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    β-環(huán)糊精-聚乙二醇-7-乙基-10-羥基喜樹堿膠束在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究

    2024-05-14 00:49:56彭于之姜良竹徐傳錫王志強孫勇兵
    現(xiàn)代藥物與臨床 2024年4期
    關(guān)鍵詞:藥動學(xué)小檗內(nèi)標(biāo)

    彭于之 ,姜良竹 ,徐傳錫 ,王志強,孫勇兵*

    1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心,江西 南昌 330004

    2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江西 南昌 330004

    伊立替康是喜樹堿類拓撲異構(gòu)酶I 抑制劑[1],用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、胰腺癌等的臨床治療。伊立替康本質(zhì)上是一種前藥,需要在羧酸酯酶作用下轉(zhuǎn)化為活性代謝物7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN38)才能發(fā)揮療效[2]。然而,僅有2%~8%的伊立替康可轉(zhuǎn)化為活性的SN38。SN38 在多種腫瘤細胞株上表現(xiàn)出比伊立替康高10~1 000 倍的抗腫瘤活性[3-5]。直接用SN38 作為抗癌藥物無需體內(nèi)酯酶的激活,可以克服伊立替康的代謝激活缺陷。目前開發(fā)SN38靶向給藥系統(tǒng)已成為大型制藥企業(yè)競相開展的重要課題。浙江海正藥業(yè)開發(fā)的SN38 膠束制劑PEGSN38 已經(jīng)進入了I 期臨床[6-7];日本化藥株式會社開發(fā)的載SN38 膠束制劑NK012 已經(jīng)進入II 期臨床,而且被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)作為治療非小細胞肺癌的治療藥物[8-9]。SN38 脂質(zhì)體的研究也是一個熱門[10-11]。在前期研究中,本課題組以β-環(huán)糊精-聚乙二醇作為親水端,通過酯鍵將SN38 的20位羥基與β-環(huán)糊精-聚乙二醇相連,構(gòu)建了兩親性聚合物β-環(huán)糊精-聚乙二醇-7-乙基-10-羥基喜樹堿膠束(β-CD-PEG-SN38),該聚合物能在水性介質(zhì)中自組裝成100 nm 左右的膠束。為了更好地了解β-CDPEG-SN38 在體內(nèi)的動態(tài)行為,開展其的藥動學(xué)研究是非常有必要的。本研究建立了HPLC-MS/MS 法測定大鼠血漿中游離型和鍵合型SN38,考察了β-CD-PEG-SN38 膠束在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué),以期為新藥開發(fā)提供更多的支持。

    1 儀器和材料

    Nexera LC-40 超高效液相系統(tǒng)(配備自動進樣器和二元泵,日本Shimadzu 公司),API4500 三重四級桿質(zhì)譜儀(美國AB Sciex 公司),ST8R 超高速離心機(美國Thermo Fisher 公司)。

    SN38 原料藥[質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于 99.8%,批號20221005,凱立德生物醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限公司],鹽酸小檗堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99.5%,批號20221021,江西本草天工科技有限公司)。甲醇、乙腈(色譜級,美國Fisher Scientific 公司),甲酸(色譜級,上海麥克林公司),純凈水(自制),其余試劑均為分析純。

    β-CD-PEG-SN38 膠束由江西中醫(yī)藥大學(xué)自制,HPLC 法測得SN38 的載藥量為11.2%。SD 大鼠由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,動物使用許可證號SYXK(贛)2022-0002。藥動學(xué)實驗得到江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

    2 方法和結(jié)果

    2.1 色譜和質(zhì)譜條件

    色譜條件:月旭Welch C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相為水(含0.1%的甲酸溶液,A)-乙腈(含0.1%的甲酸溶液,B),梯度洗脫(洗脫程序為0~0.4 min,5% B;0.4~4.5 min,5%~80% B;4.51~6.0 min,80%~5% B);柱溫是40 ℃;體積流量0.2 mL/min;進樣量是1 μL。

    質(zhì)譜條件:ESI 源,正離子檢測,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式掃描;離子通道:393.1→349.1(SN38),336.1→320.0(內(nèi)標(biāo)小檗堿)。源電壓為5 500 V,Gas1(N2)為60 psi(1 psi=6 895 Pa),Gas2(N2)為60 psi,離子源溫度是600 ℃;Curtain gas(N2)為40 psi,CAD Gas(N2)為9 psi。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)量控制(QC)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取SN38 對照品適量,用70%甲醇溶液制備272.0 μg/mL 儲備液,然后用70%甲醇溶液依次稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液,SN38 的質(zhì)量濃度分別為68.0、340.0、680.0、1 360.0、2 720.0、5 440.0、13 600.0、27 200.0、43 520.0、54 400.0 ng/mL。按照同樣的方式制備SN38 低、中、高質(zhì)量濃度(136.0、27 200.0、43 520.0 ng/mL)的QC 標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有溶液置于冰箱(4 ℃)保存。

    2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取小檗堿對照品適量,用70%甲醇溶液制備400 μg/mL 儲備液,然后用70%甲醇溶液稀釋制備250 ng/mL 內(nèi)標(biāo)溶液,置于冰箱(4 ℃)保存。

    2.3 血漿樣品的處理

    2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和QC 血漿樣品的制備 取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和QC 工作溶液10 μL,置于具塞玻璃試管中,用氮氣吹干,加入空白血漿200 μL,配制SN38 質(zhì)量濃度在3.4~2 720.0 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品,同時制備SN38 低、中、高質(zhì)量濃度分別是6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的血漿QC 樣品。

    2.3.2 血漿樣品的制備 將40 μL 血漿樣品置于1.5 mL 離心管中,加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿工作溶液、20 μL 水,渦旋2 min,加入330 μL 甲醇溶液,渦旋5 min,于4 ℃、10 000 r/min 離心8 min,取上清液,即得游離型SN38 測定的血漿樣品溶液。將40 μL 血漿樣品置于1.5 mL 離心管中,加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 μL,23 ℃孵育10 min,然后加入1 mol/L 鹽酸溶液10 μL,再加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿工作溶液,渦旋2 min,加入330 μL 甲醇溶液,渦旋5 min,于4 ℃、10 000 r/min 離心8 min,取上清液,即得SN38 總質(zhì)量濃度(鍵合型和游離型之和)測定的血漿樣品溶液。質(zhì)量濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點的樣品用空白血漿稀釋10 倍后測定。

    2.4 方法學(xué)試驗

    2.4.1 方法選擇性 取6 個不同來源的大鼠空白血漿40 μL,除不加入內(nèi)標(biāo)小檗堿溶液(補加70%甲醇10 μL),其余按照2.3.2 項下方法操作,得空白血漿樣品;取含SN38 6.8 ng/mL 的低質(zhì)量濃度QC樣品40 μL,加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿工作溶液,其余按照2.3.2 項下方法操作,得低質(zhì)量濃度QC 樣品;取受試大鼠給藥后的血漿40 μL,按照2.3.2 項下方法操作,得大鼠給藥樣品。取各樣品進樣測定,色譜圖見圖1。可以看出SN38 的保留時間為3.923 min,內(nèi)標(biāo)物小檗堿的保留時間為3.805 min,血漿中的內(nèi)源性成分不干擾SN38、小檗堿的測定。

    圖1 空白血漿(A)、QC 樣品(B)和大鼠給藥樣品(C)的MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of blank plasma (A),QC sample (B),and sample from rat (C)

    2.4.2 線性回歸曲線方程 取標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品40 μL,加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿溶液,按2.3.2 項下方法操作,每個質(zhì)量濃度進行雙樣本分析,分別以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),以待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比(y)為縱坐標(biāo),以加權(quán)(y=1/x2)最小二乘法進行線性回歸,得典型的線性回歸曲線方程y=4.356×10-4x+2.43×10-4,r=0.992 3,結(jié)果表明SN38 的血漿質(zhì)量濃度在3.4~2 720.0 ng/mL 線性關(guān)系良好。

    2.4.3 精密度和準(zhǔn)確度試驗 精確配制6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的血漿樣品,各5 份,按2.3.2項下方法操作,測定藥物質(zhì)量濃度,同一個質(zhì)量濃度樣品每隔1 h 測定1 次,共3 次,進行日內(nèi)精密度計算;每隔1 d 測定1 次,共3 次,進行日間精密度計算,結(jié)果見表1。在3 種質(zhì)量濃度下,日內(nèi)精密度小于6.5%,日間精密度小于6.3%。

    表1 精密度試驗結(jié)果(,n=5)Table 1 Results of precision test (,n=5)

    表1 精密度試驗結(jié)果(,n=5)Table 1 Results of precision test (,n=5)

    分別配制6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 血漿樣品,各5 份,按2.3.2 項下方法操作,按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算質(zhì)量濃度和準(zhǔn)確度,見表2。根據(jù)藥物臨床前藥動學(xué)指導(dǎo)原則,準(zhǔn)確度應(yīng)在85%~115%,RSD 值應(yīng)小于15%,3 種質(zhì)量濃度下準(zhǔn)確度均符合要求。

    表2 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果(,n=5)Table 2 Results of accuracy test (,n=5)

    表2 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果(,n=5)Table 2 Results of accuracy test (,n=5)

    2.4.4 方法提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 配制SN38 質(zhì)量濃度分別是6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的QC 血漿樣品。取血漿樣品40 μL,加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿溶液,其余按2.3.2 項下方法操作,測得峰面積A1;另取空白血漿40 μL,先經(jīng)甲醇沉淀后,加入QC 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,制備未經(jīng)提取的QC 樣品,測得峰面積A2;取混合后的QC 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10 μL,除以水代替空白基質(zhì)外,其余按2.3.2 項下操作,制備無基質(zhì)的QC 樣品,測得峰面積A3。以提取后的樣品峰面積A1除以未經(jīng)提取的樣品峰面積A2計算待測物SN38 和內(nèi)標(biāo)小檗堿的回收率。以未經(jīng)提取的樣品峰面積A2除以無基質(zhì)樣品峰面積A3分別計算待測物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果見表3。SN38 的提取回收率在88.5%~95.7%,基質(zhì)效應(yīng)在96.4%~103.2%。內(nèi)標(biāo)小檗堿的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)分別是92.1%、98.3%。

    表3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗結(jié)果(,n=5)Table 3 Result of extraction and matrix effect (,n=5)

    表3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗結(jié)果(,n=5)Table 3 Result of extraction and matrix effect (,n=5)

    2.4.5 穩(wěn)定性試驗 配制SN38 質(zhì)量濃度分別是6.8、2 176.0 ng/mL 的血漿樣品,考察樣品室溫放置2 h、3 個凍融循環(huán)(-20~23 ℃)、4 ℃放置24 h、長期放置30 d(-20 ℃)的穩(wěn)定性,以及處理后的樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果見表4。

    表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(,n=5)Table 4 Result of stability (,n=5)

    表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(,n=5)Table 4 Result of stability (,n=5)

    2.5 藥動學(xué)研究

    取SD 大鼠12 只,實驗前禁食給水過夜,隨機分成2 組。大鼠iv β-CD-PEG-SN38 膠束溶液,劑量以SN38 計為6 mg/kg,給藥后觀察大鼠的腹瀉情況,同時用乙醚麻醉大鼠,在5、15、30、45 min 以及1、1.5、2、3、4、6、8、10、24、48 h 眼眶取血0.2 mL。在4 ℃、2 000 r/min 條件下離心10 min,分離血漿,并于-20 ℃冰箱中保存待測。

    將同一份血漿分為兩份,各40 μL,按照2.3.2項下方法處理,其中1 份用來測定血漿中游離型的SN38 質(zhì)量濃度,另1 份用來測定血漿中SN38 總質(zhì)量濃度(鍵合型和游離型之和),其中血漿中SN38的總質(zhì)量濃度減去游離型的SN38 質(zhì)量濃度就是鍵合型的SN38 質(zhì)量濃度。

    利用Das 軟件計算β-CD-PEG-SN38 膠束溶液中SN38 的藥動學(xué)參數(shù)。平均血藥濃度-時間曲線見圖2,主要藥動學(xué)參數(shù)見表5。結(jié)果發(fā)現(xiàn),利用Das 軟件處理藥動學(xué)數(shù)據(jù),三室模型能最佳的進行藥動學(xué)數(shù)據(jù)的擬合。大鼠iv β-CD-PEG-SN38 膠束溶液后,游離型SN38 和鍵合型SN38 的AUC 分別是1 490.7、5 060.3 ng/(mL·h),在大鼠血漿中占主導(dǎo)的是鍵合型的SN38。

    表5 藥動學(xué)參數(shù)()Table 5 Pharmacokinetics parameters ()

    表5 藥動學(xué)參數(shù)()Table 5 Pharmacokinetics parameters ()

    圖2 大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時間曲線(,n=6)Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of SN38 in rats (,n=6)

    3 討論

    本研究建立了測定血漿中SN38 質(zhì)量濃度的HPLC-MS/MS 方法,通過堿性水解的方法將鍵合型的SN38 從β-CD-PEG-SN38 膠束上斷裂出來,血漿中SN38 的總質(zhì)量濃度減去游離型的SN38 質(zhì)量濃度就是鍵合型SN38 的質(zhì)量濃度。利用沉淀蛋白法處理樣品,操作簡單;方法的基質(zhì)效應(yīng)很低,適合高通量的藥物測定。

    聚合物膠束制備工藝簡單,膠束能以一個完整的形式達到腫瘤部位,實現(xiàn)腫瘤靶向性。兩親性聚合物膠束的藥動學(xué)研究是一個具有挑戰(zhàn)性的難題。從本研究結(jié)果可以看出,鍵合型SN38 質(zhì)量濃度顯著高于游離SN38 的質(zhì)量濃度,說明膠束在血漿中具有較好的穩(wěn)定性,SN38 會更多地以膠束的形式靶向腫瘤部位。鍵合型SN38 的表觀分布容積大,說明膠束在組織中尤其是腫瘤組織中分布較多[7]。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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