合成生物學在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用進展

李瀚純 王鑫 瞿旭東 王舒

摘 要 近20年來，合成生物學在生物回路構(gòu)建、生物元件標準化，以及各種基因組/代謝工程工具和方法的開發(fā)方面不斷取得突破。合成生物學的快速發(fā)展正在改變生物技術(shù)行業(yè)的產(chǎn)業(yè)布局。目前，合成生物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物合成、醫(yī)學、能源、工業(yè)等多個領(lǐng)域。醫(yī)藥的需求也推動了合成生物學的發(fā)展，包括將體外催化技術(shù)應(yīng)用于手性醫(yī)藥化學品的綠色制造，將異源途徑整合到細胞中以有效生產(chǎn)藥物等。合成生物學憑藉更經(jīng)濟、環(huán)境友好等突出特點，將顛覆一部分傳統(tǒng)醫(yī)藥的制造方式。本文概要介紹合成生物學在手性醫(yī)藥化學品的綠色制造和植物天然產(chǎn)物的生物制造方面的應(yīng)用進展。

關(guān)鍵詞 合成生物學 醫(yī)藥化學品 天然產(chǎn)物 萜類化合物 芳香族化合物

中圖分類號：Q819； O629.71 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）07-0024-08

引用本文 李瀚純， 王鑫， 瞿旭東， 等. 合成生物學在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用進展[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（7）： 24-31； 55.

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2022YFC 2303104）

Applications of synthetic biology in the pharmaceutical field

LI Hanchun， WANG Xin， QU Xudong， WANG Shu

（Abiochem Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 200241， China）

ABSTRACT In the past two decades， synthetic biology has made breakthroughs in the construction of biocircuits， the standardization of biological elements and the development of various genomic/metabolic engineering tools and approaches. Its rapid development is changing the industrial layout of biotechnology industry. At present， synthetic biotechnology has been widely used in many fields such as natural product synthesis， medicine， energy and industry. Pharmaceutical demands have also driven its development， including the application of in vitro catalytic technology in the green manufacturing of chiral pharmaceutical chemicals and the integration of heterologous pathways into designer cells to efficiently produce medicines and so on. Synthetic biology， with its more economical and environmentally friendly features， will subvert some traditional pharmaceutical manufacturing methods. This article reviews the applications of synthetic biology in the green manufacturing of chiral pharmaceutical chemicals and the biological manufacturing of natural plant products.

KEY WORDS synthetic biology； pharmaceutical chemicals； natural products； terpenoids； aromatic compounds

合成生物學是采用工程科學研究理念，對生物體進行定向設(shè)計、理性改造甚至創(chuàng)造新型生物體的一門學科。合成生物學起源于20世紀初，基因組工程、生物基因組和染色體合成、通過多基因操控構(gòu)建細胞工廠，這3條科技發(fā)展主線推動了合成生物學理論的發(fā)展和合成生物技術(shù)的實踐。近年來，合成生物學快速發(fā)展，直接原因是：①基因測序、基因合成、基因編輯等生物學技術(shù)的進步[1]；②上游技術(shù)成本降低使得合成生物技術(shù)在中游平臺層和下游產(chǎn)品層公司快速普及，帶來產(chǎn)業(yè)生態(tài)活力。

合成生物學融匯了生物學、基因組學、工程學和信息學等學科的知識和技術(shù)，具有重大的科學與技術(shù)價值。合成生物學采用“自下而上”的策略，將傳統(tǒng)生命科學的研究范式從“認識生命”跨越到“設(shè)計生命”，是引領(lǐng)“第三次生物科學革命”的顛覆性技術(shù)。隨著一系列關(guān)鍵的底層技術(shù)的發(fā)展，合成生物學工程化應(yīng)用的步伐正在加快[2]。

合成生物制造以合成生物學為工具，是一種綠色生產(chǎn)方式，是解決全球氣候變暖問題和實現(xiàn)碳中和目標的解決方案之一[3]。我國已將發(fā)展合成生物制造、加快合成生物技術(shù)發(fā)展和產(chǎn)業(yè)生態(tài)建設(shè)的重要性上升至國家戰(zhàn)略高度。世界經(jīng)濟合作與發(fā)展組織指出，與石油化工路線相比，合成生物制造在降低工業(yè)過程消耗、減少“三廢”排放和污染方面極具優(yōu)勢，可以大幅降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)升級[4-5]。未來，合成生物制造有可能徹底革新食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、能源、材料等行業(yè)的傳統(tǒng)生產(chǎn)模式。醫(yī)藥生產(chǎn)的兩大難點手性小分子藥物和植物天然產(chǎn)物的生產(chǎn)也有望借助合成生物技術(shù)獲得突破和產(chǎn)業(yè)升級。

1 手性醫(yī)藥化學品的綠色制造

醫(yī)藥化學品的開發(fā)及其制造水平是衡量一個國家科技發(fā)展水平的重要標準之一。手性醫(yī)藥化學品是醫(yī)藥化學品的重要組成部分，在2022年全球銷售額排位前200名的小分子藥物中，60%以上是手性小分子藥物（https：// sites.arizona.edu/njardarson-lab/top200-posters/）。目前，手性醫(yī)藥化學品往往采用化學合成方式制造，存在諸如底物合成困難、催化劑昂貴且易中毒失活、產(chǎn)品ee值低等問題。生物催化是利用生物體系（如微生物或酶）作為催化劑來進行化學反應(yīng)的技術(shù)，具有條件溫和、環(huán)境友好、高效、高選擇性的特點，非常適用于手性醫(yī)藥化學品的制造。

近幾十年來，生物催化已廣泛應(yīng)用于各種化學合成過程中。例如，工業(yè)上大規(guī)模采用的腈水合酶法制備丙烯酰胺，就是生物催化法替代化學催化法的典型案例。近年來，生物催化在復(fù)雜藥物分子合成上的應(yīng)用也越來越多，并逐步成為大型制藥和精細化學品公司相關(guān)化學工藝路線開發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)。

生物催化中常用的酶主要有氧化還原酶（羰基還原酶、亞胺還原酶、烯還原酶、Baeyer-Villiger單加氧酶、單胺氧化酶）、轉(zhuǎn)移酶（轉(zhuǎn)氨酶）、裂解酶（腈水解酶、鹵醇脫鹵酶、?；D(zhuǎn)移酶）等（圖1）。

手性胺類、手性醇類、手性氨基酸類是重要的醫(yī)藥中間體。在全球銷售額排位前200名的小分子藥物中，有40個藥物的分子具有手性胺結(jié)構(gòu)（不包括手性氨基酸），52個藥物的分子具有手性醇結(jié)構(gòu)，38個藥物的分子具有手性氨基酸結(jié)構(gòu)（不包括10個多肽藥物）[7]。因此，手性胺類、手性醇類、手性氨基酸類醫(yī)藥中間體的生物合成是生物催化的主要研究方向之一（表1～3）。

2 植物天然產(chǎn)物的微生物重組合成

植物天然產(chǎn)物是指植物次生代謝所產(chǎn)生的能夠幫助植物抵御外界侵擾或者充當信號物質(zhì)參與環(huán)境響應(yīng)的一類具有生物活性的小分子化合物。

在醫(yī)藥領(lǐng)域，植物天然產(chǎn)物是藥物及其先導(dǎo)化合物的重要來源，在近40年獲批上市的藥物中，天然產(chǎn)物及其衍生物占1/4。植物天然產(chǎn)物主要依賴傳統(tǒng)的植物提取方式進行生產(chǎn)，難以滿足社會發(fā)展的需求。此外，某些藥用植物天然資源瀕危，人工種植困難或生長周期長，且活性成分含量低，提取過程繁瑣、收率低。同時，多數(shù)天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學合成路徑長，反應(yīng)過程復(fù)雜、產(chǎn)率低、能耗高、污染重、成本高，很難實現(xiàn)環(huán)境友好的規(guī)?；a(chǎn)[1， 8]。

基于合成生物學的原理，將藥用植物基因組裝、編輯到微生物細胞中，開創(chuàng)通過微生物發(fā)酵制造天然產(chǎn)物的新方法，可以突破植物資源限制，具有環(huán)境友好、生產(chǎn)速度快、易于大規(guī)模生產(chǎn)等多種優(yōu)勢，是未來合成生物制造產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向之一[9]。

通過多年的努力，研究人員已構(gòu)建了青蒿素、人參皂苷、番茄紅素、β-胡蘿卜素、甜菊糖、紅景天苷、天麻素、燈盞花素、丹參新酮等一批植物天然產(chǎn)物的生物制造路線[5， 10-11]。

2.1 萜類化合物

萜類化合物廣泛存在于自然界，是五碳化合物異戊二烯的衍生物，是最大一類植物次級代謝產(chǎn)物。迄今已發(fā)現(xiàn)超過8萬種的萜類化合物，約占已鑒定天然產(chǎn)物的60%[12-13]。青蒿素、人參皂苷和類胡蘿卜素均屬于萜類化合物（表4）。

抗瘧藥青蒿素是在我國傳統(tǒng)中草藥青蒿中發(fā)現(xiàn)的一種倍半萜類化合物，目前主要從黃花蒿中提?。ê糠浅５停瑑H0.01%～1%），或者提取其中含量較高的青蒿酸，然后再通過化學方法合成。但這些生產(chǎn)方法的產(chǎn)能很低，難以滿足醫(yī)療需求。由于青蒿素分子中含有多個手性中心，其化學全合成是非常困難和低效的。

微生物重組合成青蒿素前體可以大幅降低青蒿素的合成成本，是一條非常有潛力的合成路徑，也是生物合成天然產(chǎn)物的典型案例。2013年，Paddon等[21]報告在酵母中打通了青蒿酸的生物合成路徑，青蒿酸產(chǎn)量達25 g/L。該研究工作被認為是通過合成生物學方式生產(chǎn)天然產(chǎn)物的里程碑[22]。2020年，Paddon等[14]又描述了進一步用易錯聚合酶鏈式反應(yīng)方法對來自黃花蒿的細胞色素P450氧合酶CYP71AV1的基因進行飽和突變，獲得的8位點組合突變體可使青蒿酸的發(fā)酵產(chǎn)量大幅提高至45g/L的專利技術(shù)。

人參皂苷是在植物中發(fā)現(xiàn)的三萜皂苷，具有抗氧化、抗炎、舒張血管、抗過敏、抗糖尿病等作用。人參皂苷市場需求大，但受限于人參資源稀少和其在人參中的含量過低[23]，供應(yīng)量遠遠不能滿足人們的需求。

中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所的張學禮研究團隊和中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心的趙國屏研究團隊均在人參皂苷的生物合成方面取得了卓越成果。張學禮研究團隊通過優(yōu)化甲羥戊酸途徑，優(yōu)化基因模塊組合，調(diào)控達瑪烯二醇Ⅱ（人參皂苷生物合成途徑中的重要中間體）合酶基因和麥角甾醇合成途徑中的ERG7基因的表達，以及優(yōu)化發(fā)酵工藝等策略，創(chuàng)建出達瑪烯二醇Ⅱ的產(chǎn)量能達到15 g/L的高效酵母細胞工廠[24]，并解析了達瑪烷型皂苷的生物合成途徑[25]。該研究團隊還通過重建新的反應(yīng)區(qū)室，大幅提高了原人參二醇的合成效率，并在此基礎(chǔ)上引入人參皂苷CK的高效合成模塊，獲得了在5 L發(fā)酵罐中能生產(chǎn)出5 g/L人參皂苷CK的工程菌[16]。

趙國屏研究團隊通過解析稀有人參皂苷成分的合成途徑，鑒定合成途徑的關(guān)鍵元件，系統(tǒng)強化甲羥戊酸途徑，以及調(diào)控關(guān)鍵基因的表達等手段，解決了前體原人參二醇合成效率低、元件與底盤細胞的適配性問題，構(gòu)建了利用單糖發(fā)酵從頭高效合成原人參二醇的釀酒酵母細胞工廠，10 L發(fā)酵罐的產(chǎn)量達到11 g/L[15]?；诖说妆P，該研究團隊又對原人參二醇向人參皂苷Rh2轉(zhuǎn)化中的一步糖基化反應(yīng)進行了系統(tǒng)優(yōu)化，實現(xiàn)了人參皂苷Rh2的高效合成，10 L發(fā)酵罐的產(chǎn)量達到2.25 g/L[15]。目前，趙國屏研究團隊已成功地將15種人參皂苷單體化合物的發(fā)酵產(chǎn)量提高至產(chǎn)業(yè)化水平，包括人參皂苷CK、Rg3、Rh1、Rh2、F1、Rg2和三七皂苷R1、R2等稀有人參皂苷成分，可以實現(xiàn)人參皂苷各種單體成分的高產(chǎn)率、高純度、低成本生產(chǎn)。

類胡蘿卜素是一類由類異戊二烯單元聚合形成的天然色素，是典型的四萜化合物，天然存在于細菌、真菌、藻類和植物中。目前已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)且應(yīng)用廣泛的類胡蘿卜素有β-胡蘿卜素、番茄紅素和蝦青素等[26]，尤以β-胡蘿卜素的應(yīng)用最為廣泛。

β-胡蘿卜素是維生素A的前體，具有著色、抗氧化和營養(yǎng)等作用，廣泛用于食品和保健品行業(yè)。β-胡蘿卜素雖廣泛存在于真菌、藻類和植物中，但從這些自然資源中提取生產(chǎn)β-胡蘿卜素的效率極低。因此，目前化學合成仍是大規(guī)模生產(chǎn)β-胡蘿卜素的主要方法之一。不過，化學合成法也面臨著一些挑戰(zhàn)，如工藝復(fù)雜、“三廢”問題等。近年來，微生物發(fā)酵法因其生物安全性、環(huán)境友好性和可持續(xù)性而成為β-胡蘿卜素生產(chǎn)的一種有前途的替代方法。合成生物學技術(shù)的不斷發(fā)展也極大地推動了β-胡蘿卜素在大腸埃希菌、釀酒酵母、解脂耶氏酵母等常用底盤中的高效合成（每升數(shù)克級）研究[27]，但尚未達到可工業(yè)化生產(chǎn)水平。

美國麻省理工學院的Gregory Stephanopoulos研究團隊在類胡蘿卜素生物合成方面進行了系統(tǒng)的研究，首次發(fā)現(xiàn)番茄紅素環(huán)化酶的底物抑制效應(yīng)問題。他們通過蛋白質(zhì)工程和代謝流調(diào)控手段解決了類胡蘿卜素微生物合成中存在的酶調(diào)控問題，有效地解除了底物抑制效應(yīng)，最終β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達到39.5 g/L[19]。

2.2 芳香族天然產(chǎn)物

芳香族天然產(chǎn)物是一類具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的有機化合物，包括對羥基肉桂酸及其衍生物、黃酮類、芪類、香豆素類和芳香族生物堿等。芳香族天然產(chǎn)物種類繁多、數(shù)量龐大，已知的有數(shù)萬種[28]。按分子骨架結(jié)構(gòu)分，芳香族天然產(chǎn)物中應(yīng)用最廣泛的是C6-C1型（水楊酸類）、C6-C2型（香草乙酮類）、C6-C3型（咖啡酸類）、C6-C2-C6型（二苯乙烯類）和C6-C3-C6型（黃酮類）這5型化合物（圖2）。

芳香族天然產(chǎn)物廣泛存在于植物中，其關(guān)系到植物的生長調(diào)節(jié)和對病蟲侵襲的防御作用[29]。芳香族天然產(chǎn)物在植物中的含量很低，經(jīng)常受限于資源問題而不能通過提取進行規(guī)模化生產(chǎn)。近年來，研究人員運用合成生物學技術(shù)在生物合成芳香族天然產(chǎn)物方面取得了諸多突破[30]，生物合成芳香族天然產(chǎn)物已成為天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的熱點之一。

C6-C1型化合物原兒茶酸，即3，4-二羥基苯甲酸，是一種水溶性酚酸類化合物，存在于許多食用和藥用植物中，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗高血糖、抗腫瘤和神經(jīng)保護作用。

Kogure等[31]在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建了兩條原兒茶酸合成路徑——3-脫氫莽草酸途徑和4-羥基苯甲酸途徑，從葡萄糖出發(fā)發(fā)酵生產(chǎn)原兒茶酸，產(chǎn)量達82.7 g/L，自葡萄糖計的得率為32.8%（mol/mol）。

在此之前，中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所的王欽宏研究團隊發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸的細胞毒性較強，若以葡萄糖為碳源進行從頭合成，原兒茶酸的產(chǎn)量只能達到33.3 g/L[32]。因此，該研究團隊此后繼續(xù)努力，采用分步合成的方式解決細胞毒性問題，首先構(gòu)建可高效合成3-脫氫莽草酸的細胞工廠，補料發(fā)酵濃度超過90 g/L，然后再利用表達3-脫氫莽草酸脫水酶的大腸埃希菌進行全細胞催化，最終得到產(chǎn)量達85 g/L以上的原兒茶酸，基本檢測不到3-脫氫莽草酸殘留[33]。

C6-C2型化合物羥基酪醇主要存在于橄欖植物中，作為一種食品抗氧化劑，已廣泛應(yīng)用于食用油、飲料、肉制品和乳制品生產(chǎn)行業(yè)。羥基酪醇還有許多重要的藥理活性，包括抗腫瘤、抗炎、軟骨保護和抗骨質(zhì)疏松作用。羥基酪醇主要從橄欖植物的葉子和果實中提取，但存在生產(chǎn)周期長、回收率低和原材料供應(yīng)隨季節(jié)變化等問題。因此，若能構(gòu)建微生物細胞工廠合成羥基酪醇，則不僅環(huán)保、成本低，而且可以獲得一定的經(jīng)濟利益。

江南大學的陳堅研究團隊周景文課題組利用大腸埃希菌合成羥基酪醇[34]。首先，在TyrR失活的大腸埃希菌中構(gòu)建羥基酪醇的從頭合成途徑。通過過表達突變體aroGfbr和去反饋抑制環(huán)己二烯基脫氫酶減輕aroG表達受到的抑制。同時，敲除磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、苯丙氨酸合成途徑，增強還原型黃素二核苷酸、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的再生，進一步增加羥基酪醇的積累。然后，又研究了不同來源HpaBC和HpaB的不同突變體對羥基酪醇從頭合成的影響。最后，結(jié)合轉(zhuǎn)化甘油策略，在5 L發(fā)酵罐中使羥基酪醇的產(chǎn)量達到9.87 g/L。

C6-C3型化合物是一類廣泛存在于中草藥中的天然產(chǎn)物，其中咖啡酸具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等藥理活性，臨床上主要用于外科手術(shù)時預(yù)防出血或止血，還可用于緩解白細胞減少癥、血小板減少癥等。此外，咖啡酸也是很多其他重要的酚酸類化合物的合成前體，如綠原酸、迷迭香酸和咖啡酸苯乙酯等。

江南大學的陳堅研究團隊周景文課題組針對現(xiàn)有咖啡酸生物合成報告中存在的中間體積累、輔因子不足和產(chǎn)物不耐受等問題，采用系統(tǒng)工程策略重構(gòu)了咖啡酸在大腸埃希菌中的生物合成途徑[35]。首先，通過篩選脫氨酶和4-羥基苯乙酸-3-單加氧酶，實現(xiàn)從酪氨酸脫氨、羥化合成咖啡酸的過程。然后，分別嘗試優(yōu)化基因連接方式和質(zhì)?？截悢?shù)、敲除咖啡酸合成前體酪氨酸競爭途徑基因、過表達苯丙素類轉(zhuǎn)運體基因、增加內(nèi)源性核黃素合成、過表達糖ABC轉(zhuǎn)運蛋白透性酶基因等手段，使咖啡酸的搖瓶產(chǎn)量增至0.78 g/L。最后，經(jīng)過優(yōu)化發(fā)酵條件，在5 L發(fā)酵罐中將咖啡酸的產(chǎn)量提高到7.9 g/L。

C6-C2-C6型化合物多是芪類化合物，其中白藜蘆醇為三羥基芪類化合物，是一種天然抗毒素，廣泛分布于葡萄、漿果、花生和其他植物中。臨床研究表明，白藜蘆醇可以改善糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀，還具有抗腫瘤、抗氧化作用，常被用作食品、化妝品的功能性添加劑。目前，白藜蘆醇主要來自植物提取，但提取工藝復(fù)雜，產(chǎn)量受到限制，難以滿足市場需求。因此，利用微生物細胞工廠合成白藜蘆醇成為一種有吸引力和可持續(xù)的替代方案。迄今為止，研究人員已在多種不同的底盤微生物（大腸埃希菌、谷氨酸棒桿菌、乳酸乳球菌等）中構(gòu)建了白藜蘆醇生物合成途徑[36]。

針對目前存在的前體供應(yīng)不足、異源途徑酶合成效率低下等問題，江南大學的陳堅研究團隊周景文課題組利用解脂耶氏酵母合成白藜蘆醇[37]。首先，篩選異源的白藜蘆醇合成途徑基因，以獲得最佳的白藜蘆醇生產(chǎn)菌株。接下來，通過增加前體供應(yīng)、融合表達4CL和STS基因以提高催化效率和碳代謝重排，將碳通量引向莽草酸合成途徑。然后，通過整合異源關(guān)鍵途徑基因、增加丙二酰輔酶A的前體供應(yīng)，使24孔板中發(fā)酵96 h的白藜蘆醇產(chǎn)量增至0.82 g/L。最后，經(jīng)過對5 L發(fā)酵罐生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，利用全合成培養(yǎng)基和發(fā)酵條件調(diào)控，使發(fā)酵過程中菌株一直處于酵母形態(tài)，發(fā)酵144 h后的白藜蘆醇產(chǎn)量達到22.5 g/L，自葡萄糖計的收率為65.5 mg/g，產(chǎn)率0.16 g/（L·h）。

3 展望

我國“十四五”規(guī)劃和2035年遠景目標綱要中已明確將合成生物學列為科技前沿領(lǐng)域之一。在國家發(fā)展生物經(jīng)濟戰(zhàn)略方針的指導(dǎo)下，許多地方政府將合成生物學列為其發(fā)展規(guī)劃的重點關(guān)注領(lǐng)域，并根據(jù)自身區(qū)域產(chǎn)業(yè)和經(jīng)濟特點，支持合成生物技術(shù)企業(yè)落地和產(chǎn)業(yè)鏈布局。在技術(shù)突破、資本關(guān)注、政策引導(dǎo)等多因素影響下，合成生物產(chǎn)業(yè)正在從技術(shù)驅(qū)動的初創(chuàng)期邁入產(chǎn)品成型的成長期，合成生物學支撐的生物制造產(chǎn)業(yè)正在成為快速發(fā)展的戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)。隨著生物制造進入快速產(chǎn)業(yè)化階段，其商業(yè)化產(chǎn)品數(shù)量大幅增加，產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)速度加快。在科技創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展戰(zhàn)略政策的引領(lǐng)下，依托合成生物制造技術(shù)，實現(xiàn)稀缺醫(yī)藥化學品的生產(chǎn)向綠色低碳、無毒無害、可持續(xù)發(fā)展的新模式邁進，將滿足人們對營養(yǎng)、健康、美麗生活品質(zhì)的更高需求，最終實現(xiàn)提升生命質(zhì)量、延長生命長度的美好愿景。

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