丹參內生細菌的抑菌活性研究

代躍廳，韓巨才，劉慧平

（山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷030801）

植物病害是農業(yè)生產的大敵，使糧食產量遭受了嚴重的損失，據聯(lián)合國糧農組織（FAO）統(tǒng)計，每年因植物病害造成的平均損失為總產量的10%～15%［1］。其中80%以上的植物病害則是由真菌引起的。真菌病害是阻礙植物生長、影響作物產量的主要因素［2］，控制真菌病害對于提高農作物產量極為重要。長期以來植物病害主要以化學藥劑來防治，一方面容易造成病原菌抗藥性的產生，增加防治成本，另一方面容易給環(huán)境造成污染。因此，符合環(huán)保、健康、持續(xù)發(fā)展理念的高效、低毒、低殘留、與環(huán)境相容的農藥的開發(fā)就成為當今農藥研究的主題。植物內生細菌是一個多樣性十分豐富的生物類群，在植物內生細菌中，有的是對植物病原菌產生拮抗而保護植物免受病原菌侵害的衛(wèi)士，有的可能對植物某些活性成分的形成具有重要的作用，有的可能產生與寄主植物類似的活性成分，并且具有對人、畜、農作物和環(huán)境安全等特點。因此，利用生防細菌防治植物病害的這一系列優(yōu)點，已經成為國內外學者研究的重要方向［3，4］。許多拮抗細菌能產生對真菌病害起到抑制作用的次生代謝產物，已成為新的微生物源農藥［5］，并顯示出良好的應用前景［6，7］。微生物農藥是利用微生物或其代謝產物來防治農作物的病、蟲、草、鼠害及促進作物生長的一類農藥。植物內生細菌與寄主植物在長期共同進化過程中形成了密切的相互關系，是植物微生物生態(tài)系統(tǒng)的主要成員，對寄主植物有促生、防病、內生聯(lián)合固氮等廣泛的生物學作用，是植物病害生物防治、內生聯(lián)合固氮菌篩選、誘導抗病性及轉基因載體等功能的天然菌源，具有較高的理論研究價值和實際應用價值，已成為微生物學、植物病理學植物學等多個學科的研究熱點［8～10］。

丹參作為中國的傳統(tǒng)中藥，在臨床上可用于治療心腦血管疾病、高血脂、急性缺血性中風、月經失調和抗炎等。最新研究表明，丹參還有保肝、抗腫瘤及抗氧化活性［11～14］。近年來，關于藥物植物內生菌的多樣性和次生代謝成分的研究日益增多，但對丹參內生細菌的研究卻很少。

作者從丹參植物葉片中分離得到一株內生細菌DS－1，為了了解其抑菌活性，對該菌株及其發(fā)酵源液的抑菌活性進行了初步研究。將為生防細菌的研究和開發(fā)利用提供有力的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株

梨黑斑病菌（Alter naria alter nata）、番茄早疫病菌（Alter naria sol ani）、小麥赤霉病菌（Fusarium gr aminear um）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium osysporumf.sp.cucu merinum）、棉花立枯病菌（Rhizoctonia sol ani）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、豆角菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、西瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbicul are）、內生細菌DS－1

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)液，PDA 培養(yǎng)基［15］。

1.2 試驗方法

菌株的抑菌效果采用平板對峙的方法：在無菌操作條件下，倒入PDA平板，冷卻。在PDA平板中間接種直徑5 mm的病原菌，在距離病原菌兩側各1.5 c m處接種內生細菌，3組重復，以只接種病原菌為對照，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測定病原菌的菌落半徑，計算抑菌率。

內生細菌發(fā)酵液活性測定采用生長速率法。將內生菌DS－1接種于LB培養(yǎng)液中，在30℃，180 r·min－1振蕩培養(yǎng)72 h，8000 r·min－1離心10 min后取出菌體獲得發(fā)酵液，一部分用0.22μm微孔濾膜過濾滅菌，一部分經過高溫滅菌。按發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基1：9的比例混合制備平板，接入直徑為5 mm的病原菌，以無菌水為對照，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后測定菌落直徑，計算抑菌率。

2 結果與分析

2.1 對峙試驗結果

DS－1對8種病原菌的抑菌效果見表1。由表1可知，DS－1對這幾種病原菌都有較好的抑制效果。其中DS－1對梨黑斑的抑菌效果最好達到90.57%，對其他病原菌的抑菌效果也達到了70%以上，效果顯著。

表1 DS－1對8種病原菌的抑制率Table 1 The inhibition rate of DS－1 to 8 pathogens

2.2 DS－1代謝物的抑菌效果

內生細菌DS－1發(fā)酵液分別進行高溫過濾處理后，濾液對病菌的抑制作用見表2。經過濾處理的發(fā)酵液對8種病原菌都有一定的抑制效果，其中對梨黑斑菌最好，達到83.87%。而經過高溫處理的代謝物對病原菌的抑制效果出現(xiàn)了明顯減弱，表明菌株產生的代謝物中主要是對高溫敏感的一些蛋白類物質。

3 討論與結論

在丹參葉片中分離到的這株DS－1細菌對梨黑斑病菌、番茄早疫病菌、小麥赤霉病菌等8種病原真菌均出現(xiàn)不同程度的抑制作用，總體上抑制作用表現(xiàn)較強，抑制率均超過了70%。在對其發(fā)酵液的研究中，發(fā)酵液經過濾膜過濾處理后仍對8種病原菌有較好的抑制率，但不如DS－1細菌的抑制效果，推測內生細菌產生的抑菌活性物質可能部分存在于菌絲體內，需要進一步對菌絲體進行研究；高溫高壓處理的發(fā)酵液對病原菌的抑制率卻明顯下降，這表明DS－1產生的代謝產物對高溫敏感，推測有可能是蛋白類物質，它們往往對高溫是極其敏感的。鑒于以上對DS－1的初步研究，DS－1是一株有生防潛力的內生細菌，應對其進行深入研究。

為了對DS－1進行深入的研究，有待對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化以及對其代謝產物的成分進行分析研究，并對DS－1進行鑒定，為以后工業(yè)化生產提供理論依據。

表2 DS－1代謝物的抑菌效果Table 2 The antibacterial effect of DS－1

［1］劉志俊，段渝峰.生物農藥新概念新發(fā)展［J］.農藥科學與管理，2003，24（7）：28－32.

［2］易自力，周樸華，朱雅安.植物抗真菌病害基因工程研究進展［J］.作物研究，2001（3）：81－84.

［3］肖愛萍，李庚花，游春萍，等.5株拮抗細菌對香蕉枯萎病菌的抑制作用［J］.江西農業(yè)大學學報，2005，27（4）：572－575.

［4］馬紅娟，楊秀娟，阮宏椿，等.拮抗細菌對香蕉枯萎病菌的離體抑菌活性研究［J］.福建農業(yè)學報，2008，23（3）：251－254.

［5］Li Q Q，Luo K，Lin W，etal.Isolation of to mato endophytic antagonists againts Ralstonia sol anacear u m（in Chinese）［J］.Acat Phytopat hologica Sinica，2003，33（4）：364－367.

［6］司美茹，薛泉宏，余博，等.36株生防菌對辣椒疫病等4種病原真菌的拮抗作用研究［J］.西北農林科技大學學報（自然科學版），2005，33（1）：49－53.

［7］張琴芳，代光輝，顧振芳，等.非致病性鐮刀菌Fusariu m oxyspor u m菌株47（FO47）對番茄枯萎病的防治效果［J］.上海交通大學學報（農業(yè)科學版），2004，22（1）：17－21.

［8］孔慶科，丁愛云.內生細菌作為生防因子的研究進展［J］.山東農業(yè)大學學報（自然科學版），2001，32（2）：256－260.

［9］楊海蓮，孫曉璐，宋未.植物內生細菌的研究［J］.微生物學通報，1998，25（4）：224－226.

［10］楊海蓮，孫曉璐，宋未，等.植物根際促生細菌和內生細菌的誘導抗病性的研究進展［J］.植物病理學報，2000，30（2）：106－109.

［11］Wu J Y，Ng J，Shi M，Wu S J.Enhanced secondar y metabolite（tanshinone）production of Salvia miltiorr hiza hairy r oots in a novel rootbacteria coculture process［J］.Applied Micr obiology and Biotechnology，2007，77（3）：543－550.

［12］Wang J W，Wu J Y.Tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorr hiza and production in plant tissue cultures［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2010，88（2）：437－449.

［13］王研，溫新寶，秦翠萍，等.丹參提取物體外抗氧化活性研究［J］.西北農業(yè)學報，2011，20（11）：160－163.

［14］張逸，褚會娟，張今今.秦巴山區(qū)丹參居群遺傳與表觀遺傳多樣性比較［J］.西北農業(yè)學報.2012，21（10）：142－148.

［15］戴水蓮，林警，高麗，等.PDA培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素的抗菌作用試驗簡報［J］.中國食用菌，2007，26（4）：53－54.