地膚子提取物毒殺螨的蛋白組雙向電泳分析

張利軍，王海香，李生才，李玲，曹揮

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷030801）

山楂葉螨（Tetr anychus viennensis Zacher）屬蛛形綱（Arachnida）螨目（Acarifor mes）葉螨科（Tetranychidae），是我國北方果區(qū)核桃、蘋果、梨、櫻桃、山楂樹的主要害螨，常造成葉片枯焦早落，削弱樹勢，影響產(chǎn)量［1］。目前，對該螨的控制主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重抗性［2］。

植物源殺蟲劑對環(huán)境污染小、害蟲較難產(chǎn)生抗藥性，對有益生物較安全，還有降低害螨迅速產(chǎn)生農(nóng)藥抗性的潛能［3］。已有研究表明，瑞香狼毒、河蒴蕘花、牽牛子、旋覆花、砂地柏、百部、苦艾等的活性成分對成、若螨有較好的防效，有的具有殺卵活性甚至熏殺毒力，部分混用還有增效作用［4～10］。地膚子（Kochia scoparia）是藜科1年生草本植物，俗名掃帚苗、掃帚菜。地膚子提取物有很好的殺螨活性［11］，地膚子提取物處理后，螨體內(nèi)解毒酶和消化酶的含量均有所變化［12］。但地膚子活性成分作用的靶標(biāo)蛋白區(qū)域究竟在哪里，目前尚沒有相關(guān)研究。

蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行體，蛋白質(zhì)組學(xué)在蛋白水平上定量、動態(tài)、整體地研究生物體，闡明生物體全部蛋白的表達模式及功能模式［13］。通過比較正常體與病變體，給藥前后蛋白圖譜的變化，藥物蛋白組學(xué)可提供藥物作用和藥物反應(yīng)的分子機制信息［14］。目前蛋白組研究主要是利用雙向聚丙烯酰 胺 電 泳 （Two－di mensional electr ophoresis，2－DE）來分離復(fù)雜的蛋白組分。近年來，2－DE被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和微生物學(xué)等研究領(lǐng)域［15，16］。在昆蟲學(xué)研究方面，2－DE應(yīng)用于碟蛹金小蜂卵黃蛋白、家蠶雄性附腺及其Ng突變體蛋白質(zhì)、抗性家蠅蛹期蛋白和岡比亞按蚊唾液蛋白［17～20］。在藥物蛋白組學(xué)中，2－DE也為定量和定性評價具有不同表型或基因型的組織細胞之間、正常與病理狀態(tài)、給藥與不給藥時蛋白質(zhì)表達差異提供了可能［21］。多項研究結(jié)果顯示，毒性效應(yīng)可以通過蛋白的方式顯示出來［22，23］。

蛋白組學(xué)研究有害螨報道較少，本文通過2－DE技術(shù)分析給藥與不給藥時山楂葉螨蛋白質(zhì)表達差異，研究藥物靶標(biāo)識別和確認、藥物的行為機理，為開發(fā)利用殺蟲植物地膚子防治山楂葉螨奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

山楂葉螨來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗果園核桃樹上飼養(yǎng)的敏感品系，地膚子氯仿提取物由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供。

1.2 方法

將供試山楂葉螨分對照組和處理組放在不同的培養(yǎng)皿內(nèi)，分別用清水和1 mg·mL－1地膚子提取物噴灑在山楂葉螨體表，5 s后吸凈體表液體，24 h后用液氮快速冷凍并轉(zhuǎn)移到離心管中，稱其重備用。

參照Tal等［24］的方法提取總蛋白，用Bradfor d法測定蛋白質(zhì)濃度，等電聚焦采用膠內(nèi)加樣法，第一向等電聚焦電泳p H 3～10，線性固化IPG干膠條長度17 c m，蛋白加樣量為200μg。SDSPAGE分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%，電泳后凝膠染色銀染色，銀染色采用Yan etal.的方法［25］。圖像掃描后用 PDQuest 2－DE 8.0.1軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照和處理蛋白質(zhì)組圖譜

供試山楂葉螨從培養(yǎng)到雙向電泳各重復(fù)3次，供試藥劑處理山楂葉螨和對照的蛋白雙向電泳銀染圖譜如圖1所示，其Patter n非常相似。對照膠得出蛋白點1139±102個，處理膠得出點1183±106個。這些蛋白點等電點和分子量分布范圍廣，但多數(shù)集中于等電點5.0～9.0之間，分子量20～70 ku的區(qū)域。從對照凝膠中選取一個圖譜做蛋白點匹配實驗，使處理凝膠中蛋白點與對照膠中的對應(yīng)起來，與對照膠中同一蛋白點相匹配的點為同一種蛋白質(zhì)，匹配結(jié)果顯示兩塊膠相匹配的蛋白點為500±45個，對照膠和處理膠平均匹配率分別為43.8%和42.3%。對照的匹配率稍高于處理膠，這與把它選做參考膠有關(guān)。

2.2 對照和處理蛋白組的表達變化

以對照膠作為參照，通過PD－QUEST軟件搜索和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)有262±23個蛋白點在表達量上有顯著變化（P＜0.05），其中142±13個點是2倍上調(diào)的點，另外120±11個點是下調(diào)的點，介于兩者之間的點有237±21個。與對照相比處理蛋白組差異表達譜見圖2。同時322±29個點只在處理膠中，其中蛋白點參數(shù)（等電點和分子量）見表1，蛋白點主要集中區(qū)如圖2中框1所示。表1顯示蛋白分子量主要集中在30～70 ku，等電點集中在pI（5～6）和pI（7.5～9.0）之間。發(fā)生變化的蛋白是中等分子的蛋白，在pI（5～6）區(qū)處理膠明顯增加了一些蛋白。

圖1 供試藥劑對山楂葉螨蛋白影響雙向凝膠電泳圖譜Fig.1 Comparison of 2－DE maps of T.viennensis Zacher treated by agents

圖2 對照和處理疊加的蛋白比較Fig.2 Comparison of 2－DE maps on super position of two gels

表1 藥劑處理凝膠中增加蛋白質(zhì)點的參數(shù)Table 1 The parameter of increased protein spots on the treated gel

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物研究中主要應(yīng)用于受體或標(biāo)志物的鑒定、受體的評價及毒理學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用及其功能的研究、藥物代謝產(chǎn)物的研究等方面［26］。有人運用蛋白質(zhì)組學(xué)2－DE技術(shù)研究過殺蟲劑對有害昆蟲的毒理，如Shar ma等研究了p H3.5～7.0和p H6.0～10.0氨基甲酸酯類殺蟲劑對褐飛虱的毒性機理［27］，他指出被氨基甲酸酯類農(nóng)藥處理后所有的細胞骨架蛋白被引起上調(diào)，而這些蛋白是神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的重要靶標(biāo)之一。本試驗采用地膚子提取物觸殺山楂葉螨，引起其蛋白顯著性變化（P＜0.05），顯著性變化的蛋白有可能是地膚子提取物的靶標(biāo)蛋白。

曹揮等［28］研究表明，地膚子提取物處理后，山楂葉螨體內(nèi)蛋白含量、蛋白酶活性有所升高，谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶和羧酸酯酶被激活，SOD活性顯著增高；乙酰膽堿酯酶、Ca2＋－ATP酶活力受到一定程度的抑制。并推斷地膚子活性成分可能通過抑制山楂葉螨體內(nèi)的酯酶同工酶活性來降低其消化代謝，通過降低單胺氧化酶的活性來降低其解毒代謝，通過抑制乙酰膽堿酯酶活性阻斷其神經(jīng)傳遞，再加上自由基毒害引起螨過度興奮，最終導(dǎo)致螨體的死亡。而本試驗中研究發(fā)現(xiàn)地膚子提取物觸殺螨可引起中等分子量酸性蛋白質(zhì)增加。SWISS－2DPAG數(shù)據(jù)庫顯示乙酰膽堿酯酶的前體的等電點在pI（5.17～5.26）之間［29］，處理膠酸性蛋白的增加恰是在pI（5～6），可能存在乙酰膽堿酯酶受到抑制，其前體不能正常轉(zhuǎn)化，停留在前體狀態(tài)積聚起來，同時引發(fā)了與其相關(guān)的一系列蛋白的錯誤表達。同時，谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的分子量為55 ku，等電點pI（4.5～4.8）作為昆蟲解毒代謝作用和動物組織損傷的敏感指標(biāo)，其升高也可能造成組織內(nèi)蛋白的表達混亂。如果這種假設(shè)正確，恰好和酶活性測定的結(jié)果相吻合，但是這種假設(shè)需要進一步研究驗證。

蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物，它的形成要經(jīng)過基因組的轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯調(diào)控以及翻譯后加工修飾等許多步驟，每個蛋白可產(chǎn)生多種蛋白異構(gòu)體，極大豐富了蛋白質(zhì)的數(shù)量，增加了復(fù)雜性。但是，試驗結(jié)果說明運用蛋白技術(shù)在分子水平研究殺蟲劑的毒性是可能的，部分蛋白的研究將有助于目標(biāo)基因的鑒定和功能的預(yù)測。因此需要進一步采用其他方法或手段深入地研究鑒定這些蛋白，并了解它們的功能。

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