超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定水稻中氟酮磺草胺及其代謝物的殘留

陳國峰，滕 瑤，劉 峰，張曉波，董見南，黃文功，蘭 靜

（黑龍江省農業(yè)科學院農產品質量安全研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

氟酮磺草胺（C14H13F3N4O5S），化學名稱為2-［（4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基）羰基］-1，1，6′-三氟-N-甲基甲磺酰苯胺是由拜耳作物科學公司于2010 年開發(fā)的一種高效、低毒、高選擇性的水田出苗前和出苗后磺酰胺除草劑［1-3］。該磺胺類除草劑是日本組合化學公司繼嘧啶類除草劑之后開發(fā)的第2 種除草劑。氟酮磺草胺為乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑，通過阻止纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成，抑制細胞分裂和分生組織生長，從而導致敏感雜草枯死［4］。該除草劑對水稻具有較高的選擇性，可有效防治水稻田禾本科雜草、莎草和闊葉雜草，對水稻田難防雜草和對磺酰脲類產生抗性的雜草有效。

水稻（Oryza sativaL.）是水稻是世界上最主要的糧食作物之一［5］，目前，世界一半以上的人口、中國60%以上的人口以稻米為主食。水稻作為我國的四大主要糧食作物之一，水稻的安全生產關乎著整個國家糧倉的安全和社會的穩(wěn)定［6］。然而在水稻的生產過程中，農藥的使用卻是必不可少的，特別是不合理不規(guī)范的農藥使用會對水稻的生態(tài)環(huán)境產生嚴重的后果，從而對危害到水稻的安全消費，并通過食物鏈最終影響人類的生存安全［7-8］。

圖1 氟酮磺草胺、BCS AA10030和BCS-CS64946結構式

目前國內外對于氟酮磺草胺的研究主要集中其以及復配劑型對水稻田雜草的防治效果上［9-13］，還有部分學者研究了氟酮磺草胺的施用對后茬作物的影響［14-15］， 肖祖菊等人研究了氟酮磺草胺懸浮劑的高效液相色譜質量分數(shù)測定［16］，Chen 等人研究了氟酮磺草胺在水中的光解及代謝產物的鑒定研究［17］。而目前對于能夠同時測定水稻基質中氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030 和BCS-CS64946 的方法卻未見報道，并且沒有能夠系統(tǒng)的評估氟酮磺草胺及其代謝物在田間試驗條件下的膳食風險評估。本研究的目的是（1）建立一種簡單，快速，有效的分析方法，通過UPLC-MS/ MS 同時測定糙米、稻殼、秸稈中氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030 和BCSCS64946 的殘留量；（2）研究田間施用19%氟酮磺草胺懸浮劑在糙米中的最終殘留；（3）評估氟酮磺草胺及其代謝物在膳食中的攝入風險。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 氟酮磺草胺（純度98.7%）、BCS AA10030（97.8%）和BCS-CS64946（91.2%）。色譜純乙腈、甲酸。分析純的乙腈和氯化鈉，超純水（KHS-100 純水儀制備）。石墨化碳黑（GCB）、N-（正丙基）乙二胺（PSA）、C18以及有機系濾膜（尼龍，0.22μm）。

X-TQD三重四級桿質譜，配有電噴霧離子源（ESI）美國Waters 公司；BT 2202 S 電子天平 德國賽多利公司；CF15RX 高速離心機 日本日立公司；HS501振蕩器 德國IKA公司。

1.2 測定方法

1.2.1 樣品前處理 分別稱取糙米（10.0 g）、稻殼（2.0 g）和秸稈（2.0 g）樣品于50 mL 離心管中，依次加入10 mL去離子水和20 mL乙腈，振蕩30 min，加入3 g NaCl，渦旋10 min，以10 000 r/min的速度離心10 min，待凈化。將1 mL糙米和稻殼上層乙腈相轉移至稱有50 mg PSA 的2 mL 離心管中，1 mL 秸稈上層乙腈相轉移至稱有25 mg GCB的2 mL 離心管中，渦旋1 min，10 000 r/min 離心3 min，取上清液經0.22 μm 有機系濾膜過濾，待測。

1.2.2 標準曲線配制 氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030 和BCS-CS64946 的標樣溶液配制：分別稱取氟酮磺草胺標準品10.1 mg、BCS AA10030標準品10.2 mg、BCS-CS64946 標準品10.9 mg（精確值0.1 mg）于3 個不同的10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度線，配制成1 000 mg/L 的標準儲備液。將上述3 種化合物的工作液用乙腈稀釋配得100 mg/L 的標準混合液，保存在4℃下直到使用。

1.2.3 儀器條件 配備有超高效液相色譜（HClass，Waters）的三重四極桿串聯(lián)質譜儀（UPLCMS/MS；Agilent）分析氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030 和BCS-CS64946。 配Acquity UPLC?BEH T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）用于液相色譜分離，柱溫為30℃，進樣體積為10 μL，流速0.3 mL/min。流動相由0.1%的甲酸在水（A）和乙腈（B）的混合溶劑中組成。分離通過梯度洗脫，洗脫程序：0～1.0 min，10%B；1.0～1.2 min，10%～90%B；1.2～3.0 min，90%B；3.0～3.5 min，90%～10%B；3.5～5.0 min，10%B。離子源：電噴霧離子源ESI 源；掃描方式：正離子掃描；毛細管電壓：3 KV；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流量：650 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；檢測方式：多重反應監(jiān)測（MRM），（表1）。

表1 氟酮磺草胺及其代謝物的質譜參數(shù)

1.2.4 定量限（LOQ） 和檢測限（LOD） 以3 倍的信噪比（S/N）來確定目標化合物的LOD，以最小添加回收濃度作為方法的定量限（LOQ）［18］。為了確定LOD，將混合的標準工作溶液（1.0 mL）在旋轉蒸發(fā)儀中干燥，然后用糙米、稻殼和秸稈基質重新溶解并稀釋，直到每種目標化合物的S/N 比為3。為了確定糙米、稻殼和秸稈中的氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030和BCS-CS64946的LOQ，將一系列糙米、稻殼和秸稈樣品加標最低濃度的工作溶液（0.01 mg/L），按照上述的方法進行提取和凈化，逐級稀釋直至目標化合物的S/N比為10。

1.2.5 正確度和精密度測定 將混有氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030和BCS-CS64946的標準溶液分別添加3 組濃度到空白糙米、稻殼和秸稈樣品中，每檔濃度重復5 次，用上述分析方法測定并計算相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的確定 根據(jù)已經配制好的氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030和BCS-CS64946溶劑標準工作溶液，根據(jù)其分子結構，通過適當?shù)恼x子或者負離子的模式對其進行母離子掃描，結合其分子量，確定母離子的質核比。通過調節(jié)儀器的錐孔電壓來優(yōu)化母離子響應的最大化。同時通過對碰撞室增加氬氣并通過調節(jié)碰撞能量來選擇子離子，選擇在一定的碰撞能量下最穩(wěn)定和響應值最高的兩個分別對兩個子離子進行碰撞能量的優(yōu)化，找到子離子響應最大時的碰撞能量，最后選擇響應較高的子離子作為定量子離子，使儀器靈敏度達到最佳［19］。氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030和BCS-CS64946的母離子、錐孔電壓、子離子、碰撞電壓（表1），溶劑標準工作溶液譜圖（圖2）。

圖2 氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030和BCS-CS64946的溶劑色譜圖

2.2 提取與凈化 本研究對氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030 和BCS-CS64946 的提取溶劑甲醇、丙酮、50%乙腈水、純乙腈進行了優(yōu)化。用混合標準溶液加標糙米、稻殼和秸稈的粉碎樣品中，以使上述3 種介質中氟酮磺草胺及其代謝物BCSAA10030和BCS-CS64946的含量均為0.1mg/kg。（圖3）使用甲醇對氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 這3 種化合的提取率在67.2%～78.4%之間；丙酮對上述3 種化合物的提取率在101.5%～110.07%之間，這可能與丙酮能夠提取糙米中的大多數(shù)物質，且此類脂類物質對氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 的定性和定量均有基質增強的效應；純乙腈的提取率在80.8%～89.4%之間，而50%乙腈水的提取率則在98.2%～100.1%之間。因此，50%乙腈水是提取糙米中氟酮磺草胺、BCS AA10030和BCS-CS64946的最佳溶劑，因為乙腈不僅能夠可有效提取大多數(shù)樣品中大多數(shù)農藥及其代謝物殘留，且與目標化合物一起提取出來且影響其定性和定量結果的雜質較少，最為重要的是，加入50%水和氯化鈉之后能夠產生鹽析的作用，最終達到去除部分水溶性雜質的目的。

圖3 優(yōu)化氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030和BCS-CS64946提取溶劑

目前，最主流的高效、便捷、迅速的前處理方法QuECHERS 中PSA，GCB，C18等是其最常用的分散固相萃取材料［20-21］。分別想10.0 g 糙米、2.0 g 稻殼和秸稈樣品中加入氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 混合標準儲備液，使得上述3 個化合物在糙米、稻殼和秸稈中的濃度均為0.1 mg/kg，先后加入20 mL蒸餾水，20 mL乙腈，振蕩提取30 min，加入5 g NaCl，再振蕩10 min，3 500 r/min 離心5 min，取上層乙腈提取液1 mL，在其中分別加入25、50、75、100 mg 的PSA、GCB 和C18研究其使用量對其基質溶液的凈化效果，其具體結果（表2）。在上述糙米的1 mL乙腈提取液中C18隨著使用量的增加回收率逐漸提高，當?shù)竭_50 mg 時，氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 的回收率達到最高，≥96.7%，隨著C18使用量逐漸增加，其回收率逐漸降低，這可能與C18的理化性質有關，C18能夠很好的吸附提取液中的非極性雜質，而氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 的極性也在極性和非極性之間，因此也會對氟酮磺草胺、BCS AA10030和BCS-CS64946 進行吸附。在上述糙米提取液中，當PSA 的用量在達到100 mg 時，上述3 種化合物的回收率才能達到最高，為95.7%。當1 mL稻殼提取物中的回收率也呈現(xiàn)隨著PSA 含量的增加而逐漸提高并趨緩的規(guī)律，當PSA 的含量為50 mg 時，回收率和成本達到最優(yōu)的一個狀態(tài)，出現(xiàn)此類的情況主要是因為PSA 凈化劑含有兩個氨基能夠有效去除樣品中影響質譜測定的色素、酸類和糖類等極性的雜質，且對目標農藥和代謝物不具有吸附效果，降低了基質對信號響應的抑制。當每1 mL 秸稈基質提取液中用25 mg GCB 提取時，氟酮磺草胺、BCS AA10030和BCS-CS64946的回收率在91.6%～96.7%之間，當GCB 使用量的逐漸增加，其回收率均低于71.6%，上述的結果表明GCB在能夠有效的吸附雜質的同時也吸附了目標化合物氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946。同時方法的準確性和使用的成本，分別使用50 mg C18、50 mg PSA 和25 mg GCB分別凈化糙米、稻殼和秸稈中的雜質（表2）。

表2 糙米、稻殼和秸稈提取溶液中凈化劑PSA，C18和GCB的優(yōu)化

2.3 方法驗證 通過氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030 和BCS-CS64946 標準溶液濃度與定量離子峰面積作標準曲線，（表3）中顯示了乙腈中氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946 的回歸分析結果，相關系數(shù)（R）均＞0.997 0，這表明氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCS-CS64946在0.001～0.5 mg/L范圍內線性良好。

表3 氟酮磺草胺、BCS AA10030和BCS-CS64946的標準曲線和LOD

由表3 可見，在上述條件下，氟酮磺草胺在乙腈溶劑、糙米、稻殼和秸稈中的最低檢出量在5.9×10-4～1.7×10-3ng 之間，BCS AA10030 的最低檢 出 量 在1.0×10-3～3.7×10-3ng 之 間，而BCSCS64946 的最低檢出量在7.0×10-3～2.2×10-2ng 之間。本研究以最小添加回收濃度作為方法的定量限，在上述色譜條件下氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030 和BCS-CS64946 在糙米、稻殼和秸稈中的最低檢出濃度均為0.01 mg/kg。

通過重復（n=5）測量3 種不同分析物濃度下的回收率來評估該方法的準確性。糙米中氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030 和BCS-CS64946的平均回收率為96.9%～101.8%，相對標準偏差（RSD）分別為1.2%～5.6%（表4）。稻殼中上述3 種化合物的平均回收率在88.4%和103.0%之間，其相對標準偏差（RSD）在0.9%和6.8%之間。秸稈中氟酮磺草胺、BCS AA10030 和BCSCS64946 的平均回收率為90.3%～102.7%，相對標準偏差（RSD）在0.8%和9.3%之間。以上結果表明，該方法的精密度，重現(xiàn)性和靈敏度足以同時定量測定糙米、稻殼和秸稈中的氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030和BCS-CS64946殘留。

表4 氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030和BCS-CS64946的添加回收率

3 結論

本研究建立的一種能夠同時測定水稻糙米、稻殼和秸稈中的氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030 和BCS-CS64946，該方法具有簡單、高效、便捷、靈敏等優(yōu)點。該方法同時具有回收率高，準確性高和可重復性強等優(yōu)點。該方法完全能夠滿足農藥殘留分析要求，適用于大量水稻樣品中氟酮磺草胺及其代謝物BCS AA10030 和BCS-CS64946 的快速檢測，為政府監(jiān)管提供有效的檢測分析手段。