茶樹(shù)炭疽病菌拮抗鏈霉菌的篩選及其抑菌特性研究

摘要：茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌（Colletotrichum camelliae）是引起茶樹(shù)炭疽病的重要致病菌，為獲得對(duì)C. camelliae具有拮抗作用的鏈霉菌，采用稀釋涂布法和平板對(duì)峙法從茶園生境中分離篩選出對(duì)其具有明顯拮抗作用的鏈霉菌菌株，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和16 S rRNA基因序列分析對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定；開(kāi)展基于鏈霉菌菌株的抗菌譜測(cè)定、茶炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)和孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)；通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定其無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)茶炭疽病菌的抑菌活性及其抑菌活性穩(wěn)定性，并測(cè)定其產(chǎn)胞外降解酶能力、抗菌物質(zhì)合成基因、揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝物抑菌活性。結(jié)果表明，篩選獲得一株對(duì)茶炭疽病菌C. camelliae具有良好抑菌效果的菌株XS-4，對(duì)茶炭疽病菌的平板抑制效果為76.42%；結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征，以及16 S rRNA基因序列分析，將菌株XS-4鑒定為多產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces polychromogenes）；菌株XS-4對(duì)其他8種植物病原菌均具有較好的抑菌效果，抗菌性能具有廣譜性。掃描電鏡結(jié)果表明，菌株XS-4能抑制茶炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)。孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，拮抗菌XS-4發(fā)酵液能抑制茶炭疽病菌的孢子萌發(fā)，抑制率為62.48%；菌株XS-4的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為KMB培養(yǎng)基，在KMB培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)對(duì)茶炭疽病菌的抑菌效果最好；其無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)溫度、酸堿度、紫外照射、蛋白酶均具有較好的穩(wěn)定性；菌株XS-4的非揮發(fā)性代謝物對(duì)茶炭疽病菌的抑菌活性較好，抑菌率達(dá)81.92%；菌株XS-4具有產(chǎn)生淀粉水解酶、蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶、纖維素酶的能力；菌株XS-4具有產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的pks-Ⅰ及pks-Ⅱ基因。綜上所述，菌株XS-4在茶樹(shù)炭疽病生物防治方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：茶炭疽病菌；鏈霉菌；抑菌效果；穩(wěn)定性；抗菌基因

中圖分類號(hào)：S517.1；S435.711 " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A " " " " " " " 文章編號(hào)：1000-369X（2024）02-283-16

Identification of Antagonistic Streptomycetes Against Anthracnose Pathogen of Tea Plants and

Determination of Their Inhibitory Properties

ZHANG Yudan1，2， TAN Lin3， LIU Zhonghua1，2， XIAO Dungen4， DENG Yulian1，2，

LI Guihua1，2， HUANG Hong1，2， YANG Xueyu1，2， HU Qiulong1，2*

1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China; 2. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China; 3. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China; 4. China Tea （Hunan） Co. LTD.， Changsha 410128， China

Abstract： Colletotrichum camelliae is an important pathogen causing anthracnose of tea plants. In order to obtain Streptomyces strains with better antagonistic effect on C. camelliae， the dilution coating method and plate standoff method were used to isolate and screen Streptomyces strains from the habitat of tea plantations. Morphological observation， physiological and biochemical characteristics and 16 S rRNA gene sequence analysis were combined to identify their species. Antimicrobial spectrum determination， mycelial growth inhibition test and spore germination inhibition test of C. camelliae were carried out for the isolated strains. The antifungal activities and stabilities of aseptic fermentation filtrate of the isolated strains against C. camelliae were determined by using the mycelial growth rate method. The extracellular enzyme-producing capacity， antimicrobial substance synthesis genes， volatile and non-volatile metabolite antifungal activity of the isolated strains were also determined. The results show that a strain XS-4 with better inhibitory effect on tea anthracnose pathogen was obtained and the plate inhibition effect on tea anthracnose pathogen was 76.42%. The strain XS-4 was identified as Streptomyces polychromogenes， which had good inhibitory effect on eight other plant pathogens and the antifungal properties have a broad spectrum. Scanning electron microscopy results show that the strain XS-4 could inhibit the growth of mycelium of tea anthracnose pathogen， and the mycelium was tightly entangled with each other and deformed. The spore germination inhibition test shows that the fermentation solution of strain XS-4 could inhibit the spore germination of C. camelliae， and the inhibition rate was 62.48%. The best fermentation medium for strain XS-4 was KMB medium， and the inhibitory active substance produced by 7 d incubation in KMB medium had the best inhibitory effect on tea anthracnose， the aseptic fermentation filtrate of strain XS-4 had a better stability to temperature， acid and alkali， ultraviolet， and protease. The non-volatile metabolites of strain XS-4 show better antifungal activity against tea anthracnose pathogen with aninhibition rate of 81.92%. The strain XS-4 has the ability to produce amylase， protease， β-1，3-glucanase， and cellulase. The pks-Ⅰ and pks-Ⅱ genes of strain XS-4 were associated with the production of antimicrobial substances. In conclusion， the strain XS-4 has a great potential for application in the biocontrol of anthracnose in tea plants.

Keywords： tea anthracnose， Streptomyces， "antifungal effect， stability， antimicrobial genes

茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌（Colletotrichum camelliae）是茶樹(shù)炭疽病的主要病原菌之一，能危害我國(guó)大多數(shù)茶樹(shù)品種，是我國(guó)茶樹(shù)炭疽病發(fā)生的主要病原菌種[1-2]。茶炭疽病的發(fā)生不僅會(huì)導(dǎo)致茶葉產(chǎn)量降低，還會(huì)嚴(yán)重影響茶葉品質(zhì)。對(duì)于茶炭疽病的防治，目前生產(chǎn)上主要采用化學(xué)藥劑防治，但化學(xué)藥劑的使用對(duì)茶樹(shù)自身和環(huán)境均存在一定的危害[3]，具有使茶樹(shù)病原菌產(chǎn)生抗藥性、殺傷天敵生物等缺點(diǎn)。有益微生物防治已成為植物病害防治的重要研究方向。目前，已有關(guān)于利用有益微生物對(duì)茶樹(shù)炭疽病進(jìn)行生物防治的相關(guān)研究報(bào)道[4]，但利用鏈霉菌防治茶炭疽病的研究報(bào)道相對(duì)較少。

放線菌是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生物研究?jī)r(jià)值的微生物，其中鏈霉菌屬的應(yīng)用較多，鏈霉菌在植物病害中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[5-7]。如桑樹(shù)鏈霉菌（Streptomyces samsunensi）對(duì)橡膠褐根病具有較強(qiáng)的拮抗作用[5]；毒三素鏈霉菌（S. toxytricini）發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制效果較好，對(duì)病菌的菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)均有明顯的抑制作用[6]；鏈霉菌3-22對(duì)櫻桃葉斑病具有較強(qiáng)的拮抗作用，其無(wú)菌濾液抑菌率效果達(dá)80%以上[7]。鏈霉菌具有產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)的能力，有研究表明，深紅紫鏈霉菌（S. violaceorubidus）能產(chǎn)生胞外抗菌物質(zhì)[8]；灰銹赤鏈霉菌（S. griseorubiginosus）能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)[9-10]，利迪鏈霉菌（S. lydicus）的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)多種植物病原真菌均具有較強(qiáng)的抑制作用[11]；盧娜林瑞鏈霉菌（S. lunalinharesii）發(fā)酵液中的抗菌活性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性，在120 ℃以下對(duì)哈銳炭疽菌（C. horii）的抑制率均在95%以上[12]。

因此，本研究以茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌為指示菌，從茶園生境中分離篩選獲得一株拮抗效果良好的鏈霉菌菌株XS-4，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和16 S rRNA基因序列結(jié)果分析對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定，抗菌譜試驗(yàn)測(cè)定其抗菌能力，通過(guò)掃描電鏡、發(fā)酵液培養(yǎng)基及培養(yǎng)時(shí)間篩選、無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性測(cè)定、產(chǎn)胞外降解酶能力、抗菌物質(zhì)合成基因檢測(cè)及非揮發(fā)性代謝物抑菌活性測(cè)定分析，拮抗菌XS-4對(duì)茶炭疽病菌的抑菌特性，旨在為今后茶樹(shù)炭疽病生物防治提供一些科學(xué)理論依據(jù)和支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤

供試土壤樣品于2022年9月采自湖南長(zhǎng)沙縣干杉鄉(xiāng)茶園。

1.1.2 供試病原菌

茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌（C. camelliae）、半知菌亞門(mén)刺盤(pán)孢菌（C. circinans）、茄褐紋擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis vexans）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、柑橘間座殼菌（Diaporthe citri）、大斑凸臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、草莓疫霉菌（Phytophthera fragariae）、大麗輪枝菌（Verticillium dahlia）等9種植物病原菌均分離保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)第十六教學(xué)樓。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

高氏一號(hào)培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基、Bennett培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[13]；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），不加瓊脂即為PDB培養(yǎng)基[14]；酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YEPD）、LB培養(yǎng)基[14]；YG培養(yǎng)基、KMB培養(yǎng)基[15]；無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP4）、酵母膏燕麥培養(yǎng)基（ISP2），不加瓊脂即為ISP2液體培養(yǎng)基[16]；ISP6培養(yǎng)基、氮源利用試驗(yàn)培養(yǎng)基[17]；玉米培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基[18]。蛋白酶培養(yǎng)基：脫脂牛奶5 mL、瓊脂1.5 g、蒸餾水50 mL；淀粉瓊脂培養(yǎng)基[14]；APB培養(yǎng)基[19]。羧甲基纖維素培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、酵母提取物10 g、羧甲基纖維素鈉10 g、NaCl 5 g、KH2PO4 1 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L。

1.1.4 主要試劑

DNA提取試劑盒EasyPure? Genomic DNA Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，盧戈氏碘液購(gòu)自青島華潔生物科技有限公司，剛果紅購(gòu)自天津市化學(xué)試劑研究所，苯胺藍(lán)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，殼聚糖購(gòu)自鑫瑞生物科技有限公司，PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

將100 mg剛果紅溶于100 mL水中制備剛果紅溶液。稱取2 g殼聚糖粉末用預(yù)冷的45 mL濃鹽酸溶解，4 ℃靜置24 h后加入300 mL 50%酒精，將充滿絮狀物的混合溶液4 000 r·min-1離心20 min，取沉淀水洗至中性后用水重懸沉淀至200 mL得到1%的膠體幾丁質(zhì)。

1.1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel收集整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行單因素方差分析，使用Origin 2018軟件作圖。

1.2 拮抗菌株的分離篩選

采用稀釋涂布平板法從供試土壤樣品中分離鏈霉菌菌株，即將土樣依次倍比稀釋10-1～10-6，分別取10-3～10-6各梯度稀釋?xiě)乙?00 μL涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，每個(gè)處理設(shè)3次平行，28 ℃培養(yǎng)7 d后，挑取單菌落進(jìn)行純化。

采用平板對(duì)峙法[12]篩選對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌（C. camelliae）具有拮抗作用的菌株，挑取待測(cè)菌株接種在距PDA平板中心25 mm兩側(cè)，28 ℃培養(yǎng)2 d后，平板中央接入5 mm的茶炭疽病菌菌餅，繼續(xù)培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑，以只接病原菌的平板為對(duì)照，根據(jù)公式（1）計(jì)算其對(duì)茶炭疽病菌的抑菌率。

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑?處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%[20] ··········（1）

1.3 拮抗菌株XS-4的鑒定

1.3.1 形態(tài)特征

將菌株XS-4劃線接種于高氏一號(hào)、ISP2、ISP4、ISP6、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、察氏、PDA、Bennett等8種培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7～14 d，觀察并記錄菌株XS-4在8種培養(yǎng)特征培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)狀況、基生菌絲及氣生菌絲顏色，以及有無(wú)可溶性色素產(chǎn)生。采用插片法在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株XS-4，待菌株菌絲長(zhǎng)上蓋玻片之后，取下蓋玻片在掃描電鏡下觀察菌株XS-4的菌絲、孢子鏈及孢子等特征[21]。

1.3.2 生理生化特性

菌株XS-4的明膠液化試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、Voges-Proskauer（V-P）試驗(yàn)、硝酸還原酶試驗(yàn)、精氨酸脫羧酶試驗(yàn)均參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[22]，氮源利用試驗(yàn)采用普戈二氏的唯一氮源法[23]，菌株XS-4耐鹽性和pH耐受性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[24]。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

使用EasyPure? Genomic DNA Kit試劑盒按說(shuō)明書(shū)提取菌株XS-4基因組DNA，以提取的DNA為模板，利用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增其16 S rRNA基因序列[11]。PCR反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，上、下引物各1 μL，Taq PCRMasterMix酶10 μL，超純水6 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格之后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序后得到的菌株XS-4基因序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)分析后，利用MEGA 11.0軟件以鄰接法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，以明確菌株XS-4的種屬分類。

1.4 菌株XS-4抗菌譜測(cè)定

菌株XS-4的抗菌譜測(cè)定參照1.2章節(jié)進(jìn)行，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28 ℃倒置培養(yǎng)7 d后，測(cè)量菌落直徑，根據(jù)公式（1）計(jì)算拮抗菌株XS-4對(duì)8種植物供試病原菌的抑菌率。

1.5 菌株XS-4對(duì)茶炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)

采用平板對(duì)峙法將茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌（C. camelliae）與拮抗菌株XS-4在28 ℃培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)5 d后，以不接種拮抗菌病原菌自然生長(zhǎng)5 d為對(duì)照，刮取抑菌圈邊緣的茶炭疽病菌菌絲進(jìn)行掃描電鏡觀察，并拍照[25]。

挑取10塊直徑為5 mm的茶炭疽病菌餅置于PDB培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)4 d后用擦鏡紙過(guò)濾備用[26]。處理組將孢子液、拮抗菌發(fā)酵液、PDB以1︰1︰1的比例混合，對(duì)照組將孢子液、無(wú)菌水、PDB以1︰1︰1的比例混合，置于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗處理24 h，每個(gè)處理重復(fù)3次，在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況。孢子萌發(fā)抑制率=（對(duì)照萌發(fā)率?處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率×100%[15]。

1.6 菌株XS-4的發(fā)酵培養(yǎng)基及時(shí)間優(yōu)化

1.6.1 菌株XS-4的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[15]，挑取20個(gè)5 mm大小的菌餅，分別放置于200 mL小米培養(yǎng)基、LB、KMB、YEPD、ISP2、PDB、玉米培養(yǎng)基等液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r·min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng)7 d，取適量發(fā)酵液經(jīng)12 000 r·min-1離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后獲得無(wú)菌發(fā)酵濾液。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)茶炭疽病菌的抑菌活性，即將菌株XS-4無(wú)菌發(fā)酵濾液與PDA以1︰9的比例混勻倒平板后，在平板中央接種5 mm大小的茶炭疽病菌菌餅，每個(gè)處理設(shè)3次平行，以不加無(wú)菌發(fā)酵濾液的PDA平板接種病原菌為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)5 d后，測(cè)量病原菌菌落直徑并計(jì)算其對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌的抑菌率。

1.6.2 菌株XS-4的發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[15]，在篩選出最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，挑取20個(gè)5 mm大小的菌餅，放置于200 mL KMB培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r·min-1條件下分別發(fā)酵培養(yǎng)4、5、6、7、8、9 d后，測(cè)定其對(duì)茶炭疽病菌的抑菌活性，具體測(cè)定方法與1.6.1章節(jié)一致。

1.7 菌株XS-4抑菌活性穩(wěn)定性測(cè)定

將在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵時(shí)間基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)所獲得的菌株XS-4發(fā)酵液以12 000 r·min-1離心20 min后，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后得到菌株XS-4無(wú)菌發(fā)酵濾液。

溫度的穩(wěn)定性：取適量無(wú)菌發(fā)酵濾液分別放置在40、60、80、100 ℃和120 ℃下處理30 min，將處理后的無(wú)菌發(fā)酵濾液以1︰9的比例與PDA混合制成平板，將茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌接種在平板中央，以未經(jīng)處理的無(wú)菌發(fā)酵濾液與PDA混合制成平板為陽(yáng)性對(duì)照CK，以不加無(wú)菌發(fā)酵濾液的PDA平板為空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3次平行，28 ℃培養(yǎng)5 d后，測(cè)量病原菌菌落直徑，并計(jì)算其對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌的抑菌率。

酸堿的穩(wěn)定性：取適量無(wú)菌發(fā)酵濾液加入到離心管中，將無(wú)菌發(fā)酵濾液pH分別調(diào)節(jié)到1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，放置30 min后，再將pH調(diào)至7.0，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定經(jīng)處理后的無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌的抑菌活性穩(wěn)定性。

紫外照射下的穩(wěn)定性：取適量無(wú)菌發(fā)酵濾液分別用紫外照射1、2、3、4、5 h后，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定經(jīng)處理后的無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌的抑菌活性穩(wěn)定性。

蛋白酶穩(wěn)定性：參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行菌株XS-4的無(wú)菌發(fā)酵濾液蛋白酶穩(wěn)定性試驗(yàn)，無(wú)菌發(fā)酵濾液經(jīng)胃蛋白酶和蛋白酶K處理，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌的抑菌活性穩(wěn)定性。

1.8 菌株XS-4的抑菌特性測(cè)定

1.8.1 菌株XS-4揮發(fā)性代謝物與非揮發(fā)性代謝物抑菌活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[27-28]，菌株XS-4揮發(fā)性代謝物抑菌活性采用雙皿對(duì)扣法，即將菌株XS-4接種在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，茶炭疽病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，茶炭疽病菌平板朝上兩皿對(duì)扣，用封口膜密封后放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以不接拮抗菌只接病原菌為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3次平行，觀察茶炭疽病菌菌落生長(zhǎng)情況，5 d后測(cè)量病原菌菌落直徑，并計(jì)算其對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌的抑菌率。

菌株XS-4非揮發(fā)性代謝物抑菌活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[27-28]中方法，在PDA平板上平鋪兩層已滅菌的0.22 μm濾膜，在平板中央接入5 mm的XS-4菌株菌餅，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，將濾膜連同拮抗菌一起取出，在原位置接入5 mm的茶炭疽病菌菌餅，以在新的PDA平板上只接入茶炭疽病菌為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3次平行，觀察茶炭疽病菌菌落生長(zhǎng)情況，5 d后測(cè)量病原菌菌落直徑，并計(jì)算其對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌的抑菌率。

1.8.2 菌株XS-4產(chǎn)胞外降解酶能力測(cè)定

菌株XS-4產(chǎn)淀粉水解酶、蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等胞外降解酶能力檢測(cè)均采用三點(diǎn)接種法，將菌株XS-4分別接種在淀粉水解酶培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基、APB培養(yǎng)基、羧甲基纖維素培養(yǎng)基、膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d。淀粉瓊脂培養(yǎng)基用盧戈氏碘液進(jìn)行染色，纖維素酶先用剛果紅染液染色再用NaCl溶液脫色，蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶均直接觀察，培養(yǎng)基上有水解圈產(chǎn)生即具有產(chǎn)酶能力，反之則無(wú)產(chǎn)酶能力[29-30]。

1.8.3 抗菌基因PCR擴(kuò)增

以菌株XS-4的基因組DNA為模板，使用表1中引物分別對(duì)菌株XS-4的非核糖體多肽合成酶基因（nrps）、聚酮合成酶基因（pks-Ⅰ和pks-Ⅱ）等相關(guān)抗菌物質(zhì)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系與1.3.3章節(jié)一致。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃變性3 min；94 ℃預(yù)變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株分離篩選結(jié)果

通過(guò)稀釋涂布平板法從供試土壤樣品中分離獲得鏈霉菌菌株，采用平板對(duì)峙法篩選得到1株對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌（C. camelliae）有較好抑制效果的鏈霉菌菌株XS-4，平板抑制效果達(dá)76.42%（圖1）。

2.2 菌株XS-4的鑒定分析

2.2.1 形態(tài)特征

菌株XS-4在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上的單菌落形態(tài)為圓形狀，基生菌絲、氣生菌絲均生長(zhǎng)良好，氣生菌絲顏色為淡粉色，掃描電鏡下觀察到菌株XS-4的孢子鏈為直鏈狀，孢子圓形；

在8種培養(yǎng)基上觀察培養(yǎng)特征，顯示均能生長(zhǎng)，且在ISP2和高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，菌落致密，氣生菌絲發(fā)達(dá)，在ISP4和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，菌落稀疏，在ISP2、ISP6及PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)可溶性色素，其他培養(yǎng)基上均不產(chǎn)可溶性色素（圖2，表2）。

2.2.2 生理生化特征

菌株XS-4生理生化試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，其明膠液化、過(guò)氧化氫酶、精氨酸脫羧酶均為陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、硝酸還原酶均為陰性，能利用L-丙氨酸、L-甘氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸，不能利用L-谷氨酸、L-半胱氨酸；菌株XS-4在4% NaCl濃度以下均能生長(zhǎng)，pH的耐受范圍為5～10（表3）。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得菌株XS-4的16 S rRNA基因序列，將其提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)為PP001417。在NCBI進(jìn)行

BLAST比對(duì)分析，選取相似性較高的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，菌株XS-4與多產(chǎn)色鏈霉菌（S. polychromogenes）聚為一支。通過(guò)綜合菌株XS-4的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征及16 S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果，菌株XS-4被鑒定為多產(chǎn)色鏈霉菌（S. polychromogenes）（圖3）。

2.3 菌株XS-4抗菌譜分析

菌株XS-4的抗菌譜測(cè)定結(jié)果表明，其對(duì)其他8種植物病原菌的抑制效果較好，抑菌率均在50%以上，對(duì)草莓疫霉菌和茄褐紋擬莖點(diǎn)霉菌的抑菌率均大于70%，但對(duì)草莓疫霉菌的抑制效果最好，抑菌率為（75.23±0.73）%；對(duì)大麗輪枝菌的抑菌率最低，但也達(dá)到了（53.79±1.74）%；說(shuō)明菌株XS-4具有廣譜抑菌活性且抑菌效果較好（表4）。

2.4 菌株XS-4對(duì)茶炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

掃描電鏡觀察結(jié)果表明，菌株XS-4與茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌共培養(yǎng)后，茶炭疽病菌的菌絲生長(zhǎng)受到抑制，與對(duì)照組相比，處理組菌絲之間相互緊緊纏繞在一起，菌絲發(fā)生變形、皺褶、干癟等現(xiàn)象（圖4）。

孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，拮抗菌XS-4

發(fā)酵液能抑制茶炭疽病菌的孢子萌發(fā)，其抑制率為62.48%，且顯微鏡下觀察到對(duì)照組和發(fā)酵液處理組的茶炭疽病菌孢子萌發(fā)狀況有顯著差異，處理組的孢子萌發(fā)芽管顯著短于對(duì)照組，孢子萌發(fā)速度表現(xiàn)較慢（圖5）。

2.5 菌株XS-4抑菌酵培養(yǎng)基及時(shí)間優(yōu)化

2.5.1 菌株XS-4發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

菌株XS-4發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明（圖6～7），使用KMB培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后，菌株XS-4無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌的抑菌活性最高，抑菌率達(dá)（67.73±0.72）%；其次為ISP2培養(yǎng)基，無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)茶炭疽病菌的抑菌率為（66.08±0.61）%，但與KMB無(wú)顯著性差異；而使用玉米培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后的無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)茶炭疽病菌的抑菌率很低，使用玉米培養(yǎng)基發(fā)酵后的無(wú)菌濾液對(duì)茶炭疽病菌的抑菌率僅為（3.35±0.81）%。因此，菌株XS-4的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為KMB培養(yǎng)基。

2.5.2 菌株XS-4發(fā)酵時(shí)間

菌株XS-4在KMB培養(yǎng)基中分別發(fā)酵培養(yǎng)4、5、6、7、8、9 d，所獲得的無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌的抑菌活性影響，前7 d不同發(fā)酵天數(shù)間無(wú)顯著差異，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延遲略有增加，在7 d時(shí)其抑菌活性最高（68.02±0.81）%，在發(fā)酵培養(yǎng)8 d后無(wú)菌濾液抑菌率有所下降，與前7 d的相比達(dá)顯著水平，但抑菌率仍保持在60%以上（圖8）。

2.6 菌株XS-4無(wú)菌發(fā)酵液穩(wěn)定性

菌株XS-4無(wú)菌發(fā)酵液穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)pHlt;7時(shí)，其抑菌活性隨pH降低而降低；在pHgt;7時(shí)，其抑菌活性隨pH升高而顯著降低，說(shuō)明強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均會(huì)影響其抑菌活性（圖9A）。菌株XS-4無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)紫外照射穩(wěn)定性較好，在經(jīng)紫外照射5 h后，其對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌的抑菌率仍大于55%（圖9B）。菌株XS-4無(wú)菌發(fā)酵液具有較好的熱穩(wěn)定性，在經(jīng)120 ℃處理后，其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)茶炭疽病菌的抑菌率仍大于50%（圖9C）。菌株XS-4無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)蛋白酶K及胃蛋白酶穩(wěn)定，但對(duì)胃蛋白酶相對(duì)更穩(wěn)定，其無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)胃蛋白酶處理后，其抑菌率仍大于65%（圖9D）。

2.7 菌株XS-4抑菌特性

2.7.1 菌株XS-4代謝物抑菌活性

菌株XS-4代謝物抑菌活性測(cè)定結(jié)果表明，其揮發(fā)性代謝物對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌具有一定抑制作用，抑菌率為47.40%（圖10A）；而其非揮發(fā)性代謝物對(duì)茶炭疽病菌的抑菌效果更好，處理組病原菌的菌落生長(zhǎng)緩慢，在含非揮發(fā)性代謝物的平板上培養(yǎng)5 d后，處理組病原菌的菌落生長(zhǎng)直徑僅為11.06 mm，對(duì)茶炭疽病菌的抑菌率達(dá)到81.92%（圖10C）。

2.7.2 菌株XS-4產(chǎn)降解酶能力

在淀粉瓊脂培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基和APB培養(yǎng)基上，菌株XS-4能產(chǎn)生很明顯的水解圈，說(shuō)明其具有產(chǎn)淀粉水解酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶的能力（圖11）；在羧甲基纖維素培養(yǎng)基上，經(jīng)剛果紅染色、NaCl脫色后，菌株XS-4能夠產(chǎn)生較明顯的水解圈，說(shuō)明其具有產(chǎn)生纖維素酶的能力（圖11D）；而在膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上無(wú)水解圈產(chǎn)生，表明其不能產(chǎn)幾丁質(zhì)酶。

2.7.3 菌株XS-4的nrps及pks檢測(cè)結(jié)果

PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在菌株XS-4中可以檢測(cè)到pks-Ⅰ和pks-Ⅱ，但未檢測(cè)到nrps（圖12），表明菌株XS-4具有聚酮合成酶相關(guān)基因。將pks-Ⅰ及pks-Ⅱ基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似度比對(duì)，顯示pks-Ⅰ與S. nojiriensis（CP071139.1）的Ⅰ型聚酮合成酶基因相似度為90.72%，pks-Ⅱ與S. katra的Ⅱ型聚酮合成酶基因相似度為89.56%（CP020043.1），表明菌株XS-4含有編碼聚酮類抗菌物質(zhì)合成基因，從而產(chǎn)生聚酮類抗菌物質(zhì)。

3 討論

鏈霉菌是植物病害生物防治中一類重要的微生物，拮抗菌的篩選鑒定是開(kāi)發(fā)茶炭疽病生物防治資源的重要前提，形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定及分子生物學(xué)鑒定是鑒定拮抗菌株種屬分類的主要方式。本研究分離篩選得到1株對(duì)茶炭疽病菌刺盤(pán)孢菌具有良好拮抗作用的鏈霉菌XS-4，并且對(duì)其他8種植物病原菌均具有較好的抑制效果，再結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特征，以及16 S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，將菌株XS-4鑒定為多產(chǎn)色鏈霉菌（S. polychromogenes）。

微生物發(fā)酵是微生物獲得代謝產(chǎn)物的主要方法，不同的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵時(shí)間會(huì)對(duì)代謝產(chǎn)物的活性有不同程度的影響，適宜的發(fā)酵條件能夠促進(jìn)菌株抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生[32-34]。有研究通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化得到了菌株的最佳發(fā)酵條件，在最佳發(fā)酵條件下獲得的發(fā)酵濾液對(duì)病原菌的抑菌效果最好[35]，本研究通過(guò)對(duì)菌株XS-4的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行篩選，表明了菌株XS-4對(duì)茶炭疽病菌具有最佳抑菌活性的發(fā)酵培養(yǎng)基為KMB培養(yǎng)基，最佳發(fā)酵時(shí)間為7 d。無(wú)菌發(fā)酵液的穩(wěn)定性研究對(duì)后續(xù)應(yīng)用具有重要意義，暗藍(lán)色鏈霉菌（S. caeruleatus）抑菌物質(zhì)耐堿但對(duì)酸性環(huán)境敏感，具有較好的熱、光及儲(chǔ)藏溫度穩(wěn)定性[36]；唐德鏈霉菌（S. tendae）對(duì)溫度、pH、紫外照射均具有較好的穩(wěn)定性[37]；本研究發(fā)現(xiàn)菌株XS-4無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)溫度、紫外照射、pH、蛋白酶均具有較好的穩(wěn)定性，為菌株XS-4發(fā)酵液抑菌活性成分分離純化提供了相關(guān)理論依據(jù)。

病原菌分生孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)能力在其病害循環(huán)周期中非常重要[26]，本研究表明，菌株XS-4的發(fā)酵液對(duì)茶炭疽病菌分生孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用，經(jīng)發(fā)酵液處理后病原菌孢子萌發(fā)速度變慢。于妍華等[38]研究表明，病原菌細(xì)胞壁物質(zhì)成分容易被胞外水解酶分解，從而使病原菌菌絲崩解。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株XS-4能產(chǎn)生淀粉水解酶、蛋白酶、纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶等降解酶，能夠使茶炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)受到抑制，病原菌菌絲之間相互緊緊纏繞、菌絲變形，說(shuō)明這些胞外降解酶在菌株XS-4抑制茶炭疽病菌生長(zhǎng)過(guò)程中可能起到了重要作用。菌株的不同類型代謝產(chǎn)物抑菌活性測(cè)定對(duì)后續(xù)應(yīng)用具有重要意義[39]，本研究表明，菌株XS-4的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)茶炭疽病菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，為后續(xù)分離抗茶炭疽病菌的活性代謝產(chǎn)物提供了相關(guān)的理論支持。鏈霉菌主要是通過(guò)聚酮合成酶和非核糖體多肽合成酶途徑合成抑菌活性物質(zhì)[40]，S. stelliscabiei具有pks-Ⅰ和pks-Ⅱ抗菌物質(zhì)合成酶基因[15]，S. albospinus具有nrps和pks等關(guān)鍵基因[38]，本研究發(fā)現(xiàn)菌株XS-4具有聚酮合成酶途徑相關(guān)基因pks-Ⅰ及pks-Ⅱ，可能主要是通過(guò)聚酮合成酶途徑來(lái)合成聚酮類抑菌物質(zhì)，從而發(fā)揮其抗菌作用。有研究表明，S. nojiriensis能產(chǎn)生具有廣譜抗菌活性的吩嗪類化合物[41-42]，S. katra對(duì)多種植物病原菌具有廣譜抗性[43]。序列比對(duì)表明，pks-Ⅰ與S. nojiriensis的Ⅰ型聚酮合成酶基因、pks-Ⅱ與S. katra的Ⅱ型聚酮合成酶基因具有良好的同源性，說(shuō)明菌株XS-4可能產(chǎn)生與S. nojiriensis和S. katra類似的抗菌代謝產(chǎn)物，但具體抑菌成分及其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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