產(chǎn)香酵母菌丸麥曲固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)構(gòu)建及其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究

黃治國(guó)，張晴雯，鄭若欣，曾 波，任志強(qiáng)，鄧 杰，謝 軍*

（1.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；2.四川國(guó)檢檢測(cè)有限責(zé)任公司，四川 瀘州 646000；3.四川輕化工大學(xué) 中國(guó)輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000）

中國(guó)白酒以酒曲作為糖化發(fā)酵劑，并以獨(dú)特的釀造工藝區(qū)別于白蘭地、龍舌蘭、伏特加等其他世界著名蒸餾酒?！渡袝ふf(shuō)命篇》記載“若作酒醴，爾惟麹（曲）糵”表明在幾千年前我國(guó)先民就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了酒曲的重要性。酒曲歷經(jīng)上千年的發(fā)展與創(chuàng)新，已經(jīng)取得了顯著的成就，形成了以大曲、小曲和麩曲為主的常規(guī)曲藥種類，以及強(qiáng)化曲、純種曲、液體曲等新型曲藥[1]。目前，酒曲存在一些不足，如大曲雖具有豐富的酶系、菌系和物系，但制曲周期長(zhǎng)、制曲原料貴、儲(chǔ)存過(guò)程損失大以及用曲量大等，進(jìn)而導(dǎo)致酒企生產(chǎn)成本增加；小曲相較于大曲具有生產(chǎn)成本低、釀酒周期短等優(yōu)點(diǎn)，但小曲中菌群數(shù)量遠(yuǎn)低于大曲，尤其是產(chǎn)香微生物菌群[2-5]。鑒于傳統(tǒng)小曲制曲原料主要為大米，形成了糧食供應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)問(wèn)題，麩曲開始逐步替代小曲成為主流用曲之一。麩曲具有強(qiáng)糖化力、強(qiáng)發(fā)酵力、高出酒率等優(yōu)點(diǎn)，但也存在菌群?jiǎn)我?、產(chǎn)香力低導(dǎo)致基酒中風(fēng)味物質(zhì)遠(yuǎn)低于大曲酒等缺點(diǎn)[6]。為此，產(chǎn)香酵母菌逐漸成為中國(guó)白酒行業(yè)的關(guān)注焦點(diǎn)之一。從釀酒原料、釀造環(huán)境、曲藥、糟醅以及窖泥等來(lái)源中分離篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵和產(chǎn)香特性的酵母菌株，并將其應(yīng)用于白酒強(qiáng)化發(fā)酵是一個(gè)研究熱點(diǎn)[7-9]。李曉歡等[10]從大曲中篩選優(yōu)良釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），并將其接種于小麥粉制作酵母曲，優(yōu)化制曲工藝后釀酒酵母生物量為7.5×108CFU/g。夏玙等[11]復(fù)配麩皮、鮮酒糟、玉米粉并接種異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）制作麩曲，優(yōu)化培養(yǎng)條件后酵母生物量為3.12×108CFU/g。富志磊等[12]應(yīng)用異常威克漢姆酵母進(jìn)行白酒模擬固態(tài)發(fā)酵提升了白酒乙酸乙酯含量。

小麥?zhǔn)侵袊?guó)白酒大曲中主要的制曲原料，屬于經(jīng)驗(yàn)性制曲原料。有研究表明，去除部分皮層的小麥更適合微生物生長(zhǎng)[13-14]。傳統(tǒng)大曲的制作需要對(duì)小麥進(jìn)行粉碎、潤(rùn)濕、拌料、成型后進(jìn)行發(fā)酵，這導(dǎo)致大曲的制作需要人工進(jìn)行翻曲、打攏、收堆，存在極大的勞動(dòng)量需求，難以完全實(shí)現(xiàn)機(jī)械化?；诖?，本研究以丸麥制曲對(duì)小麥制曲工藝進(jìn)行簡(jiǎn)化。小麥去除皮層再經(jīng)過(guò)局部精制后的小麥籽粒即為“丸麥”，又稱“麥仁”。目前，國(guó)內(nèi)已有使用麥仁制曲以及利用麥仁曲制作醬油、面醬、食醋、生物飼料和釀酒的報(bào)道[15-17]，可見丸麥?zhǔn)且环N在發(fā)酵行業(yè)中具有可行性和實(shí)用價(jià)值的原料。國(guó)外也有類似丸麥曲生產(chǎn)的實(shí)例，如日本清酒曲以蒸制熟化的去皮大麥、大米等為原料，接種曲霉菌種（如白曲霉（Aspergillus kawachii）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、琉球曲霉（Aspergillus luchuensis））制作而成[18-20]。但大麥皮殼較多，經(jīng)過(guò)去皮處理產(chǎn)生的損耗相對(duì)小麥較多[21]。此外，大麥在中國(guó)的進(jìn)口率遠(yuǎn)超出口率，供銷不均，作為制曲原料成本較高[22]。

該研究以丸麥為制曲原料，以產(chǎn)香酵母菌為菌種發(fā)酵制備丸麥曲，首先根據(jù)淺盤生物反應(yīng)器原理構(gòu)建產(chǎn)香酵母丸麥曲固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)；然后接種產(chǎn)香酵母并監(jiān)測(cè)其在丸麥曲培養(yǎng)過(guò)程中生物量的變化建立酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，以此探索酒曲制作新技術(shù)和產(chǎn)香酵母的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)可行性，以期對(duì)產(chǎn)香酵母固態(tài)擴(kuò)大培養(yǎng)技術(shù)提供理論支撐，對(duì)中國(guó)白酒酒曲產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

丸麥（人工剔除不完整粒）：新野縣優(yōu)尚佳食品廠。

季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）DQ-10、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）DQ-02、馬爾克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）DQ-03、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）DQ-04：均分離自濃香型白酒大曲，現(xiàn)保藏于釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無(wú)水葡萄糖（分析純）、瓊脂粉（生化試劑）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基[23]：1%酵母浸粉，2%葡萄糖，2%蛋白胨。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基中添加2%瓊脂及0.01%氯霉素。

1.2 儀器與設(shè)備

ZXMP-R1430恒溫培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；LabServ-LS-O610干燥箱：美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 丸麥曲固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

由于丸麥曲從原料、菌種上均與現(xiàn)有的酒曲存在較大的差異，因此制曲所用設(shè)施及環(huán)境不能借用現(xiàn)有的制曲設(shè)備。為此，本研究特為丸麥曲設(shè)計(jì)了一套實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的固態(tài)發(fā)酵生物反應(yīng)器（以下簡(jiǎn)稱“反應(yīng)器”），結(jié)構(gòu)圖見圖1。該反應(yīng)器是由不銹鋼材料支撐的雙層淺盤式結(jié)構(gòu)。反應(yīng)器由蓋、物料層（具孔淺盤）、廢水層（無(wú)孔淺盤）三個(gè)部分組成。物料層高45 mm，內(nèi)徑300 mm，物料層的底部均勻分布2 mm孔，制曲時(shí)擬填充丸麥基質(zhì)20 mm，預(yù)留20～25 mm頂空。廢水層高40 mm，內(nèi)徑300 mm。蓋、物料層、廢水層皆具有卷邊。具孔淺盤與無(wú)孔淺盤的卷邊外翻，曲邊平蓋的卷邊內(nèi)扣。蓋與物料層卷邊之間形成一圈連續(xù)而彎曲的通風(fēng)口。在制曲過(guò)程中反應(yīng)器放置于恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中，可根據(jù)產(chǎn)香酵母菌的生長(zhǎng)情況及時(shí)調(diào)整溫度、濕度，盡可能地提高酵母菌在丸麥上的生物量。

圖1 雙層淺盤式丸麥曲固態(tài)發(fā)酵生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of double-layer tray bioreactors for Wanmai-Qu solid-state fermentation

1.3.2 丸麥曲的制作工藝

取一環(huán)預(yù)活化酵母接種于YPD培養(yǎng)基中，在30 ℃、170 r/min的條件下擴(kuò)大培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后使用顯微鏡進(jìn)行鏡檢確保無(wú)雜菌后在3 000 r/min條件下離心5 min，收集酵母細(xì)胞沉淀。然后，加入等體積的無(wú)菌水復(fù)懸酵母細(xì)胞，得到菌懸液備用。

以無(wú)菌水沒水浸泡丸麥30 min，瀝水，經(jīng)沸水浴15 s處理后于無(wú)菌環(huán)境攤晾至室溫，而后接種1%菌懸液，混勻，在無(wú)菌反應(yīng)器的具孔淺盤中鋪成2 cm厚，于溫度30 ℃、相對(duì)濕度（relative humidity，RH）80%條件下培養(yǎng)26 h即得到丸麥曲。

1.3.3 酵母菌計(jì)數(shù)

丸麥曲發(fā)酵開始后每隔2 h取樣，參考GB/T 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》中的方法[24]，對(duì)丸麥曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。操作如下：取10 g樣品，加入90 mL無(wú)菌生理鹽水，170 r/min振蕩30 min，制成1∶10待測(cè)樣液。取100 μL待測(cè)樣液至900 μL無(wú)菌生理鹽水中，充分振蕩，并以此操作進(jìn)行10倍遞增系列梯度稀釋。選擇適宜稀釋度待測(cè)樣液取100μL涂布于計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，平行測(cè)定3次取平均值。

1.3.4 酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立

為描述丸麥曲固態(tài)發(fā)酵中酵母菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，采用Logistic模型擬合丸麥曲固態(tài)發(fā)酵中酵母菌生長(zhǎng)過(guò)程[25-26]，Logistic方程如下：

當(dāng)t=0時(shí)X=X0，該方程的積分式為：

式中：X為菌體濃度，lg（CFU/g）；X0為t=0時(shí)菌體的初始濃度，lg（CFU/g）；Xm為菌體的最大濃度，lg（CFU/g）；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；t為培養(yǎng)時(shí)間，h。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 6.01、Excel 2016等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 丸麥曲固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)運(yùn)行結(jié)果

2.1.1 基質(zhì)三相結(jié)構(gòu)

相較于大曲、小曲以及麩曲的制曲原料，丸麥曲由于具有極高的完整性，屬于類似于散料的制曲原料。因此，在制曲過(guò)程中丸麥曲料堆實(shí)際是一個(gè)復(fù)雜的氣-液-固三相結(jié)構(gòu)（見圖2）。

圖2 丸麥基質(zhì)（a）與結(jié)構(gòu)（b）示意圖Fig. 2 Schematics of Wanmai substrate (a) and structure (b)

丸麥曲料堆中的三相結(jié)構(gòu)會(huì)隨著制曲的進(jìn)行產(chǎn)生波動(dòng)性變化，如附著于丸麥粒表面的水薄膜是不穩(wěn)定的，其中肉眼可觀測(cè)到的游離水隨著發(fā)酵的進(jìn)行會(huì)因?yàn)橥L(fēng)、溫度變化等而減少或消失。丸麥顆粒中的水分可能隨著酵母菌的生長(zhǎng)出現(xiàn)一定范圍的波動(dòng)變化，同時(shí)也會(huì)參加酵母菌生長(zhǎng)、繁殖、代謝過(guò)程中的物質(zhì)傳遞與反應(yīng)。丸麥在堆料過(guò)程中會(huì)自然形成空隙，形成空氣流動(dòng)的通道，為酵母菌生長(zhǎng)、繁殖過(guò)程中提供足夠的氧氣，形成了完整的氣相結(jié)構(gòu)。根據(jù)前期的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，該基質(zhì)滿足酵母菌丸麥曲制曲的需求，可以進(jìn)行后續(xù)的深入試驗(yàn)。

2.1.2 丸麥曲外觀與酵母活菌數(shù)

經(jīng)過(guò)丸麥曲固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)發(fā)酵后的四種產(chǎn)香丸麥曲見圖3。由圖3可知，丸麥曲具有較良好的外觀，顆粒分明，基質(zhì)無(wú)明顯塌陷，表明丸麥顆粒之間結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。顏色呈現(xiàn)較為均勻的淺黃色，具有適聞香氣。酵母菌在丸麥顆粒表面的生長(zhǎng)較均勻，菌落在胚芽部分較胚乳部分明顯集中。這可能是因?yàn)榕哐坎糠痔峁┝烁嗬诮湍妇L(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分。發(fā)酵結(jié)束后季也蒙畢赤酵母DQ-10、異常威克漢姆酵母DQ-02、馬爾克斯克魯維酵母DQ-03、漢遜酵母DQ-04四種產(chǎn)香酵母丸麥曲的酵母活菌數(shù)（以濕重計(jì)）分別達(dá)（6.03±0.32）×109CFU/g、（5.49±0.33）×109CFU/g、（4.52±0.25）×109CFU/g、（4.04±0.31）×109CFU/g，表明丸麥曲固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)運(yùn)行良好，可以為四株酵母在丸麥表面的生長(zhǎng)提供適合的環(huán)境且酵母菌可以在丸麥表面生長(zhǎng)到較高的密度。

圖3 四種產(chǎn)香酵母丸麥曲Fig. 3 Wanmai-Qu fermented with 4 aroma-producing yeasts

2.2 Logistic菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型建立與驗(yàn)證結(jié)果

利用DPS 6.01軟件對(duì)四種產(chǎn)香酵母丸麥曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程生物量監(jiān)測(cè)值（以干基計(jì)）進(jìn)行擬合，參數(shù)估計(jì)值見表1。

表1 Logistic方程參數(shù)估計(jì)值Table 1 Estimation of Logistic equation parameters

將表1參數(shù)代入公式（2）即可推導(dǎo)出季也蒙畢赤酵母DQ-10、異常威克漢姆酵母DQ-02、馬爾克斯克魯維酵母DQ-03、漢遜酵母DQ-04在丸麥曲固態(tài)發(fā)酵中的菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，分別為：

上述方程相關(guān)系數(shù)R2分別為0.963 4、0.968 8、0.979 9、0.983 7，P值均＜0.001，表明方程曲線擬合度較好。根據(jù)方程可得丸麥曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中酵母菌活菌數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間變化的擬合值，將擬合值與試驗(yàn)值進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見圖4。由圖4可知，4種產(chǎn)香酵母在丸麥上的生長(zhǎng)無(wú)明顯延滯期，其中酵母活菌數(shù)最高值均低于2.1.2中不間斷發(fā)酵26 h的丸麥曲。這可能是因?yàn)楸O(jiān)測(cè)取樣時(shí)丸麥顆粒之間相對(duì)運(yùn)動(dòng)，對(duì)顆粒表面的酵母菌施加了剪切力導(dǎo)致部分酵母菌死亡。計(jì)算四組試驗(yàn)值與擬合值之間的相對(duì)誤差可知，二值之間誤差均＜3%，說(shuō)明該模型可以較好地描述4種產(chǎn)香酵母菌在丸麥曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)特征。

圖4 丸麥曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中酵母菌活菌數(shù)的試驗(yàn)值與模型擬合值Fig. 4 Experimental value and fitted value of models for viable counts of yeasts during Wanmai-Qu solid-state fermentation

3 結(jié)論

本研究基于產(chǎn)香酵母丸麥曲工藝創(chuàng)新研究目的，搭建了丸麥曲固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)，創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)了一款用于丸麥曲培養(yǎng)的雙層式具蓋淺盤生物反應(yīng)器，可同時(shí)滿足減少發(fā)酵過(guò)程中的雜菌污染和收集廢水的需求；在構(gòu)建的發(fā)酵系統(tǒng)的基礎(chǔ)上探究了不同產(chǎn)香酵母菌的生長(zhǎng)情況。分離自濃香型白酒大曲的四種產(chǎn)香酵母在丸麥基質(zhì)上生長(zhǎng)良好，其生長(zhǎng)情況均符合Logistic模型，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.96，P值均＜0.001，模型擬合值與試驗(yàn)值間的相對(duì)誤差均＜3%，說(shuō)明該模型能較好地反映酵母菌在丸麥上的菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征。因此，丸麥作為一種顆粒狀固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，可以供應(yīng)產(chǎn)香酵母的增殖需求；產(chǎn)香酵母的酒曲化具有一定的可行性。