芹菜IDF 與多菌群益生菌連續(xù)共培養(yǎng)的培養(yǎng)物特性

楚京嬴，呂嘉櫪*，高捷，楊柳青

（1.陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021；2.陜西巨子生物技術(shù)有限公司，陜西西安 710077）

益生菌是當(dāng)攝入足夠數(shù)量時(shí)能給宿主帶來有益健康影響的活的微生物[1]，益生菌膳食補(bǔ)充劑已成為膳食補(bǔ)充劑（dietary supplement）中最重要的種類之一[2-5]。益生菌膳食補(bǔ)充劑中益生菌的活性是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的重要指標(biāo)，提高益生菌的活性通常是通過提高其菌體濃度的方法來實(shí)現(xiàn)。富集微生物是提高菌體濃度的一種有效方法，其中的生物膜法富集微生物，具有菌體濃度高、活性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)，因此在食品與醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究與應(yīng)用越來越受到關(guān)注[6]。

生物膜是指依附于載體材料的特殊微生物聚集體，是由高度密集的微生物組成的生態(tài)系統(tǒng)[7]。自然界中大多數(shù)微生物都以生物膜的形式存在[8]，生物膜富集技術(shù)通過微生物與載體材料間的弱相互作用而黏附到載體表面，微生物大量聚集形成生物膜，在流動(dòng)過程中通過膜富集在載體表面及內(nèi)部的孔隙來截留微生物，菌體與載體發(fā)生共聚集不斷黏附到載體表面，從而達(dá)到富集效果[9]。張國(guó)麗等[10]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌PF3-1 生物膜形成過程中菌活性顯著提高。Speranza等[11]研究了4 株益生菌在不銹鋼材料上形成的生物膜特性，結(jié)果表明4 株益生菌在不銹鋼材料上均能富集形成生物膜。浦明珠等[12]利用椰果表面的乳酸菌生物膜對(duì)牛乳發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其對(duì)牛奶pH 值的降低速率明顯高于游離乳酸菌組，且發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的活菌數(shù)也高于游離乳酸菌組。陳翠翠等[13]在振蕩培養(yǎng)下，比較了雙歧桿菌在6 種植物基水不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）中成膜的情況及生物膜特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌在葡萄籽IDF 上成膜效果最好，存活率較游離菌株提高4～6.5 倍，模擬胃液耐受性存活率為59.82%，模擬腸液耐受性存活率為13.53%。檀利軍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同種類的益生菌混合培養(yǎng)過程中存在一定的調(diào)控因素，混合培養(yǎng)這些益生菌形成的生物膜特性優(yōu)于單菌。薛勝平等[15]通過模擬腸道環(huán)境，選用5 株益生菌，以玉米IDF 為載體，連續(xù)培養(yǎng)12 d，發(fā)現(xiàn)接入的5 種菌均可穩(wěn)定共存，掃描電鏡觀察到5 種菌均在玉米纖維上形成了生物膜?，斠乐Z·木圖拉等[16]以不銹鋼網(wǎng)布為載體，使嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在其表面形成混菌生物膜，該混菌生物膜對(duì)酸和高溫具有更高的抗性。目前，有關(guān)生物膜法富集益生菌方面的研究尚處于起步階段，其中選用的載體至關(guān)重要，一般應(yīng)符合以下條件[17]：具有較大表面積且不影響細(xì)胞的生物活性，有利于微生物的黏附，不易被水解，不影響微生物間信號(hào)分子的交流和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，應(yīng)為食品級(jí)等。

膳食纖維被稱為“第七大營(yíng)養(yǎng)素”，是平衡膳食結(jié)構(gòu)的必須營(yíng)養(yǎng)素之一[18]，在益生菌膳食補(bǔ)充劑研制中，膳食纖維不僅可以作為必須營(yíng)養(yǎng)素的來源，還可作為保護(hù)益生菌的微膠囊壁材[19-21]。目前與益生菌復(fù)合的膳食纖維多為谷類、低聚糖類或非食品級(jí)材料等，水不溶性膳食纖維（IDF）是易獲得的可食性天然食物來源，表面粗糙、比表面積大、有穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等，不僅具有強(qiáng)的持水力、吸附力、抗氧化、改善便秘等生理功能，而且是富集益生菌的理想載體，對(duì)益生菌活性有很好保護(hù)作用。

芹菜是一種常見的蔬菜，來源廣泛，產(chǎn)量高，且含有大量的膳食纖維。芹菜中的IDF 含量為59.4%，高于大部分蔬菜[22]；芹菜IDF 主要包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和殼聚糖等[23]，結(jié)構(gòu)中維管束大量密集，呈絲狀，其表面粗糙，有大量管狀空腔，比表面積大，利于菌體附著。芹菜IDF 還具有增加飽腹感、有助減肥、減輕水腫、降低血壓和血脂等功效[24]。

綜上，本文利用生物膜富集微生物的原理，以芹菜IDF 為載體，5 株益生菌為菌株，MRS 為營(yíng)養(yǎng)液，通過自主設(shè)計(jì)的富集培養(yǎng)裝置，使芹菜IDF 上富集多菌群益生菌，形成富含芹菜IDF 與多菌群益生菌的生物膜培養(yǎng)物，并對(duì)其活菌數(shù)、菌群結(jié)構(gòu)、代謝物組成、對(duì)消化液的耐受性以及抗氧化活性等特性進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步研制活性高、功能性強(qiáng)的益生菌與蔬菜膳食纖維有機(jī)復(fù)合型膳食補(bǔ)充劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保加利亞乳桿菌LactobacillusbulgaricusG302（Lb G302）、植物乳桿菌L.plantarumG304（Lp G304）、副干酪乳桿菌L.paracaseiG305（Lcp G305）、鼠李糖乳桿菌L.rhamnosusG306（Lr G306）、嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilusQ305（St Q305）：陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物室提供；芹菜：市售；MRS 肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、戊二醛、鄰苯二甲醛、濃鹽酸、磷酸二氫鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、尿素、尿酸、硫酸鈉、氰化鉀、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、黏蛋白、α-淀粉酶（3 700 U/g）、胃蛋白酶（豬胃黏膜）（3 000 U/g）、胰酶（生物試劑）（4 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；DNA 抽提試劑盒、E.Z.N.A.?Soil DNA Kit：美國(guó)Omega Bio-Tek 公司；建庫試劑盒、NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit：美國(guó)柏爾生物技術(shù)公司；DNA 測(cè)序試劑盒、NovaSeq Reagent Kits：美國(guó)Illumina 公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國(guó)Fisher Chemical 公司；甲酸（色譜純）：德國(guó)CNW 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600 紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SHA-B 恒溫水浴振蕩器：常州國(guó)華電器有限公司；HC-3018R 高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳儀器有限公司；DSX-280A 高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠有限公司；PHENOM-PRO 臺(tái)式掃描電鏡：上海飛納儀器有限公司；Illumina Miseq 測(cè)序儀：美國(guó)Illumina 公司；UHPLC -Q Exactive HF-X 超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo Scientific 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 芹菜IDF 的制備

將芹菜洗凈，切段，按料水比1∶1（g/mL）打漿1 min 后得漿液，漿液過200 目的濾網(wǎng)使芹菜渣與芹菜汁分離，得到芹菜汁和芹菜渣，分離出的芹菜渣即為芹菜IDF。

1.3.2 富集培養(yǎng)裝置的設(shè)計(jì)

富集培養(yǎng)裝置如圖1 所示。

圖1 芹菜IDF 富集培養(yǎng)多菌群益生菌的培養(yǎng)裝置Fig.1 Celery IDF enrichment culture multi-probiotics culture device diagram

如圖1 所示，富集培養(yǎng)裝置主要包括兩個(gè)部分：發(fā)酵罐和內(nèi)置的分室培養(yǎng)支架。發(fā)酵罐上設(shè)置了發(fā)酵罐蓋、進(jìn)液口、取樣口和出液口，發(fā)酵罐蓋上設(shè)有螺口，分室培養(yǎng)支架上設(shè)有螺桿。分室培養(yǎng)支架可以將富集后的不同益生菌芹菜IDF 分隔開，以便同時(shí)獲得不同菌體與芹菜IDF 生物膜培養(yǎng)物，通過旋轉(zhuǎn)發(fā)酵罐蓋可在發(fā)酵罐側(cè)面的取樣口取不同室內(nèi)的樣品。富集培養(yǎng)具體操作步驟如下。

滅菌：將發(fā)酵罐、分室培養(yǎng)支架于滅菌鍋中121 ℃、15 min 滅菌處理。接種：將選取的5 種益生菌分別以1%接種量接種于裝有MRS 液體培養(yǎng)基和芹菜IDF 的藍(lán)口瓶中培養(yǎng)36 h，過濾得到含有5 種不同益生菌的芹菜IDF，然后將其分別放入分室培養(yǎng)支架的5 個(gè)分室內(nèi)，按罐體容積80%加入MRS 培養(yǎng)液，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃連續(xù)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)7 d，每隔1 d 更換罐內(nèi)的MRS 培養(yǎng)液。富集培養(yǎng)：富集培養(yǎng)過程中，于0、1、2、3、4、5、6、7 d 在發(fā)酵罐的取樣口取各菌復(fù)合培養(yǎng)物，混勻，6 000 r/min 離心10 min，棄上清液，獲得益生菌與IDF 的復(fù)合培養(yǎng)物，測(cè)定其活菌數(shù)，采用高通量測(cè)序技術(shù)（16S rDNA）對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)菌V3～V4 區(qū)進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)對(duì)0、3、7 d 的各菌復(fù)合培養(yǎng)物進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

1.3.3 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物對(duì)模擬消化液耐受性

參考文獻(xiàn)[25]方法制備模擬消化液。以培養(yǎng)7 d的多菌群益生菌與芹菜IDF 復(fù)合培養(yǎng)物為試驗(yàn)組，以5 株單菌與芹菜IDF 培養(yǎng)7 d 的培養(yǎng)物為對(duì)照組。在模擬口腔消化液中37 ℃恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)0、10 min；在模擬胃消化液中37 ℃恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)0、1、2、3 h；在模擬腸消化液中37 ℃恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)0、2、4、6 h，分別測(cè)活菌數(shù)。

1.3.4 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物的抗氧化活性

以培養(yǎng)7 d 的多菌群益生菌與芹菜IDF 的復(fù)合培養(yǎng)物為試驗(yàn)組，以芹菜IDF 為一個(gè)對(duì)照組，以5 株單菌與芹菜IDF 培養(yǎng)7 d 的培養(yǎng)物為另一個(gè)對(duì)照組，分別測(cè)定3 組對(duì)DPPH 自由基的清除率。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 益生菌活菌數(shù)量檢測(cè)

參考GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[26]檢測(cè)益生菌活菌數(shù)量。

1.4.2 顯微表征

參考文獻(xiàn)[27]方法，進(jìn)行掃描電鏡顯微觀察。

1.4.3 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物菌群結(jié)構(gòu)分析

無菌條件下收集0～7 d 的芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物，置于離心管中，液氮速凍。在干冰中送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，通過高通量測(cè)序技術(shù)（16S rDNA）對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)菌V3～V4 區(qū)進(jìn)行微生物多樣性測(cè)序。

1.4.4 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物代謝組學(xué)分析

1.4.4.1 樣本的制備

取200 μg 樣本于2 mL 離心管中，加入一顆直徑6 mm 的研磨珠。用400 μL 提取液（甲醇∶水=4∶1，體積比）含0.02 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸）進(jìn)行代謝產(chǎn)物提取。樣本溶液于冷凍組織研磨儀-10 ℃、50 Hz研磨6 min 后，低溫超聲提取30 min（5 ℃、40 kHz）。將樣品于-20 ℃靜置30 min，離心15 min（4 ℃、13 000×g），移取上清液至微量進(jìn)樣瓶中進(jìn)行上機(jī)分析。此外，取等體積的所有樣本代謝物混合制備成質(zhì)控樣本（quality control，QC），在儀器分析過程中，每5～15 個(gè)樣本中插入一個(gè)QC 樣本，以考察整個(gè)分析過程的重復(fù)性。

1.4.4.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）測(cè)試條件

1）色譜條件：2 μL 樣本經(jīng)HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）分離后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。流動(dòng)相A 為95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B 為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含0.1%甲酸）。柱溫為40 ℃。

2）質(zhì)譜條件：樣品質(zhì)譜信號(hào)采集采用正負(fù)離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z 70～1 050。鞘氣流速為50 psi（1 psi=6 895 Pa），輔助氣流速為13 psi，輔助氣加熱溫度為425 ℃，正模式離子噴霧電壓設(shè)置為3 500 V，負(fù)模式離子噴霧電壓設(shè)置為-3 500 V，離子傳輸管溫度為325 ℃，歸一化的碰撞能為20V-40V-60 V 循環(huán)碰撞能。一級(jí)質(zhì)譜分辨率60 000，二級(jí)質(zhì)譜分辨率7 500，采用數(shù)據(jù)依賴性采集模式采集數(shù)據(jù)。

1.4.5 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物對(duì)消化液耐受性的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[25]的檢測(cè)方法測(cè)定消化液耐受性。

1.4.6 DPPH 自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[28]的方法測(cè)定DPPH 自由基清除率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

芹菜IDF 與多菌群益生菌富集培養(yǎng)活菌數(shù)的分析使用OriginPro 9.0 軟件。芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物對(duì)消化液的耐受性、抗氧化活性以及對(duì)DPPH 自由基清除率分析使用GraphPad Prism 8 軟件。

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，使用超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜UHPLC-Q Exactive HF-X 系統(tǒng)進(jìn)行高分辨非靶向代謝組學(xué)分析。將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI 進(jìn)行基線過濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊，最終得到一個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣，同時(shí)將MS 和MSMS 質(zhì)譜信息與人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫（Human Metabolome Database，HMDB）和Metlin 以及測(cè)試公司自建庫進(jìn)行匹配，得到代謝物信息。

對(duì)預(yù)處理后的矩陣文件進(jìn)行差異分析，R 軟件包ropls（Version1.6.2）進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最二乘判別分析法分析（partial leastsquares discrimination analysis，PLS-DA），篩選芹菜IDF 與多菌益生菌不同培養(yǎng)階段的差異代謝物，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為VIP＞1 且差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 富集培養(yǎng)過程中芹菜IDF 上活菌數(shù)的變化

芹菜IDF 富集培養(yǎng)多菌益生菌過程中5 株益生菌（Lb G302、Lp G304、Lcp G305、Lr G306 和St Q305）在芹菜IDF 上活菌數(shù)的變化如圖2 所示。

圖2 芹菜IDF 富集培養(yǎng)多菌群益生菌過程中IDF 上活菌數(shù)的變化Fig.2 Change of viable count on IDF in celery IDF enrichment process of multi-probiotics

如圖2 所示，在0～24 h，芹菜IDF 上的活菌數(shù)迅速上升，培養(yǎng)24～120 h，芹菜IDF 上的菌體濃度保持緩慢上升趨勢(shì)，120 h 時(shí)活菌數(shù)最高可達(dá)到7.5×1013CFU/g，之后IDF 上的活菌數(shù)目開始出現(xiàn)下降，因?yàn)樯锬ば纬梢欢ê穸群?，?huì)自動(dòng)脫落。

2.2 富集培養(yǎng)過程中芹菜IDF 的顯微表征

富集培養(yǎng)過程中，對(duì)富集了5 種不同菌株的芹菜IDF 進(jìn)行掃描電鏡的顯微表征，培養(yǎng)0 d 和培養(yǎng)7 d 時(shí)的掃描電鏡圖如圖3 所示。

圖3 5 種菌培養(yǎng)0 d 和7 d 時(shí)芹菜IDF 的掃描電鏡圖（2 000×）Fig.3 Scanning electron microscope images of celery IDF after 0 d and 7 d of cultivation with five strains（2 000×）

圖3 顯示，在富集培養(yǎng)7 d 時(shí)，5 種益生菌的菌體均在芹菜IDF 表面或空腔內(nèi)富集，形成了具有一定厚度的生物菌膜。

2.3 富集培養(yǎng)過程中菌群結(jié)構(gòu)的變化

在富集培養(yǎng)0～7 d 過程中，菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上的物種相對(duì)豐度變化如圖4 所示。

圖4 屬水平上的物種相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of the species at the genus level

由圖4 可知，整個(gè)富集培養(yǎng)過程中，在屬分類水平上，芹菜IDF 上的細(xì)菌主要由乳桿菌屬（Lactobacillaceae）和鏈球菌屬（Streptococcaceae）組成，且乳桿菌屬在整個(gè)培養(yǎng)過程中占據(jù)主導(dǎo)地位。乳桿菌屬0～7 d 中的豐度依次為82.58%、96.48%、99.27%、99.92%、99.93%、99.93%、99.96%、99.95%，鏈球菌屬依次為17.23%、3.49%、0.72%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.04%，其結(jié)果與加入的菌群結(jié)構(gòu)一致。

2.4 富集培養(yǎng)過程中代謝組學(xué)分析

2.4.1 PCA 分析

富集培養(yǎng)過程中，采集0、3、7 d 時(shí)的培養(yǎng)物，進(jìn)行代謝組學(xué)分析，其PCA 結(jié)果如圖5 所示。

圖5 培養(yǎng)物的PCA 模型得分圖Fig.5 PCA model score plots of the cultures

通過對(duì)0、3、7 d 3 組樣本分別進(jìn)行主成分分析，判斷芹菜IDF 與多菌群益生菌富集培養(yǎng)0、3、7 d 的3 組樣本間以及組內(nèi)6 個(gè)樣本間的變異度大小。如圖5 所示，PC1 為49.50%，PC2 為18.40%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)67.90%。其中，3 組樣本間出現(xiàn)明顯的分離，表明不同培養(yǎng)時(shí)間段多菌群益生菌具有不同的代謝特征。此外，3 組樣本內(nèi)的6 個(gè)重復(fù)樣本聚集程度較好，表明組內(nèi)每個(gè)重復(fù)樣本的代謝物差異較小。

在樣本組間代謝差異較小時(shí)，由于PCA 分析無法很好地分離組間樣本，需采用偏最二乘判別分析法（partial leastsquares discrimination analysis，PLS-DA）建立代謝物表達(dá)量與樣本之間的關(guān)系模型，使各組樣本間的區(qū)分最大化，從而更好地確立樣本關(guān)系。根據(jù)PLS-DA 模型對(duì)1 468 個(gè)代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 培養(yǎng)物的PLS-DA 模型得分Fig.6 PLS-DA model scores of the cultures

如圖6 所示，PLS-DA 得到2 個(gè)主成分，主成分1的貢獻(xiàn)率為35.14%、主成分2 的貢獻(xiàn)率為23.73%。3 組樣品的區(qū)分效果非常明顯，0 d 樣本分布在置信區(qū)間的右側(cè)，3 d、7 d 樣品分布在置信區(qū)間的左側(cè)，表明多菌群益生菌在培養(yǎng)后期代謝物的變化程度相對(duì)于培養(yǎng)前期較小。

在3 組樣本中，共檢測(cè)出了1 468 個(gè)代謝物，代謝物主要為脂類、肽類、碳水化合物、核酸、有機(jī)酸、維生素和輔酶因子等。其中培養(yǎng)0 d 時(shí)樣本中有1 432 個(gè)代謝物，3 d 樣本中有1 432 個(gè)代謝物，7 d 樣本中有1 398 個(gè)代謝物。

2.4.2 差異代謝物分析

0、3、7 d 時(shí)芹菜IDF 與多菌益生菌培養(yǎng)物差異代謝物的分析結(jié)果如圖7 所示。

圖7 多組間差異代謝物的比較分析Fig.7 Comparative analysis of differential metabolites between multiple groups

圖7 表明，3 組樣本中，有16 個(gè)差異高度顯著的代謝物，分別是norerythromycin、9，10，13-三羥基-11-十八碳烯酸、山梨醇、肉桂酸、乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸、Val-Leu-Pro-Val-Pro、2-（5-tetradecenyl）cyclobutanone、硫辛酰賴氨酸、苯乳酸、己胺、Simonin IV、2-羥基丁酸、L-山梨糖、3-氨基戊二烯酸、蘋果酸和正亮氨酸。差異極顯著的代謝物有1 個(gè)為3-O-原兒茶酰頭孢酸，差異顯著的代謝物有2 個(gè)，分別為十二烷基苯磺酸和檸檬酸。

2.4.3 功能性代謝物差異分析

2.4.3.1 神經(jīng)遞質(zhì)類代謝物

神經(jīng)遞質(zhì)類代謝物的變化分析結(jié)果如圖8 所示。

圖8 芹菜IDF 富集培養(yǎng)多菌群益生菌過程中神經(jīng)遞質(zhì)類代謝物的變化分析圖Fig.8 Analysis of changes in neurotransmitter metabolites during multi-probiotics cultivation by celery IDF enrichment

如圖8 所示，芹菜IDF 富集培養(yǎng)多菌群益生菌過程中，存在20 種有差異的神經(jīng)遞質(zhì)類代謝物。其中2種差異顯著，分別是1-十四烷?；?2-（9Z，12Z，15Z-十八碳三烯?；?sn-甘油和十六酰胺乙醇；2 種差異極顯著，分別是ADP 和乙酰輔酶A；16 種差異高度顯著，分別是Morph、L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽、3H-多巴胺、自行素-1、血栓素B2、腺苷、γ-氨基丁酸、5-羥基-L-色氨酸、琥珀酸、血清素、adenosine，8-（butylamino）-N-cyclopentyl、5-羥基吲哚乙酸、L-色氨酸、前列腺素E2 和脫氧腺苷。與培養(yǎng)0 d 相比，培養(yǎng)7 d 時(shí)顯著上調(diào)的神經(jīng)遞質(zhì)類代謝物有14 種，分別是L-谷氨酸、3H-多巴胺、自行素-1、血栓素B2、adenosine，8-（butylamino）-N-cyclopentyl、5-羥基-L-色氨酸、琥珀酸、血清素、5-羥基吲哚乙酸、L-色氨酸、脫氧腺苷、ADP 和乙酰輔酶A；下調(diào)的神經(jīng)遞質(zhì)類代謝物有6 種，分別是Morph、腺苷、γ-氨基丁酸、前列腺素E2、1-十四烷?；?2-（9Z，12Z，15Z-十八碳三烯?；?sn-甘油和十六酰胺乙醇。

2.4.3.2 維生素和輔酶類代謝物

維生素和輔酶類代謝物的變化分析結(jié)果如圖9所示。

圖9 芹菜IDF 富集培養(yǎng)多菌群益生菌過程中維生素和輔酶類代謝物的變化分析圖Fig.9 Analysis of changes in vitamins and coenzyme metabolites during multi-probiotics cultivation by celery IDF enrichment

由圖9 可知，在富集培養(yǎng)過程中，共代謝產(chǎn)生7 種維生素和輔酶類的代謝物且均差異高度顯著。這7 種代謝物分別是β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、泛酸、D-泛酸、葉酸、S-腺苷甲硫氨酸和黃素單核苷酸。

2.4.3.3 肽類代謝物

肽類代謝物的變化分析結(jié)果如圖10 所示。

圖10 芹菜IDF 富集培養(yǎng)多菌群益生菌過程中肽類代謝物的變化分析圖Fig.10 Analysis of changes in peptide metabolites during multi-probiotics cultivation by celery IDF enrichment

由圖10 可知，富集培養(yǎng)過程中，共代謝產(chǎn)生21 種有差異的肽類代謝物。其中2 種差異顯著，分別為萘啶酸和高絲氨酸；19 種差異高度顯著，分別為亮索菌素B、伏馬菌素A2、多粘菌素B2、綠僵菌素R、多粘菌素、伏馬菌素B2、L-丙氨酸、左旋多巴、圓孤菌素、L-谷氨酰胺、肌肽、L-谷氨酸鹽、L-蛋氨酸、紅霉素C、脯氨酸、格爾德霉素、L-谷氨酸、氨酸和大觀霉素。與培養(yǎng)0 d 相比，培養(yǎng)7 d 時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)的肽類代謝物有9 種。

綜上，富集培養(yǎng)7 d 與培養(yǎng)0 d 相比，神經(jīng)遞質(zhì)類、維生素和輔酶類以及肽類代謝物，不僅種類有所增加，且大部分代謝物的表達(dá)量上調(diào)，說明芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物的益生效果有所增強(qiáng)。

2.5 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物對(duì)消化道的耐受性

芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物對(duì)消化道的耐受性分析結(jié)果如圖11 所示。

圖11 芹菜IDF 與多菌益生菌混合生物膜培養(yǎng)物對(duì)消化液的耐受性Fig.11 Digestive fluid tolerance of celery IDF and mixed biofilm with multi-probiotics

由圖11 可知，在不同消化液中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)均有不同程度的降低。模擬口腔消化10 min時(shí)，單菌與多菌的耐受力差異較小，存活率都達(dá)到了98.00%以上，表明人工模擬的口腔消化對(duì)益生菌的影響較??；人工模擬胃液處理1、2、3 h 后，單菌和多菌活菌數(shù)均持續(xù)下降，Lb G302、Lp G304 的存活率最低，且下降速度最快，而多菌存活率下降緩慢，且存活率較比單菌高。經(jīng)過模擬胃液消化3 h 后，5 株單菌和多菌的存活率分別為7.74%、5.50%、31.52%、26.35%、26.00%、41.28%，芹菜IDF 中活菌數(shù)保持在1010CFU/g 左右；在人工模擬的腸液中處理6 h，單菌和多菌的存活率下降均緩慢，且多菌的最后存活率與Lb G302 和Lp G304無明顯差異，5 株單菌和多菌在人工腸液處理6 h 后的存活率分別為55.16%、51.59%、40.79%、42.11%、19.65%、55.07%，且多菌培養(yǎng)物中的活菌數(shù)維持在1011CFU/g左右。綜上，在整個(gè)模擬消化體系中，模擬胃液消化階段存活率最低，其次是模擬腸道消化和口腔消化；多菌較單菌對(duì)消化液有較強(qiáng)的耐受力。

2.6 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物的抗氧化活性

富集培養(yǎng)7 d 時(shí)培養(yǎng)物對(duì)DPPH 自由基清除率如圖12 所示。

圖12 芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物對(duì)DPPH 自由基清除率Fig.12 DPPH free radical scavenging rate of celery IDF and mixed biofilm with multi-probiotics

由圖12 可知，多菌對(duì)DPPH 自由基的清除率明顯高于單菌，清除率達(dá)到了95% 以上；5 株單菌Lr G306、Lp G304、Lcp G305、Lb G302、St Q305 對(duì)DPPH的清除率依次為74.95%、71.86%、67.33%、49.54%、44.10%；芹菜IDF 對(duì)DPPH 自由基的清除率為44.28%。說明多菌群復(fù)合有助于提高其抗氧化性能。

3 結(jié)論

以可食性、易獲取、表面粗糙、表面積大的天然膳食纖維源芹菜IDF 為載體，利用生物膜富集微生物的原理，利用自主設(shè)計(jì)的富集培養(yǎng)裝置，分室連續(xù)共培養(yǎng)5 株試驗(yàn)菌株，培養(yǎng)7 d 時(shí)，獲得的芹菜IDF 與多菌群益生菌的生物膜培養(yǎng)物中的活菌數(shù)最高可達(dá)到7.5×1013CFU/g；經(jīng)菌群結(jié)構(gòu)分析，其中加入的乳桿菌屬和鏈球菌屬始終均被檢出；與單菌相比，芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物對(duì)模擬口腔消化液、模擬胃消化液和模擬腸消化液的抗逆性顯著增強(qiáng)，對(duì)DPPH 自由基的清除率顯著提高；代謝組學(xué)分析結(jié)果，培養(yǎng)7 d 與培養(yǎng)0 d 相比，功能性代謝物神經(jīng)遞質(zhì)類、維生素和輔酶類以及肽類等，不僅種類有所增加，且大部分代謝物的表達(dá)量上調(diào)，說明芹菜IDF 與多菌群益生菌混合生物膜培養(yǎng)物的益生效果一定程度上有所增強(qiáng)?？梢娫囼?yàn)設(shè)計(jì)采用生物膜法，利用蔬菜IDF 為載體，將有單菌的芹菜IDF 分隔于各分室內(nèi)，可使5 種不同的益生菌都能富集在各室的芹菜IDF 上，富集培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)方法可行。另一方面，芹菜IDF 不僅是富集益生菌的載體，而且是后續(xù)研制的膳食補(bǔ)充劑的功能物質(zhì)，同時(shí)還是益生菌的保護(hù)劑。研究結(jié)果可為進(jìn)一步研制富集菌濃更高、功能性更強(qiáng)的益生菌與蔬菜IDF 有機(jī)復(fù)合膳食補(bǔ)充劑提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。