策略推動著實(shí)驗科學(xué)向可定量、可預(yù)測、人工設(shè)計合成生物體的工程科學(xué)跨越[6]。得益于基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)及蛋白組和代謝組分析技術(shù)通量的不斷提高與成本下降，越來越多的藥用植物的組學(xué)信息得到明確，這為中藥活性成分的合成生物學(xué)研究提供了有利條件。合成生物學(xué)研究可高效利用組學(xué)數(shù)據(jù)，挖掘和表征生物元件，進(jìn)一步解析與重構(gòu)中藥活性成分的生物合成途徑，為創(chuàng)建中藥活性成分的從頭合成技術(shù)和明確這些活性成分的藥理藥效機(jī)制奠定基礎(chǔ)。合成生物學(xué)研究偏重于改造和優(yōu)化適用于生物合成的微生物底盤細(xì)胞，包括大腸埃希菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和米曲霉（Aspergillus oryzae）等細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)中藥活性成分生物合成途徑的異源定向合成，同時結(jié)合代謝工程對生物合成途徑進(jìn)行全局性調(diào)控和優(yōu)化，得到能高效合成目標(biāo)活性成分的細(xì)胞工廠，再通過發(fā)酵工藝和分離純化工藝優(yōu)化，最終實(shí)現(xiàn)單一中藥活性成分的大規(guī)模、高純度生產(chǎn)。通過合成生物學(xué)技術(shù)還可建立分子標(biāo)記和檢測方法，對中藥活性成分進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定和定量分析[7-8]。因此，在中藥研發(fā)過程中，利用合成生物學(xué)技術(shù)不僅能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜中藥活性成分的高純度、規(guī)模化的異源定向合成，從而極大地緩解土地資源等的壓力，降低生產(chǎn)成本，還有助于中藥活性成分藥理機(jī)制的研究，制定中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥?？傊?，合成生物學(xué)可推動中藥的現(xiàn)代化發(fā)展，提高中藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為中醫(yī)藥的傳承和發(fā)展注入新的活力。

2 合成生物學(xué)在中藥活性成分制備中的應(yīng)用

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，中藥活性成分逐漸得到闡釋，并發(fā)現(xiàn)了不少具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒和保護(hù)血管等作用的化合物[9]。例如，來自淫羊藿的淫羊藿素具有治療晚期肝癌和改善性功能的功效[10]；三七中的人參皂苷具有活血、抗血栓和抗動脈粥樣硬化等作用，可用于治療心腦血管疾病[11]；黃連所含黃連素具有抗菌、抗炎作用，可用于治療腸胃感染等疾病[12]。中藥活性成分是中藥之所以能夠治病救人的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，對中藥活性成分進(jìn)行研究可為疾病治療提供新的思路和方法，有助于中醫(yī)藥的傳承和發(fā)展。

借助高效的合成生物學(xué)研究策略和技術(shù)，研究人員開展了大量的中藥活性成分生物合成相關(guān)研究工作，不僅加快了眾多中藥組學(xué)信息的解析，還開發(fā)了相關(guān)組學(xué)數(shù)據(jù)分析與生物元件挖掘的平臺，包括plantiSMASH平臺[13]、1KP Project數(shù)據(jù)庫[14]等。目前，國內(nèi)外都已擁有先進(jìn)的生物元件庫，如美國的標(biāo)準(zhǔn)生物元件登記庫（http：//partsregistry.org/）[15]和我國的合成生物學(xué)元件與數(shù)據(jù)庫（www.biosino.org/npbiosys/），它們覆蓋了啟動子、轉(zhuǎn)錄單元、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等元件信息，尤其是對功能性元件異戊烯基轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、萜烯合酶、氧化酶、還原酶等元件的大量挖掘和功能解析，這為解析更多中藥活性成分的生物合成途徑奠定了強(qiáng)大基礎(chǔ)。此外，研究人員還根據(jù)不同類型的中藥活性成分開發(fā)和改造了大腸埃希菌、釀酒酵母、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、鏈霉菌（Streptomyces）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）等多種微生物底盤，為中藥活性成分的異源生物合成途徑提供最優(yōu)的適配底盤。在這些研究的基礎(chǔ)上，越來越多的中藥活性成分得以實(shí)現(xiàn)了基于合成生物學(xué)技術(shù)的綠色制備。

2.1 合成生物學(xué)在青蒿素合成中的應(yīng)用

我國早在馬王堆三號漢墓中發(fā)掘的帛書《五十二病方》中就有青蒿入藥的記載，《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》等中藥學(xué)典籍中也都收錄了青蒿。青蒿中青蒿素的發(fā)現(xiàn)被譽(yù)為是我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥獻(xiàn)給世界的重要禮物，獲得2015年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎的我國科學(xué)家屠呦呦正是受到東晉葛洪《肘后備急方》中將青蒿“絞汁”用藥經(jīng)驗的啟示，從“青蒿一握，以水一升漬，絞取汁，盡服之截瘧”中意識到青蒿的活性成分可能忌高溫或酶解，故提出改用沸點(diǎn)比乙醇低的乙醚提取，最終分離得到了對鼠瘧原蟲具有100%抑制率的青蒿素。此后，基于青蒿素的聯(lián)合療法在世界上得到廣為應(yīng)用，由此挽救了無數(shù)瘧疾患者的生命。

青蒿素是一種倍半萜類化合物，其生物合成途徑十分復(fù)雜。2000年，瑞典和荷蘭的研究人員首先解析了紫穗槐二烯的生物合成途徑[16]。隨后，美國加州大學(xué)研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)了自紫穗槐二烯生物合成青蒿酸所需的細(xì)胞色素P450酶（CYP71AV1）和還原酶[17]，以及氧化青蒿醇所需的脫氫酶（ADH1）[18]；加拿大和比利時的研究人員分別解析了自青蒿醛生物合成二氫青蒿醛所需的還原酶（Dbr2）[19]和將青蒿醛氧化為青蒿酸所需的脫氫酶（ALDH1）[20]。2013年，美國加州大學(xué)研究團(tuán)隊在釀酒酵母中構(gòu)建了青蒿素前體青蒿酸的合成途徑，通過優(yōu)化上游合成途徑、抑制競爭途徑、優(yōu)化發(fā)酵工藝等策略，使青蒿酸的產(chǎn)量達(dá)到25 g/L[18]（圖1）。由于從青蒿酸到青蒿素的生物合成途徑尚未得到完全解析，所以目前仍采用化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)自青蒿酸到青蒿素的轉(zhuǎn)化，該化學(xué)轉(zhuǎn)化收率為55%[21]。相信繼續(xù)努力之下，未來必能利用合成生物學(xué)技術(shù)徹底打通青蒿素的異源生物合成途徑，完全實(shí)現(xiàn)青蒿素的異源生物合成。

2.2 合成生物學(xué)在人參皂苷合成中的應(yīng)用

人參屬于五加科人參屬植物，是我國最著名的中藥材之一?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載：“人參，味甘微寒，主補(bǔ)五臟，安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目、開心益智。久服，輕身延年。”現(xiàn)代研究表明，人參皂苷是人參中的主要活性成分，是一類具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用的三萜類化合物。人參皂苷根據(jù)其皂苷元結(jié)構(gòu)可以分為達(dá)瑪烷型（dammarane type，四環(huán)三萜類化合物）和齊墩果烷型（oleanane type，五環(huán)三萜類化合物）2種類型，其中達(dá)瑪烷型人參皂苷還可進(jìn)一步根據(jù)其C6位是否含有羥基而分為原人參二醇（protopanaxadiol， PPD）型和原人參三醇（protopanaxatriol， PPT）型2種類型[23]（圖2）。迄今已從人參屬植物中分離并鑒定出約100多種人參皂苷，它們均為上述不同皂苷元的糖基化修飾衍生物。糖基的結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)、糖鏈的組成和長度的差異導(dǎo)致不同人參皂苷的水溶性，穩(wěn)定性等理化性質(zhì)不同，最終表現(xiàn)出生物活性和藥用價值的不同。人參屬植物在我國中藥學(xué)中具有舉足輕重的地位，對人參各活性成分的功效進(jìn)行深入研究有助于促進(jìn)人參皂苷在現(xiàn)代醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用（表1）。

人參皂苷現(xiàn)主要來源于三七和人參等人參屬植物。作為三萜類化合物，人參皂苷的生物合成單元異戊烯單元有異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate， IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate， DMAPP）2種，其生物合成也有甲基赤蘚糖醇4-磷酸（methylerythritol 4-phosphate）和甲羥戊酸（mevalonate， MVA）2條途徑。2種異戊烯單元IPP與DMAPP反應(yīng)形成C10單元GPP，GPP再與IPP或DMAPP反應(yīng)得到C15單元FPP，F(xiàn)PP二聚化形成角鯊烯，角鯊烯在角鯊烯環(huán)氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為2，3-環(huán)氧角鯊烯，后者再在不同的環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶（oxidosqualene cyclases， OSCs）的催化下形成不同環(huán)系的三萜母核骨架，最后經(jīng)過細(xì)胞色素P450酶和糖基轉(zhuǎn)移酶元件的修飾形成各種三萜皂苷衍生物[24-25]。近年來，通過對人參、三七和西洋參的轉(zhuǎn)錄組和功能基因的研究，人參皂苷元和人參皂苷的生物合成途徑解析獲得了非常大的進(jìn)展。2006年，日本科學(xué)家Tansakul等[26]根據(jù)OSCs的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計兼并引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從人參毛狀根的RNA中獲得了在人參皂苷生物合成途徑中至關(guān)重要的達(dá)瑪烯二醇合成酶PgDDS的編碼基因。2011年韓國科學(xué)家Han等[27]通過對人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析并結(jié)合茉莉酸甲酯誘導(dǎo)策略獲得了一種細(xì)胞色素P450酶CYP716A47，該酶被證實(shí)主要負(fù)責(zé)達(dá)瑪烯二醇的C12位羥基化而合成PPD；2012年Han等[28]又進(jìn)一步鑒定了催化PPD C6位羥基化的CYP716A53v2，進(jìn)而完成了PPT生物合成途徑的解析。CYP716A53v2還可催化β-香樹脂醇的C28位羥基化而合成齊墩果酸[29]。Yue等[30]于2005年從三七的細(xì)胞懸液中純化得到一種可催化人參皂苷Rd轉(zhuǎn)糖基生成人參皂苷Rb1的糖基轉(zhuǎn)移酶UGRdGT，但未鑒定其編碼基因。2014年，筆者課題組鑒定了第一種人參來源的糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPg1，并證實(shí)其能對達(dá)瑪烯二醇、PPD和多種PPD型人參皂苷的C20位羥基進(jìn)行糖基化修飾，特別是催化PPD生成人參屬植物中含量稀少的人參皂苷CK[31]。稍后，研究人員又報告了人參來源的2組糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT74AE2/UGT94Q2和UGTPg45/ UGTPg29）都可在PPD的C3位引入一個糖基并使之延伸[32-33]。2020年，筆者課題組從人參屬植物中分離到140多種糖基轉(zhuǎn)移酶[34]，從而解析了多種人參皂苷的生物合成途徑。這些生物合成途徑的解析為實(shí)現(xiàn)人參皂苷的異源生物合成奠定了堅實(shí)的元件基礎(chǔ)。

隨著多種人參皂苷生物合成途徑得到解析，以微生物底盤作為細(xì)胞工廠實(shí)現(xiàn)人參皂苷的異源生物合成受到越來越多的關(guān)注。Han等[27-28]先將PPD生物合成的關(guān)鍵基因PgDDS和CYP716A47導(dǎo)入到釀酒酵母中，結(jié)合酵母自身的MVA途徑，構(gòu)建了第一個可從葡萄糖合成PPD的酵母細(xì)胞；隨后又在該釀酒酵母中轉(zhuǎn)入CYP716A53v2，從而得到了第一個能夠合成PPT的酵母菌株。Dai等[35]將來源于人參的PgDDS、CYP716A47和來源于擬南芥的ATR1基因整合到釀酒酵母染色體中，以強(qiáng)化上游MVA途徑和環(huán)氧角鯊烯的合成等，使酵母的PPD產(chǎn)量達(dá)到每升克級水平。筆者課題組通過系統(tǒng)強(qiáng)化前體MVA途徑，并針對合成途徑中關(guān)鍵的細(xì)胞色素P450酶進(jìn)行優(yōu)化，大幅提高了酵母細(xì)胞工廠合成PPD的產(chǎn)量，10 L發(fā)酵罐的產(chǎn)量達(dá)到11.0 g/L[36]。此外，通過繼續(xù)優(yōu)化從PPD到PPT的合成途徑，后續(xù)又實(shí)現(xiàn)了PPT的高效合成，產(chǎn)量達(dá)到5.0 g/L[37]。2014年，隨著稀有人參皂苷CK的生物合成途徑被完全解析，筆者課題組首次成功地在釀酒酵母底盤細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了人參皂苷CK的從頭合成（產(chǎn)量約1.4 mg/L）[31]。此后，通過代謝工程手段如前體生物合成途徑的強(qiáng)化、元件的篩選與改造，以及二磷酸尿苷葡糖合成的優(yōu)化等，人參皂苷CK的發(fā)酵產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高，最高產(chǎn)量達(dá)5.7 g/L[38]。隨著更多人參皂苷的生物合成途徑被解析（圖3），筆者課題組陸續(xù)構(gòu)建了系列人參皂苷細(xì)胞工廠。目前，對于人參皂苷Rh2[32-33， 36， 39-40]、Rg3[32-33]、Rh1[41]、F1[41]、Rg1[42]、Rg2和Re[43]，以及三七皂苷R2和R1[37]，均已實(shí)現(xiàn)了在釀酒酵母中的異源生物合成，為高產(chǎn)、綠色、可持續(xù)的人參皂苷產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐和研究經(jīng)驗。

2.3 合成生物學(xué)在淫羊藿素合成中的應(yīng)用

淫羊藿素是淫羊藿的主要活性成分之一，是一種經(jīng)異戊烯基化和甲基化修飾的黃酮類化合物。淫羊藿素不僅具有神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)和抗骨質(zhì)疏松的作用[43-44]，還可抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展，誘導(dǎo)慢性髓系白血病細(xì)胞凋亡[45-46]。在我國，淫羊藿素已獲得國家藥品監(jiān)督管理局的附條件批準(zhǔn)上市，用于治療晚期肝細(xì)胞癌。

為了緩解淫羊藿的資源短缺和淫羊藿素化學(xué)合成難度大、污染多等問題[47]，非常有必要開展淫羊藿素的合成生物學(xué)研究。淫羊藿素屬于黃酮類化合物，其生物合成前體為山萘酚和柚皮素，這些前體的合成途徑很早便得到了解析并相繼在多種微生物底盤細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了異源生物合成。2014年，Wu等[48]在大腸埃希菌中組裝并優(yōu)化了柚皮素的完整生物合成途徑，柚皮素的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到100.6 mg/L。Trantas等[49]則通過在釀酒酵母中分別組裝不同來源的類黃酮合成酶，實(shí)現(xiàn)了柚皮素、山奈酚、染料木素和槲皮素等多種黃酮類化合物的從頭合成。此后，Lyu等[50]還結(jié)合生物合成途徑優(yōu)化等策略提高釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)總黃酮類化合物的產(chǎn)量，其中柚皮素和山奈酚的產(chǎn)量分別達(dá)到220和86 mg/L。得益于前體山奈酚的生物合成元件一一得到解析，如淫羊藿來源的肉桂酸-4-羥化酶EsC4H、4-香豆酸輔酶A連接酶Es4CL1和Es4CL2、查爾酮合成酶EsCHS3、黃酮醇合成酶EsFLS、黃酮-3-羥化酶EsF3H[51]、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶EsPT2等，筆者課題組借助大豆來源的甲基轉(zhuǎn)移酶GmOMT2搭建了一條完整的淫羊藿素生物合成途徑[52]。通過在釀酒酵母中引入來源于擬南芥、大腸埃希菌、約氏黃桿菌、箭葉淫羊藿等物種的11種外源基因，并對5種酵母內(nèi)源基因進(jìn)行修飾改造等策略，先在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了淫羊藿素前體8-異戊烯基山奈酚的從頭合成，然后又采用兩種策略解決催化8-異戊烯基山奈酚合成淫羊藿素的甲基轉(zhuǎn)移酶元件與酵母細(xì)胞質(zhì)pH不適配的問題，分別實(shí)現(xiàn)了淫羊藿素的從頭合成（圖4）：一種策略是通過將關(guān)鍵的甲基轉(zhuǎn)移酶元件定位于具有更高pH的酵母線粒體中，實(shí)現(xiàn)酵母從頭合成淫羊藿素，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為7.2 mg/L；另一種策略是將甲基轉(zhuǎn)移酶元件構(gòu)建到大腸埃希菌中，并與產(chǎn)8-異戊烯基山奈酚酵母菌株進(jìn)行共培養(yǎng)，淫羊藿素的發(fā)酵產(chǎn)量提高到19.7 mg/L，這種微生物共培養(yǎng)的設(shè)計也為天然產(chǎn)物的異源生物合成提供了新策略。

2.4 合成生物學(xué)在其他中藥活性成分合成中的應(yīng)用

對于其他多種中藥活性成分，研究人員也進(jìn)行了深入的合成生物學(xué)研究。例如，被譽(yù)為“神龍草”的甘草具有清熱解毒、止咳祛痰、補(bǔ)脾益氣、抗病毒和消炎的功效，而甘草酸是甘草中含量最高的三萜類化合物，也是甘草的主要活性成分。Xu等[53]通過對α-香樹脂合成酶和細(xì)胞色素P450酶進(jìn)行改造，并引入哺乳動物來源的糖基轉(zhuǎn)移酶和二磷酸尿苷葡糖脫氫酶，在釀酒酵母中成功實(shí)現(xiàn)了甘草酸的從頭合成，甘草酸的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為5.98 mg/L。

蛇床子素是蛇床子的重要活性成分，是一種香豆素類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、提高免疫功能等作用。Wang等[54]通過鑒定并引入香豆素合成酶、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶基因，首次在釀酒酵母中構(gòu)建了蛇床子素的生物合成途徑，再經(jīng)解決蛋白表達(dá)、輔因子供應(yīng)等問題和優(yōu)化發(fā)酵工藝等，最終使蛇床子素的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到255.1 mg/L。

丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩和涼血消癰等功效，其主要活性成分丹參酮為二萜類化合物，對預(yù)防和治療心腦血管系統(tǒng)疾病有顯著效果。研究人員通過代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析獲得了可能與丹參酮生物合成相關(guān)的候選基因，并成功克隆其中2種基因SmCPS和SmKSL，在釀酒酵母中構(gòu)建并優(yōu)化了能高效合成次丹參酮二烯的功能模塊，使次丹參酮二烯的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到488 mg/L[55-56]。次丹參酮二烯是丹參酮生物合成的關(guān)鍵前體。此后，Ma等[57]又發(fā)現(xiàn)了一個與丹參酮生物合成相關(guān)的大型基因簇，這將加速丹參酮生物合成途徑的解析進(jìn)程。

3 結(jié)語

從青蒿中尋找到了抗瘧藥青蒿素，從淫羊藿中尋找到了晚期肝癌治療藥淫羊藿素，這些事實(shí)說明，中醫(yī)藥不愧是中華民族的瑰寶，她能造福全人類。推進(jìn)中藥現(xiàn)代化是保護(hù)、傳承和發(fā)展中醫(yī)藥的關(guān)鍵，而將傳統(tǒng)中醫(yī)藥與現(xiàn)代合成生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的重要途徑：一方面，利用合成生物學(xué)技術(shù)，越來越多的中藥活性成分，包括萜類、黃酮類、生物堿類等化合物，得以實(shí)現(xiàn)了基于異源生物合成的規(guī)?；苽?，生物合成成為獲取中藥活性成分的新模式，這不僅可極大緩解中藥材種植和加工的壓力，而且能保障重要中藥活性成分的高品質(zhì)、低成本和穩(wěn)定供應(yīng)，減少傳統(tǒng)中藥應(yīng)用中的質(zhì)量和安全隱患；另一方面，利用合成生物學(xué)技術(shù)制備中藥活性成分并對其開展藥理學(xué)研究，將為中藥藥效研究及其闡釋打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。未來，隨著合成生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，相關(guān)使能工具的進(jìn)一步開發(fā)與完善，以及生物大數(shù)據(jù)庫、人工智能、高通量自動化平臺等先進(jìn)技術(shù)體系的融入，中藥現(xiàn)代化進(jìn)程必會大大加快。

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