轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析空氣對泡菜“生花”酵母菌的影響機(jī)制

羅思洋,練銀銀,楊宇航,譚兆濤,潘玉龍,索化夷,宋佳佳,張玉,4*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400700)2(西南大學(xué) 食品科學(xué)與工程國家實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,重慶,400700) 3(重慶市潼南區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會,重慶,402660)4(國家柑橘工程中心,西南大學(xué),重慶,400712)

泡菜是以新鮮蔬菜為原料,經(jīng)中低濃度食鹽水泡漬發(fā)酵、調(diào)味、包裝、滅菌等過程生產(chǎn)加工而成的發(fā)酵食品[1]。截至2021年年底,四川省共有泡菜生產(chǎn)企業(yè)450余家,市場份額占中國總市場份額的70%,年產(chǎn)值446億元[2]。但由于泡菜原料未經(jīng)過滅菌處理和泡菜發(fā)酵過程難以控制,在發(fā)酵過程中一旦發(fā)酵條件不利,腐敗微生物就會大量滋生,造成泡菜品質(zhì)劣變,大量產(chǎn)品廢棄,給泡菜生產(chǎn)企業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3]。因此,泡菜品質(zhì)的保持對于泡菜生產(chǎn)企業(yè)而言就顯得尤為重要。

在泡菜品質(zhì)劣變的眾多現(xiàn)象中,“生花”是泡菜最常見的品質(zhì)裂變現(xiàn)象。泡菜“生花”是微生物在不良環(huán)境影響下,與滲出的胞外聚合物一起凝聚成的膜,可附著在固體表面或漂浮于液體表面[4]。泡菜“生花”不僅影響風(fēng)味,還會加快泡菜的腐敗,導(dǎo)致整壇泡菜都不能食用[5-6]?，F(xiàn)有研究表明引起泡菜“生花”的微生物主要是酵母菌:畢赤酵母、假絲酵母、漢斯德巴氏酵母、釀酒酵母等[6-8]。作者在前期研究中證實(shí)了“生花”酵母菌(CandidaparapsilosisB7)易成膜且成膜穩(wěn)定,并且“生花”受溫度和O2的影響[9]。雖然現(xiàn)在眾多研究證明了導(dǎo)致泡菜“生花”的主要菌屬是酵母菌,也分離到了具體的“生花”菌株,但是關(guān)于“生花”菌株的“生花”機(jī)制研究并不多見,使得泡菜“生花”問題未能有效解決。

泡菜“生花”受環(huán)境因素影響,泡菜壇/池的密封性是影響泡菜“生花”的關(guān)鍵因素[9]。本文選取在“生花”泡菜中分離鑒定的主要“生花”菌株C.parapsilosisB7為研究對象,模擬密封/非密封2種環(huán)境條件,利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)結(jié)合分析的方法,研究C.parapsilosisB7在有/無空氣下轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的差異情況,同時進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)驗(yàn)證關(guān)鍵差異基因的變化,探究C.parapsilosisB7的“生花”分子機(jī)制,為研究泡菜“生花”精準(zhǔn)防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

“生花”酵母菌(C.parapsilosisB7)由本實(shí)驗(yàn)室菌種資源庫保藏(“生花”泡菜樣液中分離得到)。

1.1.2 試劑

YPD培養(yǎng)基、酵母基因組DNA提取試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;Trizol Reagent、RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒,美國Thermo Fisher科技有限公司;異丙醇、無水乙醇,重慶川東化工有限公司;三氯甲烷,重慶科試化學(xué)有限公司;無核糖核酸酶水,上海碧云天公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H-2050R臺式高速冷凍離心機(jī),長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;CFX Connect型PCR儀,美國BioRad公司;LRHS-150-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ 2FD雙人單面超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HiSeq X Reagent Kits/NovaSeq Reagent Kits測序平臺,美國Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的活化

取甘油保藏的C.parapsilosisB7 200 μL接種到10 mL液體YPD培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h。在液體YPD培養(yǎng)基菌懸液中取一環(huán)接種到固體YPD培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h;在固體YPD培養(yǎng)基菌落中取一環(huán)接種到10 mL液體YPD培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h;最后在該液體YPD培養(yǎng)基菌懸液中取一環(huán)接種到固體YPD培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h后于4 ℃儲存,備用。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序

1)菌體收集

將活化的C.parapsilosisB7接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中,實(shí)驗(yàn)組(有空氣)使用透氣試管塞,對照組(無空氣)使用玻璃塞,37 ℃培養(yǎng)48 h。于10 000×g4 ℃離心10 min,去除上清液,使用無菌PBS洗滌菌體3次,收集菌體,經(jīng)液氮速凍保存。每個組3個重復(fù)。

在進(jìn)行企業(yè)的網(wǎng)絡(luò)營銷效果分析系統(tǒng)設(shè)計(jì)中，要盡可能將在系統(tǒng)設(shè)計(jì)中將關(guān)系消費(fèi)效果的網(wǎng)絡(luò)營銷影響因素和消費(fèi)者行為涵蓋在內(nèi)，確保網(wǎng)路哦營銷效果分析更加精準(zhǔn)到位，對于消費(fèi)行為和影響因素做到更有效的把握，這樣才能確保網(wǎng)絡(luò)營銷的有效性，為企業(yè)制定和調(diào)整網(wǎng)絡(luò)營銷方案提供有效的支持。例如，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，使用網(wǎng)絡(luò)搜尋資料的網(wǎng)民，90%是先通過搜索關(guān)鍵詞，查看排名靠前的相關(guān)網(wǎng)頁，關(guān)鍵詞的設(shè)置，可以讓目標(biāo)群體最快速搜索的查看到項(xiàng)目情況，獲最先的機(jī)會與客戶視覺接觸。

2)RNA提取、文庫構(gòu)建及測序

采用TRIzol(Invitrogen)法提取樣本中的總RNA,并使用DNase I(TaKaRa)去除基因組DNA。分別采用2100 Bioanalyser(Agilent)、ND-2000(NanoDrop Technologies)方法檢測RNA樣品的質(zhì)量。采用TruSeqTMRNA sample preparation Kit(Illumina,San Diego,CA)試劑盒進(jìn)行RNA文庫的構(gòu)建。使用Ilumina HiSeq xten/NovaSeq 6000測序平臺進(jìn)行高通量測序。

1.3.2.1 差異基因(differential expression analyses,DEGs)表達(dá)

使用軟件RSEM(http://deweylab.github.io/RSEM/)分別定量分析基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。使用DESeq2軟件進(jìn)行差異基因篩選并對原始計(jì)數(shù)(raw counts)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以獲得組間差異表達(dá)基因或轉(zhuǎn)錄本的比較結(jié)果,篩選條件為P<0.05且|log2FC|≥1。

1.3.2.2 GO和KEGG富集

以進(jìn)行差異顯著分析并注釋到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫的基因集為背景基因集,差異顯著分析所得到的DEGs注釋到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫的基因集為差異基因集,利用DESeq2軟件對DEGs進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析。

1.3.3 qRT-PCR檢測差異基因表達(dá)

根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)隨機(jī)選擇DEGs,采用Primer 3程序設(shè)計(jì)引物。PCR條件為95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性5 s,56 ℃退火30 s,共40個循環(huán)。以Actin為內(nèi)參,采用2-△△CT法計(jì)算相對表達(dá)。引物及序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及基因組比對結(jié)果

總體而言,在去除接頭污染、長度不足或質(zhì)量差的序列后,獲得了兩組有效的數(shù)據(jù),超過93.79%的reads的平均質(zhì)量值≥30,6個樣品的GC含量為(40.42±0.02)%(表2)。以上結(jié)果說明,本次測序所得cDNA文庫質(zhì)量高,可以進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)的進(jìn)一步研究。對比其他文獻(xiàn)對于其研究內(nèi)容的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,本研究與其相似之處在于同樣進(jìn)行了Clean reads和Clean bases的統(tǒng)計(jì)比較,不同之處在于其根據(jù)研究內(nèi)容特性對每個樣品總比對數(shù)/率、特異比對數(shù)/率及外顯子比對數(shù)/率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)[10]。而本研究則是對樣品的堿基質(zhì)量百分?jǐn)?shù)和GC含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,能更好突出本次測序文庫質(zhì)量。

表2 C.parapsilosis B7測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)評估Table 2 Evaluation and statistics of sequencing data of C.parapsilosis B7

表3 顯著差異通路及基因分析Table 3 Significant difference pathways and gene analysis

2.2 基因表達(dá)差異分析

使用DESeq2軟件篩選出具有顯著差異表達(dá)的基因(P<0.05,上/下調(diào)差異倍數(shù)為>2.0倍)。采用散點(diǎn)圖和火山圖表現(xiàn)差異基因在兩個樣本間的表達(dá)差異程度。其他文獻(xiàn)采用韋恩圖和火山圖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對照組的基因表達(dá)差異分析,通過韋恩圖展現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對照組基因的相似性[11-13]。如圖1所示,橫坐標(biāo)表示基因的表達(dá)倍數(shù)變化,縱坐標(biāo)表示基因的差異顯著性;紅點(diǎn)表示上調(diào)基因,藍(lán)點(diǎn)表示下調(diào)基因,灰點(diǎn)表示差異不顯著基因。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組中篩選到183個DEGs,其中42個DEGs表達(dá)顯著上調(diào),占總DEGs的22.95%,141個DEGs表達(dá)顯著下調(diào)(圖1)(P<0.05)。結(jié)果表明C.parapsilosisB7在空氣刺激下,基因表達(dá)發(fā)生一定的差異性。從上述結(jié)果中篩選有空氣條件下C.parapsilosisB7形成生物膜相關(guān)表達(dá)差異基因進(jìn)行后續(xù)分析。

a-表達(dá)量差異散點(diǎn)圖;b-表達(dá)量差異火山圖

2.3 DEGs GO富集分析

通過Goatools軟件將DEGs注釋到Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫,得到DEGs可能具有的功能信息,其中GO包括分子功能(molecular function, MF)、細(xì)胞組分(cellular component, CC)和生物過程(biological process, BP)3個維度。如圖2所示,顯著上調(diào)的DEGs在3個維度中富集的顯著性水平較高,在BP類主要富集到蛋白質(zhì)相關(guān)過程(有機(jī)氮化合物生物合成過程、肽生物合成過程、肽代謝過程、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程、細(xì)胞氮化合物生物合成過程)以及酰胺合成、代謝,在CC和MF類主要富集到核糖體相關(guān)部位(胞質(zhì)小核糖體亞單位、核糖體小亞基、核糖核蛋白復(fù)合物、大核糖體亞基、核糖體亞基、胞質(zhì)大核糖體亞基、核糖體的結(jié)構(gòu)成分)。如圖2所示,顯著下調(diào)的DEGs在BP類主要富集到某些糖類酶的活性(葡聚糖外切-1,3-β-葡萄糖苷酶活性、葡聚糖內(nèi)切-1,6-β-葡萄糖苷酶活性、D-阿拉伯糖-1-脫氫酶活性),在CC類主要富集到某些糖類代謝(葡聚糖分解代謝過程、多糖分解代謝過程、細(xì)胞碳水化合物代謝過程)及脂肪酸的合成、代謝。脂肪酸的生物合成原料主要是葡萄糖分解代謝產(chǎn)生的乙酰CoA,且天冬酰胺等參與脂肪酸的生物合成,則酰胺生物合成、細(xì)胞酰胺代謝可能與脂肪酸生物合成相關(guān)。同時核糖體是合成蛋白質(zhì)的場所,它將遺傳密碼轉(zhuǎn)換成氨基酸序列并從氨基酸單體構(gòu)建蛋白質(zhì)聚合物[14-15]。以上結(jié)果表明,空氣刺激會影響核糖體功能和脂肪酸合成及代謝進(jìn)而影響C.parapsilosisB7的生長及代謝,這為差異基因的KEGG富集分析提供思路。

圖2 DEGs GO富集分析Fig.2 GO analysis classification of DEGs

2.4 DEGs KEGG富集分析

為了進(jìn)一步系統(tǒng)地分析差異基因富集到的代謝通路,采用KOBAS(一個用于注釋和識別豐富的路徑和疾病的web服務(wù)器)分析受空氣影響的C.parapsilosisB7對KEGG途徑的富集,采用BH(FDR)方法進(jìn)行多路復(fù)用,并根據(jù)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫將DEGs分配到不同的途徑。如圖3所示,DEGs顯著富集到核糖體途徑,脂肪酸生物合成途徑中(P<0.05),則KEGG富集到的通路與GO富集分析到的功能一致。

圖3 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.3 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes

DEGs在核糖體的通路顯著富集,且富集數(shù)最多,超過差異基因總數(shù)的25%。核糖體是合成蛋白質(zhì)的分子機(jī)器,通過對mRNA的解讀,與攜帶氨基酸的tRNA協(xié)同作用翻譯出一條多肽鏈,多肽鏈再經(jīng)過后期的加工、折疊及轉(zhuǎn)運(yùn)等過程,最后形成有功能的蛋白[14-15]。在菌株進(jìn)行生命活動的每個過程中都有核糖體的參與,本研究中核糖體中的亞基蛋白的調(diào)控基因RPL3/4/5/10/12/15、RPSA/3A/15A、RPS9和RPL7A/10A是顯著上調(diào)的(圖4)。

圖4 核糖體通路Fig.4 The pathway of ribosome

RPL3/4/5/10/12/15、RPSA/3A/15A、RPS9和RPL7A/10A基因注釋到翻譯過程,上述基因的上調(diào)提高了翻譯準(zhǔn)確度,促進(jìn)了翻譯的正向調(diào)節(jié),說明翻譯質(zhì)量和速度將可能會加快。核糖體蛋白SA(ribosomal protein SA, RPSA)是40S核糖體亞基的一個組成部分,在HeLa細(xì)胞中被鑒定為H2O2靶點(diǎn)[16]。核糖體蛋白L4和L22形成大核糖體亞基中肽出口通道的一部分。RPL4蛋白是一種高度保守的核糖體亞基,其對于維持核糖體翻譯效率和保真度至關(guān)重要[17]。RPL10位于氨基酸t(yī)RNAs在調(diào)節(jié)過程中移動的通道附近,并參與tRNA通過該結(jié)構(gòu)的運(yùn)動;RPL10還很好地定位為肽酰轉(zhuǎn)移酶中心附近的活性傳感器,并將該信息傳遞到其他功能中心以協(xié)調(diào)核糖體功能。RPL10環(huán)是核糖體結(jié)構(gòu)和功能的主控制器,影響核糖體組裝和生物發(fā)生的關(guān)鍵步驟以及延伸的蛋白質(zhì)合成階段[18]。生物膜的主要成分是脂質(zhì)和蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)在生物膜的形成中起促進(jìn)作用[9,19]。有空氣條件下,核糖體通路中RPL10、RPSA等基因上調(diào)有利于蛋白質(zhì)的合成,從而有利于生物膜的形成。

另外,DEGs在脂肪酸生物合成途徑中顯著富集。脂肪酸分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸,其中在不飽和脂肪酸合成途徑中FAD2顯著上調(diào)(P<0.05)。FAD2基因編碼對多不飽和脂質(zhì)合成至關(guān)重要的酶,在不飽和脂肪酸的生物合成途徑中起著極其重要的作用[20]。磷脂的組成成分磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺含不飽和脂肪酸較多,而磷脂又是生物膜的重要組成部分[21-22]。細(xì)胞膜上的磷脂主要由磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)和磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine, PC)組成,其中PS、PE和PI位于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè),PC位于膜外側(cè),PS和PE中[22]。因此脂肪酸代謝通路中FAD2是不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵基因,從而有利于形成磷脂,進(jìn)而有利于生物膜的形成。

2.5 DEGs qRT-PCR驗(yàn)證

在KEGG富集分析中,實(shí)驗(yàn)組相對于對照組而言,FAD2上調(diào)(表2),由于FAD2基因編碼對多不飽和脂質(zhì)合成至關(guān)重要的酶[20],則多不飽和脂質(zhì)合成增加。同時核糖體蛋白調(diào)控基因如RPL4、RPL10,RACK1,RPS2等上調(diào)(表2),說明核糖體的作用加劇,促進(jìn)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生[14-15],從而有利于生物膜的形成[19]。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)預(yù)測的準(zhǔn)確性,定量分析了核糖體通路和脂肪酸生物合成通路中的FAD2、RPL4、RPL10的表達(dá)量。其中并沒有選擇甾醇通路中基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,這是因?yàn)樵谶@個通路中基因雖然發(fā)生顯著變化,但其表達(dá)量非常低。如圖5所示,驗(yàn)證結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組相對于對照組,這3個基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致,表明DEGs的結(jié)論是可靠的。

a-FAD2;b-RPL4;c-RPL10

3 結(jié)論

本文通過對泡菜中“生花”酵母菌C.parapsilosisB7進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,分析了有空氣和無空氣條件下C.parapsilosisB7差異表達(dá)基因。研究發(fā)現(xiàn),空氣刺激下C.parapsilosisB7中具有合成蛋白質(zhì)和磷脂功能的基因發(fā)生了變化,對核糖體通路和脂肪酸合成通路具有顯著影響,改變了這兩個通路中的25個基因的上調(diào)/下調(diào)。在核糖體通路中,核糖體蛋白調(diào)控基因RPL4、RPL10、RPSA較為關(guān)鍵,且脂肪酸合成通路中FAD2為關(guān)鍵基因。經(jīng)過qRT-PCR驗(yàn)證,證實(shí)空氣刺激導(dǎo)致RPL4、RPL10、FAD2基因顯著上調(diào)。綜上所述,空氣刺激可通過上調(diào)RPL4、RPL10、FAD2等關(guān)鍵基因的表達(dá),而使核糖體和脂肪酸合成通路上調(diào),進(jìn)而有利于產(chǎn)生蛋白質(zhì)和磷脂,從而導(dǎo)致C.parapsilosisB7“生花”。本研究結(jié)果為C.parapsilosisB7“生花”機(jī)理的深入探索提供依據(jù),同時為泡菜“生花”現(xiàn)象的抑制提供靶向研究方向。