銅藻多酚的提取工藝及其穩(wěn)定性和抑制酪氨酸酶活性

何裊裊，蔡樹蕓，閻光宇，楊婷，陳偉珠，，洪專，，張怡，張怡評，*

（1.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建廈門 361005；2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州 350001；3.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學院海洋生物學院，福建廈門 361100）

銅藻又名柱囊馬尾藻、海柳麥、玉海藻等[1]。鮮銅藻藻體為黃褐色，質(zhì)地脆嫩，氣味腥臭，味咸淡，屬于暖溫帶性海藻，主產(chǎn)于浙江、廣東、福建等地。銅藻資源非常豐富，在每年的4～5 月份銅藻大量繁殖，生物量為35.81～1 568.44 g/m2，不充分的利用會導致資源浪費和金潮等環(huán)境問題[2]。據(jù)了解，銅藻中含有豐富的多酚[3]、褐藻膠[4]、褐藻多糖、巖藻黃質(zhì)[5]等活性成分，還含有豐富的礦物質(zhì)和多種人體必需氨基酸[6]。銅藻多酚是銅藻中一類重要的活性成分，具有抗氧化[7]、清除金屬離子[8]、抗腫瘤[9-10]、降血糖血脂[11-12]等多種生物活性，在保健食品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景，經(jīng)濟價值很高。但是目前對銅藻多酚提取技術(shù)的研究還很少，多酚的傳統(tǒng)提取方法為浸提法和熱回流提取法[13-15]，與傳統(tǒng)提取方法比較，采用超聲波輔助提取，提取時間縮短，溶劑用量減少，可以明顯提高銅藻多酚的提取效率。

目前銅藻多酚提取工藝的研究大多數(shù)采用干銅藻為原料，在烘干過程中損失了部分多酚。本試驗以新鮮銅藻為原材料，通過超聲波輔助提取法對銅藻多酚進行提取，從而提高多酚的提取量及提取率[16]。本試驗以銅藻多酚提取率作為指標，考察乙醇體積分數(shù)、超聲時間和液料比3 個因素對銅藻多酚提取率的影響[17]，開展銅藻多酚提取工藝的單因素及響應(yīng)面優(yōu)化試驗，探討光照、溫度和pH 值3 個因素對銅藻多酚穩(wěn)定性的影響規(guī)律，同時研究銅藻多酚對酪氨酸酶活性的抑制作用，旨在為銅藻資源開發(fā)和利用提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

福建泉州海域采集的新鮮銅藻，經(jīng)王初生研究員（自然資源部第三海洋研究所）鑒定為銅藻（Sargassum horneri）。乙醇（≥95%）：安徽安特食品股份有限公司；福林酚、碳酸鈉（純度均≥99%）：國藥集團化學試劑有限公司；焦性沒食子酸（≥99%）：西隴科學股份有限公司；左旋多巴、左旋酪氨酸、酪氨酸酶（33 U/mL）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

KQ-500E 超聲清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；UH5300 紫外-可見分光光度計：日本島津公司；Hei-VAP ExpertValue G3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph 公司；HH-ZK 水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責任公司；infinite F50 酶標儀：瑞士TECAN 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制作及銅藻多酚含量的測定

1.2.1.1 沒食子酸標準曲線繪制

精密稱量焦性沒食子酸12.71 mg，用蒸餾水溶解并定容至10 mL。取0.5 mL 的沒食子酸儲備液，用去離子水稀釋、定容至100 mL。在1.25 mL 的福林酚試劑中加入適量的沒食子酸溶液，反應(yīng)3 min；而后加入4 mL 0.1 g/mL 碳酸鈉溶液，用去離子水定容至10 mL，在30 ℃的恒溫水箱中避光30 min，然后用紫外-可見分光光度計測定760 nm 處的吸光度。

1.2.1.2 銅藻多酚含量測定

采用福林酚法檢測銅藻中多酚的含量。取適量銅藻多酚待測液，加入1.25 mL 福林酚試劑反應(yīng)3 min，加入4 mL 0.1 g/mL 碳酸鈉溶液，去離子水定容至10 mL。在30 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)避光反應(yīng)30 min，然后用紫外-可見分光光度計測定760 nm 處的吸光度。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 乙醇體積分數(shù)對銅藻多酚提取率的影響

稱取1 g 新鮮的銅藻，使用超聲波輔助提取法，超聲時間為40 min，液料比為40∶1（mL/g），研究乙醇體積分數(shù)（0%、20%、40%、60%、80%、100%）對銅藻多酚提取率的影響，重復進行3 次試驗。

銅藻多酚提取率（R，mg/g）計算公式如下。

式中：C為多酚濃度；mg/mL；V為提取液體積，mL；m為銅藻質(zhì)量，g。

1.2.2.2 超聲時間對銅藻多酚提取率的影響

稱取1 g 新鮮銅藻，使用超聲波輔助提取法，乙醇體積分數(shù)為40%、液料比40∶1（mL/g），探究超聲時間（10、20、30、40、50、60 min）對銅藻多酚提取率的影響，重復進行3 次試驗。

1.2.2.3 液料比對銅藻多酚提取率的影響

稱取1 g 新鮮銅藻，使用超聲波輔助提取法，乙醇體積分數(shù)40%、超聲時間為50 min，探究液料比[20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）]對銅藻多酚提取率的影響，重復進行3 次試驗。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

采用Design-Expert 8.0.6 軟件，對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，以研究影響因素的水平和效應(yīng)。具體的影響因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Experimental factors and levels of response surface

1.2.4 銅藻多酚穩(wěn)定性測定

1.2.4.1 光照對銅藻多酚保留率的影響

參考文獻[18]，將銅藻多酚分別置于避光和自然光下的室內(nèi)保存30 d。在相同條件下，取樣品于處理后的1、2、3、7、14、21、30 d，并測定銅藻多酚含量，計算其保留率，比較不同光照條件對銅藻多酚保留率的影響。銅藻多酚保留率（R，%）的計算公式如下。

式中：A為銅藻多酚減少質(zhì)量，mg；B為銅藻多酚初始質(zhì)量，mg。

1.2.4.2 溫度對銅藻多酚保留率的影響

參考文獻[19]，將銅藻多酚置于25、60、100 ℃的環(huán)境中，并進行避光保存。在相同溫度下連續(xù)采樣9 d，并測定銅藻多酚的含量，計算銅藻多酚的保留率，比較不同溫度條件對銅藻多酚保留率的影響。

1.2.4.3 pH 值對銅藻多酚保留率的影響

參考文獻[20]，將銅藻多酚置于pH3、4、5、6、7、8的條件下，避光保存。在相同溫度下，于處理后的1、2、3、7、14、21 d 取樣，并測定銅藻多酚的含量，計算銅藻多酚的保留率，比較不同pH 值對銅藻多酚保留率的影響。

1.2.5 銅藻多酚對酪氨酸酶活性抑制作用研究

參考文獻[21]并略作改動，反應(yīng)體系組成見表2。

表2 反應(yīng)體系組成Table 2 Composition of reaction system μL

分別以左旋酪氨酸和左旋多巴為底物，將磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH6.8），酪氨酸酶溶液和銅藻多酚溶液（銅藻多酚濃度300、400、500、600、700 μg/mL）添加到96 孔板中，37 ℃恒溫10 min。隨后，加入底物，37 ℃恒溫5 min。使用酶標儀測量475 nm 處的吸光度。酪氨酸酶活性抑制率計算公式如下。

式中：X為酪氨酸酶活性抑制率，%；Aa為空白組吸光度；Ab為空白對照組吸光度；Ac為試驗對照組吸光度；Ad為試驗組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對各影響因素進行統(tǒng)計學方差分析，繪出3D 曲面圖，采用Origin 2019b軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅藻多酚提取單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對銅藻多酚提取率的影響結(jié)果

在液料比為40∶1（mL/g）、超聲時間為40 min 條件下，乙醇體積分數(shù)對銅藻多酚提取率的影響如圖1所示。

圖1 乙醇體積分數(shù)對銅藻多酚提取率的影響Fig.1 Influence of ethanol volume fraction on the extraction amount of polyphenols from Sargassum horneri

從圖1 可以看出，銅藻多酚的提取率隨乙醇體積分數(shù)的提高而先上升后下降。在40% 的乙醇體積分數(shù)下，提取率最大，隨著乙醇含量的增大，提取率逐漸降低。因此，以20%，40%，60% 的乙醇體積分數(shù)進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.2 超聲時間對銅藻多酚提取率的影響結(jié)果

以40%乙醇體積分數(shù)，液料比40∶1（mL/g），研究超聲時間對銅藻多酚提取率的影響如圖2 所示。

圖2 超聲時間對銅藻多酚提取率的影響Fig.2 Influence of ultrasonic time on the extraction amount of polyphenols from Sargassum horneri

從圖2 中可以看出，在10～50 min 的超聲波處理下，銅藻多酚提取率隨著超聲時間的延長而增加，在50 min 時達到最大值，60 min 后稍有降低。這可能與銅藻多酚的耐熱性能有關(guān)，隨著超聲波處理時間的延長，萃取溫度也隨之升高，銅藻多酚溶出增加，超聲50 min 后，由于溫度過高，銅藻多酚被破壞損失，從而造成銅藻多酚的提取率含量下降。因此選用40、50、60 min進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.3 液料比對銅藻多酚提取率的影響

以40% 乙醇作為提取溶劑，超聲時間50 min，液料比對銅藻多酚提取率的影響如圖3 所示。

圖3 液料比對銅藻多酚提取率的影響Fig.3 Influence of solid-liquid ratio on the extraction amount of polyphenols from Sargassum horneri

由圖3 可知，隨著提取溶劑量的增加，銅藻多酚的提取率逐漸增大，可能是提取溶劑量的增加，溶劑和原料間的濃度差增大，物質(zhì)擴散速度加快，提取率逐漸提高。由于液料比過大不利于節(jié)能環(huán)保和降低成本，因此，選擇40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）的液料比進行優(yōu)化試驗。

2.2 銅藻多酚提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果如表3 所示。

表3 Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

通過Design-Expert 8.0.6 軟件對表3 中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到回歸方程：y=2.02+0.073A+0.023B+0.080C-0.003AB-0.032AC-0.008BC-0.065A2-0.15B2+0.025C2（R2=0.998 6）。

對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果如表4 所示。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance in regression model

由表4 可知，A對銅藻多酚提取率影響顯著（P＜0.05），C、B2對銅藻多酚得率的影響極顯著（P＜0.01）；AB、AC、BC、A2、C2對銅藻多酚得率的影響均不顯著（P＞0.05）。由F值可以看出，3 個因素對銅藻多酚提取率的影響順序為液料比（C）＞超聲時間（A）＞乙醇體積分數(shù)（B），超聲波輔助提取銅藻多酚的試驗?zāi)Ｐ惋@著（P＜0.05），表明回歸模型指標顯著；R2=0.998 6，且失擬誤差不顯著（P＞0.05），說明該模型擬合程度良好，可以對試驗結(jié)果進行分析和預(yù)測。

由響應(yīng)面法分析繪制的各因素交互作用的等高線和響應(yīng)面如圖4～圖6 所示。

圖4 乙醇體積分數(shù)和超聲時間對銅藻多酚提取率影響的等高線和響應(yīng)面Fig.4 Contour diagram and response surface diagram of the effects of ethanol volume fraction and ultrasonic time on the yield of polyphenols from Sargassum horneri

圖5 超聲時間和液料比對銅藻多酚提取率影響的等高線和響應(yīng)面Fig.5 Contour diagram and response surface diagram of the effects of ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of polyphenols from Sargassum horneri

圖6 乙醇體積分數(shù)和液料比對銅藻多酚提取率影響的等高線和響應(yīng)面Fig.6 Contour diagram and response surface diagram of the effects of ethanol volume fraction and liquid-solid ratio on the yield of polyphenols from Sargassum horneri

從圖4～圖6 可以看出，響應(yīng)面的曲面傾斜度越大，坡度也較大，說明超聲時間和乙醇體積分數(shù)、超聲時間和液料比、乙醇體積分數(shù)和液料比的交互作用對銅藻多酚提取率有影響。

運用Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗結(jié)果進行分析，得出銅藻多酚提取工藝的最佳條件：乙醇體積分數(shù)40.94%、提取時間53.05 min、液料比60∶1（mL/g）。該條件下銅藻多酚的提取率為2.129 mg/g。為了方便試驗的實際操作，修正工藝條件為乙醇體積分數(shù)40%、提取時間53 min、液料比60∶1（mL/g），進行驗證，試驗重復3 次，銅藻多酚提取率為（2.07±0.24）mg/g，理論值與實際值非常接近，說明所得回歸方程能夠真實有效地反映各因素對銅藻多酚提取率的影響，此模型可靠。

2.3 銅藻多酚穩(wěn)定性研究

2.3.1 光照對銅藻多酚保留率的影響

光照對銅藻多酚保留率的影響見圖7。

圖7 光照對銅藻多酚保留率的影響Fig.7 Effect of light on polyphenol retention rate of Sargassum horneri

由圖7 可知，在30 d 的試驗過程中，銅藻多酚保留率呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢。銅藻多酚對光照敏感，避光條件下銅藻多酚保留率幾乎沒有變化，但是自然光照條件下銅藻多酚保留率明顯下降，在第30 天下降了40%左右。在避光條件下，銅藻多酚的含量相對穩(wěn)定，保留率較高。然而，在室內(nèi)自然光的照射下，銅藻多酚的含量逐漸減少，保留率呈下降趨勢。特別是在處理時間較長的情況下，光照條件對銅藻多酚的穩(wěn)定性影響更為明顯。這一試驗結(jié)果為銅藻多酚的保存提供了重要的參考，為進一步的研究提供了基礎(chǔ)。因此，銅藻多酚在應(yīng)用和保存的過程中應(yīng)注意避光。

2.3.2 溫度對銅藻多酚保留率的影響

溫度對銅藻多酚保留率的影響見圖8。

圖8 溫度對銅藻多酚保留率的影響Fig.8 Effect of temperature on polyphenol retention rate of Sargassum horneri

從圖8 可以看出，銅藻多酚的保留率隨溫度的升高而減小。當溫度為25 ℃時，銅藻多酚的保留率幾乎沒有變化。當溫度升高到60 ℃時，銅藻多酚的持留率略有降低。當溫度上升到100 ℃時，銅藻多酚的保留率明顯下降，直至9 d 時，其保留率下降了85%左右。結(jié)果表明，隨著溫度的提高，銅藻多酚的保留率下降。銅藻多酚在貯藏過程中以低溫貯藏效果最好。

2.3.3 pH 值對銅藻多酚保留率的影響

pH 值對銅藻多酚保留率的影響見圖9。

圖9 pH 值對銅藻多酚保留率的影響Fig.9 Effect of pH value on polyphenol retention rate of Sargassum horneri

從圖9 可以看出，銅藻多酚在酸性環(huán)境中具有更高的穩(wěn)定性。pH 值為4 時，其穩(wěn)定性最好。這可能與多酚類物質(zhì)在堿環(huán)境中的水解作用有關(guān)。結(jié)果表明，在pH3～8 條件下，21 d 內(nèi)銅藻多酚保留率降低了17.55%、16.41%、18.01%、18.20%、21.36%、22.18%。

2.4 銅藻多酚對酪氨酸酶活性抑制作用

銅藻多酚對酪氨酸酶活性抑制作用見圖10。

圖10 銅藻多酚對酪氨酸酶活性抑制作用Fig.10 Inhibitory effect of Sargassum horneri polyphenols on tyrosinase activity

由圖10 可知，銅藻多酚對酪氨酸酶活性有強烈的抑制作用，當銅藻多酚濃度在300～700 μg/mL 時，其對酪氨酸酶活性的抑制效果會隨其濃度增加而增強，呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。在相同濃度的銅藻多酚溶液中，當?shù)孜餅樽笮野彼釙r，其對酪氨酸酶活性的抑制效果較好。當?shù)孜锓謩e為左旋酪氨酸和左旋多巴時，銅藻多酚濃度為700 μg/mL 時，對酪氨酸酶活性的抑制率為92.68% 和39.18%。此外，銅藻多酚濃度為700 μg/mL時，以左旋酪氨酸為底物時，其對酪氨酸酶活性的抑制效果略高于Lee 等[22]研究中木瓜對酪氨酸酶的抑制率，說明銅藻多酚對酪氨酸酶活性有明顯的抑制效果。

3 結(jié)論

以銅藻多酚的提取率為考察指標，利用響應(yīng)面方法對超聲輔助萃取銅藻多酚進行了優(yōu)化。優(yōu)選出最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)40%、超聲時間53 min、液料比60∶1（mL/g）。對銅藻多酚的穩(wěn)定性進行了研究，結(jié)果表明，在較低貯藏溫度下，當pH 值為4 時，銅藻多酚在溶液中的保留率最大。在700 μg/mL 的銅藻多酚條件下，左旋酪氨酸、左旋多巴對酪氨酸酶的抑制作用高達92.68%、39.18%。綜上，從銅藻中分離得到的銅藻多酚對酪氨酸酶有明顯的抑制作用，對豐富銅藻資源的開發(fā)和利用具有重要的科學意義。