重組荔枝類甜蛋白的高效表達(dá)、純化及活性鑒定

曹琳彩,文舜華,王凱,劉旭煒,胡卓炎,趙雷,沈興

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,廣東 廣州,510642)

荔枝(LitchichinensisSonn.)在世界各地的溫暖氣候地區(qū)廣泛栽培[1],其果肉中含有多種營養(yǎng)成分,如多酚、多糖等,據(jù)報(bào)道對肝、心、脾等有諸多益處[2],然而部分人群一次大量食用荔枝果肉會(huì)導(dǎo)致“上火”等不良反應(yīng)[3]?！吧匣稹笔窃从谥嗅t(yī)學(xué)的一種概念,表現(xiàn)為局部發(fā)紅、發(fā)熱、疼痛,類似炎癥或炎癥性疾病[4]。這種食物不良反應(yīng)對荔枝市場發(fā)展產(chǎn)生了影響。研究表明導(dǎo)致“上火”的食物含有促進(jìn)炎癥的成分,如HUANG等[5]將荔枝定義為“熱性食物”并發(fā)現(xiàn)荔枝的水提取物增加了小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中抗炎介質(zhì)前列腺素E2(PGE2)的分泌與環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2)的表達(dá),WANG等[6]使用RAW264.7細(xì)胞對荔枝中的水溶性成分進(jìn)行了篩選,明確了荔枝中水溶性蛋白可以增加RAW264.7細(xì)胞系中促炎介質(zhì)如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、COX-2、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)以及抗炎介質(zhì)血紅素加氧酶(heme oxygenase,HO-1)的產(chǎn)生。由此可見,荔枝中水溶性蛋白質(zhì)是導(dǎo)致荔枝炎癥性“上火”的主要原因。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),利用荔枝中分離純化得到的類甜蛋白(litchi thaumatin-like protein,LcTLP)刺激RAW264.7細(xì)胞,會(huì)顯著提高iNOS和COX-2的基因表達(dá)量以及炎癥因子分泌量[7],繼而推測LcTLP是食用荔枝引起炎癥反應(yīng)的主要原因,但目前LcTLP分子晶體結(jié)構(gòu)的解析以及其在細(xì)胞生命活動(dòng)中的功能機(jī)制等還沒有深入的研究,因此大量的高純度的活性LcTLP獲取是急待解決的前提。

LcTLP可從新鮮果實(shí)中提取制備,但其產(chǎn)量低、周期長且純度不高[7],而重組表達(dá)則提供了更優(yōu)的解決方案。有研究對TLP家族中的其他來源進(jìn)行了異源表達(dá)實(shí)驗(yàn),但仍然沒有一個(gè)高效的方案,如MERVAT 等[8]通過使用載體pET-28a(+)在大腸桿菌中表達(dá)番茄TLP(NP24),證明該基因在大腸桿菌中作為包涵體過度表達(dá)。此外,余宇等[9]對小麥TLP構(gòu)建的TLP-pET-32a載體在表達(dá)菌株BL21(DE3)中也為包涵體表達(dá)。因此,為避免LcTLP的原核表達(dá)形成包涵體,本研究采用融合標(biāo)簽技術(shù)為大量表達(dá)可溶性LcTLP提供了解決途徑。NusA標(biāo)簽(N-utilization substance A tag)能夠提高E.coli表達(dá)重組蛋白的溶解度和穩(wěn)定性,如ZACHARCHENKO等[10]使用NusA標(biāo)簽對人類蛋白磷酸酶1進(jìn)行了高效的可溶表達(dá)。此外,適宜的純化策略也是獲得高純度、有活性的重組蛋白的必要前提。因此本研究采用融合NusA標(biāo)簽和多組氨酸標(biāo)簽(His6-tag)構(gòu)建了重組LcTLP表達(dá)載體,對表達(dá)菌株進(jìn)行了優(yōu)化。此外,還建立了兩步法純化方案,對純化后的蛋白進(jìn)行細(xì)胞炎癥活性實(shí)驗(yàn),為后續(xù)研究LcTLP在細(xì)胞生命活動(dòng)中的功能機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原核表達(dá)載體pCold-NusA-thrombin site、克隆菌株E.coliDH5α,廣州艾迪生物科技有限公司;小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7,中國科學(xué)院細(xì)胞庫;TIAN prep Mini Plasmid Kit、表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)C43、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,天根生化科技有限公司;BamH I、Hind Ⅲ內(nèi)切酶、Fast Digest限制性內(nèi)切酶,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司;AGE預(yù)混膠試劑盒,英國gene fist公司;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、咪唑、溶菌酶、蛋白酶抑制劑100X、NO試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker、DNA連接試劑盒,德國Takara公司;全能核酸酶,翌圣生物科技(上海)股份有限公司;胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉,英國Oxoid公司;100%Triton,Sigma公司;凝血酶,北京索萊寶科技有限公司;MTT細(xì)胞毒性試劑盒,南京建成生物工程研究所;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

PCR儀、Nano Drop 2000/2000C分光光度計(jì),美國賽默飛公司;恒溫培養(yǎng)箱,日本三洋公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器,常州榮華儀器制造有限公司;光柵型酶標(biāo)儀,美谷分子儀器有限公司;高速大容量離心機(jī),美國貝克曼庫爾特公司;蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(AKTA start)、His trap FF、Hiload 16/600 superdex 75pg、超濾濃縮離心管,美國思拓凡公司;垂直電泳裝置、全能型成像系統(tǒng),美國伯樂公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

使用云舟生物在線網(wǎng)站對LcTLP基因(GenBank登錄號JF682821)進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化后,合成并插入pCold-NusA-thrombin site表達(dá)載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,將菌液涂于氨芐平板上,在37 ℃下培養(yǎng)12 h,挑取單克隆菌落接入含100 μg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中,以220 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩,37 ℃培養(yǎng)14 h后提取質(zhì)粒,經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCold-NusA-LcTLP。

1.2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

分別取1 μL pCold-NusA-LcTLP質(zhì)粒加入至BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)C43、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。采用熱激法進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,冰上孵育30 min,42 ℃熱激45 s,在冰上孵育3 min。接著加入950 μL預(yù)熱的LB培養(yǎng)基,37 ℃搖床孵育60 min。孵育結(jié)束后離心去除上清液重懸涂板。將菌液涂布在相應(yīng)抗性的LB平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h。挑取單菌落至LB抗性培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。加入1%(體積分?jǐn)?shù))擴(kuò)增菌液于TB抗性培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)3 h后加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)至0.1 mmol/L,以未添加IPTG作為對照組,15 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)20 h后終止。收集菌液進(jìn)行離心,棄上清液,重懸于4×裂解緩沖液(0.3 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris pH 8.0、10%(體積分?jǐn)?shù))甘油、0.5%(體積分?jǐn)?shù))Triton、1 mmol/L 3,5-二硝基水楊酸、1 mg/mL溶菌酶、1×蛋白酶抑制劑100X、2 mmol/L EDTA),于液氮和37 ℃水浴中反復(fù)凍融3次后,置于37 ℃、200 r/min恒溫振蕩30 min。然后加入5 mmol/L MgCl2溶液和25 U/mL全能核酸酶,4 ℃反應(yīng)30 min后10 000 r/min離心30 min,取上清液過0.45 μm濾膜,進(jìn)行后續(xù)純化步驟。將收集的細(xì)菌裂解液上清液與誘導(dǎo)前對照組裂解液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.3 重組LcTLP的純化

1.2.3.1 親和層析純化與酶切

采用5 mL His Trap FF鎳親和柱進(jìn)行第一步純化。首先用緩沖液A[0.5 mol/L NaCl溶液、20 mmol/L Tris pH 8.0、10%(體積分?jǐn)?shù))甘油、0.5%(體積分?jǐn)?shù))Triton]平衡3～5個(gè)柱體積后進(jìn)行上樣,設(shè)定3 mL/管進(jìn)行收集。上樣結(jié)束后,以10%(體積分?jǐn)?shù))緩沖液B(緩沖液A的基礎(chǔ)上增加40 mmol/L咪唑)對柱子上結(jié)合的雜蛋白進(jìn)行洗脫,然后提高咪唑濃度至200 mmol/L對目的蛋白進(jìn)行洗脫。將相應(yīng)的洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE檢測,收集目的蛋白溶液用NanoDrop測定其濃度,每1 mg蛋白樣品中加入0.3 U凝血酶,37 ℃水浴反應(yīng)2.5 h以切除NusA標(biāo)簽。

1.2.3.2 凝膠過濾層析純化

采用Superdex75凝膠柱進(jìn)行第二步純化。首先用緩沖液(150 mmol/L NaCl溶液、20 mmol/L Tris pH 8.0)平衡1個(gè)柱體積,然后將上一步純化得到的蛋白溶液用30 kDa V型超濾濃縮管濃縮至5 mL進(jìn)行上樣,設(shè)定3 mL/管進(jìn)行收集,繼續(xù)運(yùn)行1.2個(gè)柱體積后結(jié)束程序,將收集到的洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE檢測,選取符合目的蛋白大小的洗脫峰留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Western blot檢測

參照WANG等[11]報(bào)道的方法并略作修改。取純化后重組LcTLP經(jīng)SDS-PAGE后,以200 A恒壓電流轉(zhuǎn)移55 min至0.22 μm PVDF膜上,再將膜放入含50 g/L脫脂奶的TBST(Tris buffered saline with Tween-20)中,室溫封閉1 h。加入1∶3 000(體積比)鼠抗His6標(biāo)簽單克隆抗體,4 ℃過夜后用TBST洗膜3次,再加入1∶5 000(體積比)的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗,室溫反應(yīng)1 h,用TBST洗膜3次,最后加入超敏發(fā)光液,在凝膠成像系統(tǒng)成像,檢測目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 重組LcTLP產(chǎn)量與純度測定

重組LcTLP的純度使用Image Lab軟件進(jìn)行分析[12]。取每1 L培養(yǎng)基中提取過程中裂解上清液中的總蛋白、NusA-thrombin-LcTLP、重組LcTLP的濃度根據(jù)BCA試劑盒的方法檢測并根據(jù)濃度與該提取步驟的體積進(jìn)行換算得到蛋白質(zhì)總量。將BCA試劑A與試劑B按50∶1(體積比)比例混合均勻,制成BCA工作液。25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液用10 mmol/L K3PO4緩沖液分別稀釋質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品,同時(shí)樣品組稀釋多種不同的濃度。在標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中加入200 μL的BCA工作液,37 ℃孵育30 min,使用酶標(biāo)儀測定562 nm處的吸光度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.631 2x+0.185 9計(jì)算樣品蛋白的濃度。

1.2.6 重組LcTLP的生物活性鑒定

1.2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)與模型建立

將小鼠RAW264.7細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素雙抗液(均為體積分?jǐn)?shù))的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2),取對數(shù)生長期細(xì)胞用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)?？瞻讓φ战M加入等體積的培養(yǎng)基,陽性對照組加入1 μg/mL的LPS,樣品組分別加入用培養(yǎng)基稀釋為1、2 μg/mL質(zhì)量濃度的重組LcTLP。

1.2.6.2 細(xì)胞存活率的測定

細(xì)胞存活率測定參照劉素貞等[13]的方法。取對數(shù)生長期細(xì)胞,以1×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h使細(xì)胞完全貼壁,移去培養(yǎng)基后分別加入1 μg/mL質(zhì)量濃度的LPS、1 μg/mL和2 μg/mL重組LcTLP進(jìn)行對比。刺激細(xì)胞24 h后,移去細(xì)胞培養(yǎng)板上的溶液,在遮光條件下,向各孔中加入含CCK-8的培養(yǎng)液200 μL,在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h后,使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各孔吸光值。

1.2.6.3 細(xì)胞NO分泌量的測定

取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,分別用1 μg/mL的LPS,1 μg/mL和2 μg/mL重組LcTLP培養(yǎng)24 h后,取上清液使用試劑盒測定NO的分泌量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在SPSS軟件上使用單因素方法分析對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,P<0.05表示具有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,使用Origin 2018軟件進(jìn)行圖片繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcTLP表達(dá)載體構(gòu)建與密碼子優(yōu)化

不同生物體的密碼子使用方式存在的差異會(huì)影響到異源表達(dá)系統(tǒng)中目標(biāo)基因的表達(dá)水平。密碼子優(yōu)化是通過克服與密碼子使用和轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)豐度的物種特異性差異相關(guān)的限制來提高翻譯率,增強(qiáng)蛋白表達(dá)與穩(wěn)定性[14]。有效密碼子數(shù)(effective number of codons,ENC)是評價(jià)基因整體密碼子偏好性中最有參考價(jià)值的參數(shù)之一。ENC值描述的是某個(gè)基因的密碼子偏好程度,ENC值越低,說明密碼子使用偏好性越強(qiáng)[15]。以GenBank公布的LcTLP基因?yàn)槟０?進(jìn)行密碼子優(yōu)化,前后對比如圖1-a所示。通過EMBOSS在線網(wǎng)站對密碼子優(yōu)化前后ENC值和GC含量進(jìn)行評估,優(yōu)化前后的ENC值分別是52.56和47.15,GC含量無明顯變化,分別為48.66%和50.67%,說明優(yōu)化后的密碼子更利于LcTLP在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。將優(yōu)化后的LcTLP基因序列直接合成并插入載體pCold-NusA-thrombin site中,轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)中得到轉(zhuǎn)化子,通過擴(kuò)大培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒,質(zhì)粒圖譜見圖1-b。該質(zhì)粒中,NusA標(biāo)簽基因與LcTLP基因之間含凝血酶酶切位點(diǎn),LcTLP基因另一端則含有His6標(biāo)簽基因序列,經(jīng)測序后表明該載體構(gòu)建成功。

a-序列對比圖;b-質(zhì)粒圖譜

2.2 重組蛋白NusA-LcTLP的表達(dá)優(yōu)化

本研究中初步采用了3種不同的菌株對重組蛋白NusA-LcTLP進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果如圖2-a所示,可以看出3種菌株表達(dá)的重組蛋白含量均不高,但BL21(DE3)pLysS菌株表達(dá)裂解后的背景更為干凈,雜蛋白比例低。BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)C43和BL21(DE3) 3種不同的大腸桿菌宿主細(xì)菌在使用T7啟動(dòng)子時(shí)具有不同的蛋白質(zhì)表達(dá)水平[16-18]。其中,BL21(DE3)pLysS菌株含有T7溶菌酶的基因,該基因作用于大腸桿菌細(xì)胞壁中的肽聚糖以溶解細(xì)菌,減少目標(biāo)基因的背景表達(dá)卻不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá),使其更適合表達(dá)有毒蛋白[19]。相比其他2種基因型的菌株,該基因型菌株對降低目的基因的表達(dá)背景水平效果最好,有利于簡化后續(xù)純化蛋白的步驟,提高蛋白純度,因此選用BL21(DE3)pLysS菌株作為表達(dá)菌株進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化。圖2-b為優(yōu)化后的表達(dá)效果,可以看出裂解菌體離心后的上清液在80 kDa左右有明顯的NusA-LcTLP特征蛋白條帶出現(xiàn),其中NusA分子質(zhì)量為54.87 kDa。His6標(biāo)簽分子質(zhì)量為0.81 kDa,LcTLP含223個(gè)氨基酸殘基,分子質(zhì)量約為24 kDa,因此NusA-LcTLP理論分子質(zhì)量約為80 kDa。作為對照的未誘導(dǎo)重組菌體中無該蛋白條帶,說明成功表達(dá)得到了NusA-LcTLP重組蛋白。

2.3 NusA-LcTLP親和層析純化結(jié)果

由于目的蛋白NusA-LcTLP帶有His6標(biāo)簽,首先采用Ni-NTA進(jìn)行親和層析純化。收集不同咪唑濃度緩沖液洗脫得到的組分,進(jìn)行SDS-PAGE檢測(圖3)。結(jié)果顯示,在使用不含咪唑的緩沖液A以及含40 mmol/L咪唑的洗脫液沖柱時(shí),洗脫液中僅含少量目的蛋白,而使用含200 mmol/L的咪唑洗脫時(shí)可得到較純的NusA-TLP,表明通過此方法可以較有效地初步分離NusA-LcTLP。收集200 mmol/L咪唑洗脫得到的目的蛋白進(jìn)行后續(xù)酶切實(shí)驗(yàn)將NusA標(biāo)簽與重組LcTLP分離。

圖3 NusA-LcTLP親和純化產(chǎn)物SDS-PAGE圖Fig.3 NusA-TLP affinity purification product SDS-PAGE analysis

2.4 NusA-LcTLP酶切與Western blot驗(yàn)證

采用凝血酶對NusA標(biāo)簽與重組蛋白進(jìn)行切割分離,從圖4-a可以看出,酶切后NusA-LcTLP中的NusA標(biāo)簽和重組LcTLP被成功切割分開,電泳中出現(xiàn)2條相應(yīng)大小的條帶。重組LcTLP在SDS-PAGE結(jié)果中出現(xiàn)在29 kDa附近,略高于計(jì)算分子質(zhì)量24 kDa。原因可能是由于His6標(biāo)簽中包含多個(gè)帶正電荷的組氨酸,因此目標(biāo)蛋白的電荷狀態(tài)發(fā)生了改變,進(jìn)而影響了它在SDS-PAGE中的表現(xiàn),使其分子質(zhì)量的測量結(jié)果偏大[20]。圖4-b Western blot結(jié)果顯示,酶切前免疫印跡最深處于80 kDa處,酶切后該位置的免疫印跡消失,24 kDa處出現(xiàn)了較深的免疫印跡,可以說明酶切成功。

a-SDS-PAGE圖;b-Western blot圖

2.5 凝膠過濾層析分離重組LcTLP

通過圖5可以看到,酶切產(chǎn)物經(jīng)過凝膠過濾層析純化后得到2個(gè)洗脫峰,將不同的洗脫峰收集起來進(jìn)行SDS-PAGE檢測。2個(gè)洗脫峰分別對應(yīng)為泳道1為NusA標(biāo)簽,泳道2為重組LcTLP。說明NusA標(biāo)簽與重組LcTLP兩個(gè)蛋白可以很好地分離。電泳結(jié)果顯示,純化后的重組LcTLP條帶單一,經(jīng)Image Lab軟件分析顯示純度達(dá)90%。

a-凝膠過濾層析分離酶切產(chǎn)物峰圖;b-SDS-PAGE圖

2.6 BCA法測定蛋白濃度與產(chǎn)量

如表1所示,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,每1L TB培養(yǎng)基中濕菌體裂解后離心上清液所得總蛋白含量為2 711.03 mg,經(jīng)第1次純化后可得NusA-LcTLP 286.95 mg。通過酶切與凝膠過濾層析純化之后重組LcTLP總得量為36.26 mg。在CHEN等[7]的研究中,從100 g新鮮荔枝果肉中分離出果肉蛋白后經(jīng)丙酮沉淀和PBS提取,使用不同飽和度的(NH4)2SO4沉淀進(jìn)一步透析與凍干收集,可得純度為70%的4.5 mg LcTLP。與此相比,重組LcTLP的純度遠(yuǎn)高于化學(xué)法提取的LcTLP。而FUCHS等[21]經(jīng)過多重化學(xué)純化在120.2 kg成熟櫻桃中獲得約1 mg高度純化的櫻桃TLP(nPru av 5),但發(fā)現(xiàn)此法提取的nPru av 5上存在碳水化合物部分,因此該提取方法也無法運(yùn)用于蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析的實(shí)驗(yàn)中。FUCHS等[21]還對nPru av 5進(jìn)行原核表達(dá)發(fā)現(xiàn)為包涵體表達(dá),經(jīng)變性純化后得重組nPru av 5產(chǎn)量為0.7 mg/L培養(yǎng)基。除nPru av 5外,多種TLP在原核表達(dá)中形成包涵體被報(bào)道,如番茄TLP[8]、小麥TLP[9]和百合TLP[22]等。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過助溶標(biāo)簽載體的構(gòu)建、密碼子和表達(dá)菌株的優(yōu)化得到了重組LcTLP 36.26 mg/L培養(yǎng)基,實(shí)現(xiàn)了重組LcTLP在原核系統(tǒng)的高效可溶性表達(dá),并成功建立了一種高純度的制備方法。

表1 BCA法測定蛋白濃度與產(chǎn)量Table 1 Determination of protein concentration and total amount by BCA method

2.7 重組LcTLP的生物活性鑒定

圖6顯示了不同濃度的LPS、重組LcTLP對RAW264.7細(xì)胞存活率和NO分泌水平的影響。由圖6-a可知3組樣品的細(xì)胞存活率均在100%以上,說明1 μg/mL LPS、1 μg/mL和2 μg/mL重組LcTLP對RAW264.7細(xì)胞均無毒害作用且有一定的促進(jìn)細(xì)胞生長的效果,該劑量可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

a-細(xì)胞存活率;b-NO分泌量

RAW264.7細(xì)胞來自小鼠巨噬細(xì)胞系,它們在控制免疫反應(yīng)和炎癥方面發(fā)揮著重要作用。NO是炎癥過程中的重要信號分子[23],在機(jī)體內(nèi)通常存在正常水平的NO,當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活時(shí),它們會(huì)釋放高水平的NO并激活 NF-κB信號通路,從而導(dǎo)致促炎因子的分泌并引發(fā)炎癥反應(yīng),因此NO含量可用作炎癥水平的衡量[24]。由圖6-b可知,NO的分泌量隨著重組LcTLP的濃度升高均呈現(xiàn)劑量依賴性增加,陽性對照LPS組含量為19.74 μmol/L,與空白組有顯著差異,可以說明細(xì)胞炎癥造模成功。在1～2 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),重組LcTLP的NO分泌量分別為12.75和14.68 μmol/L,是空白組的2.91倍和3.36倍,以上組分都顯著提高了細(xì)胞NO的分泌。在WANG等[25]的研究中,10 ng/mL LPS和荔枝果實(shí)中天然提取的LcTLP刺激RAW264.7細(xì)胞NO分泌量約分別為50和30 μmol/L,約為空白組的10和6倍?？梢哉f明與天然提取LcTLP一樣,重組LcTLP具有增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的效果,具有一定的促炎活性,為后續(xù)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本研究通過密碼子優(yōu)化、構(gòu)建含助溶標(biāo)簽NusA標(biāo)簽和用于親和層析的His6標(biāo)簽原核表達(dá)載體、表達(dá)菌株優(yōu)化,建立了一種高效表達(dá)可溶性重組LcTLP的方法。經(jīng)原核表達(dá)的結(jié)果分析最合適的表達(dá)菌株為BL21(DE3)pLysS。使用親和層析技術(shù)、酶切技術(shù)和凝膠色譜層析技術(shù)對原核表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化,經(jīng)蛋白電泳與免疫印跡鑒定,證明成功高效表達(dá)并純化得到可溶性重組LcTLP,其產(chǎn)量為36.26 mg/L,純度達(dá)90%以上。此外,RAW264.7細(xì)胞炎癥活性驗(yàn)證表明,經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)純化的LcTLP對RAW264.7細(xì)胞無毒害作用且能夠促進(jìn)RAW264.7中NO的分泌量并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,說明了重組LcTLP導(dǎo)致巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。證實(shí)了重組LcTLP具有一定的生物活性,可為后續(xù)蛋白結(jié)構(gòu)解析與功能研究奠定基礎(chǔ)。