基于HS-SPME-GC-MS分析不同龍眼果酒中香氣成分

徐 佳，李嘉俊，朱文海，彭 萱，梁麗寶，傅 力*

（1.漯河食品職業(yè)學(xué)院 食品檢測(cè)系，河南 漯河 462000；2.韓山師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東 潮州 521041）

龍眼（Dimocarpus longanLour.）屬于無(wú)患子科（Sapindaceae Juss.）植物，主要分布在我國(guó)南部及西南部地區(qū)，是廣西、廣東、福建、海南等地的主要栽培果樹之一[1]。龍眼的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有“南方人參”之稱，其肉為白色，味甘、性平、無(wú)毒，具有抗菌、抑癌、降脂護(hù)心、增強(qiáng)記憶力及延緩衰老等功效[2]。近年來(lái)，關(guān)于龍眼品質(zhì)的國(guó)內(nèi)研究報(bào)道較多，張義[3]對(duì)不同地區(qū)、不同品種的龍眼汁香氣成分進(jìn)行研究，確定反式-羅勒烯、D-檸檬烯、γ-松油烯和乙醇這4種主要的揮發(fā)性物質(zhì)是龍眼中的香氣活性物質(zhì)，這對(duì)采摘后龍眼的深加工處理提供了有利的參考價(jià)值，為龍眼香氣成分的研究奠定了基礎(chǔ)。高蓓[4]優(yōu)化了采用固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）法檢測(cè)龍眼汁香氣成分的條件，同時(shí)分析了不同品種龍眼汁香氣成分以及它們和呈味物質(zhì)的相關(guān)性，結(jié)果表明，糖、酸主要與萜烯類和醇類物質(zhì)呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。

果酒可以提高水果營(yíng)養(yǎng)成分的利用率及附加值。目前對(duì)龍眼果酒的研究報(bào)道集中在龍眼果酒的風(fēng)味物質(zhì)、生產(chǎn)工藝及抗氧化活性等方面。邱松山等[5]采用二氯甲烷萃取龍眼酒中的香氣成分，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chro matography-mass spectrometry，GC-MS）鑒定出龍眼酒中含有49種揮發(fā)性物質(zhì)，主要風(fēng)味物質(zhì)有2,3-丁二醇、苯乙醇、乙酸乙酯；姚榮清等[6]采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選出龍眼酒最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度21 ℃，接種量0.20 g/L，糖度25%，檸檬酸添加量6 g/L，發(fā)酵時(shí)間10 d；冉娜等[7]研究表明，不同酵母對(duì)龍眼酒質(zhì)量有不同影響，酵母性狀的好壞直接影響果酒的口感和風(fēng)味；何思蓮等[8]研究表明，發(fā)酵能夠促使龍眼中的活性成分更好地溶出，增加果酒中的抗自由基能力，提高機(jī)體免疫機(jī)能；劉佳藝等[9]研究發(fā)現(xiàn)，龍眼酒經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，具有良好的抗氧化能力，能有效清除2,2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate），ABTS）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基并展現(xiàn)出較高的還原能力。因此，分析不同酵母發(fā)酵果酒的香氣成分，篩選出關(guān)鍵性香氣成分，對(duì)優(yōu)化發(fā)酵工藝、提高果酒品質(zhì)具有重要的參考意義，也能夠?yàn)辇堁酃频纳a(chǎn)和加工提供一定的技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

本研究以新鮮龍眼為原料，選用了三種不同酵母進(jìn)行發(fā)酵，采用頂空固相微萃取（head space-solid-phase microex traction，HS-SPME）富集釀造的龍眼果酒中的香氣成分，利用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對(duì)其香氣成分進(jìn)行定性定量分析，結(jié)合相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）篩選關(guān)鍵性香氣成分，以明確不同酵母釀造的龍眼果酒的香氣品質(zhì)特征，探究不同酵母所產(chǎn)生的香氣品質(zhì)差異形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為不同酵母釀造龍眼果酒品質(zhì)的化學(xué)判別、感官評(píng)價(jià)及龍眼果酒香氣品質(zhì)形成機(jī)理等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼：市售；釀酒酵母（LABA、L-EL、CRI）：安琪酵母股份有限公司；檸檬酸、蔗糖：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸：西隴科學(xué)股份有限公司；冰乙酸、葡萄糖：廣州化學(xué)試劑廠；酚酞、氯化鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5977A氣質(zhì)聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司；1300 SERIES A2凈化工作臺(tái)：賽默飛世爾科技有限公司；ZHWY-2102C恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SCM-1000手持糖度折光儀：韓國(guó)HM公司；SPME萃取頭（DVB/CAR/PDMS）：美國(guó)Supelco公司；PHS-3E酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 龍眼果酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：挑選龍眼，用清水清洗，去殼去核后切塊打漿，以水與龍眼果漿的比例為1∶1加水，添加白砂糖將發(fā)酵醪總糖提高至22%，同時(shí)加入4 g/L檸檬酸調(diào)至pH5.0，巴氏殺菌（90 ℃水浴20 min），冷卻至25 ℃左右。將0.15 g LABA、CRI和L-EL釀酒酵母分別溶于3 mL 5%蔗糖溶液中，于30 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)30 min活化，得到酵母活化液，然后將酵母活化液接種至龍眼果漿中進(jìn)行主發(fā)酵（25 ℃、5 d），然后進(jìn)行后發(fā)酵（20 ℃、25 d），發(fā)酵完成后分離酒腳得原酒，加入0.6 g/L的皂土澄清龍眼果酒，硅藻土過(guò)濾，自然陳釀3個(gè)月，即得龍眼果酒成品。

1.3.2 龍眼果酒香氣成分分析

龍眼果酒香氣成分采用HS-SPME-GC-MS進(jìn)行分析[5]。

取15 mL的龍眼果酒于30 mL樣品瓶中，加入5 g NaCl，用聚四氟乙烯-硅膠隔墊加蓋密封，40 ℃平衡15 min，然后將老化（270 ℃，1 h）的DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶，頂空萃取45 min，攪拌速率300 r/min。

氣相色譜條件：DB-23色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度270 ℃，不分流進(jìn)樣，45 s后打開分流，分流比10∶1，流速20 mL/min。程序升溫為35 ℃保持3 min，然后以3 ℃/min的速率升高至205 ℃，保留5 min。

質(zhì)譜條件：采用電子電離（electronic ionization，EI）源，溶劑延遲4.9～8.0 min，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為240 ℃。

定性定量分析：將化合物與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索識(shí)別時(shí)，選擇化合物匹配度＞50，確定化合物保留時(shí)間。定量分析采用峰面積歸一法計(jì)算各成分的相對(duì)百分含量。

1.3.3 龍眼果酒香氣成分相對(duì)氣味活度值計(jì)算與評(píng)價(jià)

采用相對(duì)氣味活度值（ROAV）評(píng)價(jià)揮發(fā)性成分對(duì)龍眼果酒香氣體系的貢獻(xiàn)度[10]。ROAV計(jì)算公式如下：

式中：ROAVi為某一香氣組分的相對(duì)氣味活度值；Ci為某一香氣組分的相對(duì)含量，%；Cmax為香氣體系中貢獻(xiàn)最大組分的相對(duì)含量，%；Ti為該組分的香氣閾值；Tmax為香氣體系中貢獻(xiàn)最大組分的香氣閾值。

所有揮發(fā)性成分ROAV≤100，對(duì)于某一種確定組分，ROAV越大，則該物質(zhì)對(duì)龍眼果酒香氣體系貢獻(xiàn)度越大。ROAV≥1的化合物為關(guān)鍵香氣成分，0.01≤ROAV＜1.00為修飾香氣成分，ROAV＜0.01為潛在香氣成分[10]。

1.3.4 理化指標(biāo)的檢測(cè)

總酸、總糖、酒精度、總酯：按照國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

對(duì)GC-MS Chemistry Station工作站采集到的原始數(shù)據(jù)采用Masshunter Qualitative Analysis軟件進(jìn)行分析，利用SPSS Statistics 25.0進(jìn)行鄧肯單因素方差分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母發(fā)酵龍眼果酒理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，龍眼果酒主發(fā)酵的總酸含量（8.60～8.62 g/L）、酒精度（8.12%vol～11.77%vol）均低于后發(fā)酵的總酸含量（8.66～8.91 g/L）、酒精度（11.20%vol～11.95%vol）。相反，龍眼果酒主發(fā)酵的總糖含量高于后發(fā)酵。由此可知，隨著龍眼果酒發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，果酒中總酸、酒精度不斷增加；而龍眼果酒中總糖含量不斷減少。因?yàn)樘窃诎l(fā)酵過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)化成酒精，故主發(fā)酵的總糖含量比后發(fā)酵的總糖含量高，不同發(fā)酵階段的總糖含量是判斷龍眼果酒發(fā)酵程度的重要依據(jù)。隨著發(fā)酵程度的加深，CRI消耗糖的速度加快，同時(shí)酒精度升高的速度也加快。與其他2種酵母相比，CRI釀酒酵母發(fā)酵更為徹底，產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)，更適合龍眼果酒的發(fā)酵。

表1 LABA、CRI、L-EL酵母發(fā)酵的龍眼果酒理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of longan fruit wine fermented by yeast LABA, CRI, L-EL

2.2 不同酵母發(fā)酵龍眼果酒中的香氣成分分析

由表2可知，LABA酵母發(fā)酵果酒共檢出揮發(fā)性成分32種，其中，酯類12種、醇類4種、醛類3種、烯類1種、酸類2種、醚類1種，其他類9種；CRI酵母發(fā)酵果酒共檢出揮發(fā)性成分43種，其中，酯類14種、醇類5種、醛類5種、烯類1種、酸類3種、醚類1種，其他類14種；L-EL酵母發(fā)酵果酒共檢出揮發(fā)性成分39種，其中，酯類14種、醇類4種、醛類3種、酸類1種、醚類3種，其他類14種。3種龍眼果酒中含量最高的香氣成分為醇類和酯類，其次為醚類和酸類，最少的為烯類。3種酵母發(fā)酵的龍眼果酒中，酯類種類最為豐富，醇類含量最為豐富。3種酵母發(fā)酵果酒中共同含有的酯類物質(zhì)分別是正己酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、水楊酸甲酯和苯乙酸乙酯；共同含有的醇類物質(zhì)分別是異丁醇、苯乙醇；共同含有的醛類物質(zhì)是苯甲醛；共同含有的酸類物質(zhì)是乙酸；共同含有的醚類物質(zhì)是二乙二醇乙醚。果酒中大部分醇類、酯類和醛類等香氣成分是通過(guò)酵母發(fā)酵產(chǎn)生的，這些香氣成分在發(fā)酵過(guò)程中不斷富集，互相調(diào)和，從而形成了果酒獨(dú)特的風(fēng)味[19]。CRI酵母發(fā)酵果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類最豐富（43種），其酯類物質(zhì)含量最高（1 536.64 mg/L）。

表2 LABA、CRI、L-EL酵母發(fā)酵的龍眼果酒主要香氣成分分析Table 2 Analysis of main aroma components in longan fruit wine fermented by yeast LABA, CRI, L-EL

2.2.1 醇類分析

醇類成分是龍眼果酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，主要來(lái)源于糖類的分解代謝以及氨基酸的脫羧、脫氨反應(yīng)[20]。3種龍眼果酒中檢出8種醇類物質(zhì)，其中2種為共有醇類物質(zhì)，分別為異丁醇和苯乙醇。異丁醇有醇油和酒精的氣味，是酒中主要的風(fēng)味物質(zhì)[21]，苯乙醇有蜂蜜、玫瑰和丁香花的香味[12]，在果酒中起到增香增甜及調(diào)和的作用[22]。LABA酵母發(fā)酵果酒產(chǎn)生的醇類成分相對(duì)含量為47.90%；CRI酵母發(fā)酵果酒產(chǎn)生的醇類成分相對(duì)含量為44.14%；L-EL酵母發(fā)酵果酒產(chǎn)生的醇類成分相對(duì)含量?jī)H為9.61%，適宜濃度的醇類物質(zhì)可以襯托酯香，對(duì)香氣的協(xié)調(diào)性有促進(jìn)作用，是龍眼果酒中含量最多的香氣成分。其中，CRI酵母發(fā)酵果酒產(chǎn)生的異戊醇含量最高，相對(duì)含量為34.99%，為龍眼果酒帶來(lái)更加豐富的酒香和果香。

2.2.2 酯類分析

酯類成分是龍眼果酒中最豐富的香氣成分，LABA酵母發(fā)酵果酒產(chǎn)生的酯類有12種，相對(duì)含量為35.58%；CRI酵母發(fā)酵果酒產(chǎn)生的酯類有14種，相對(duì)含量為11.73%；L-EL酵母發(fā)酵果酒產(chǎn)生的酯類有14種，相對(duì)含量為18.10%，其中乙酯類成分居多。一般認(rèn)為，在酵母脂肪酸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的脂酰輔酶A醇解后產(chǎn)生部分脂肪酸乙酯，如丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯等[23]。含有酯類物質(zhì)種類多的果酒，其風(fēng)味也較豐富；酯類風(fēng)味物質(zhì)含量越多，其果香和花香就越濃郁。酯類物質(zhì)可以增加酒體的香味，有助于酒體形成濃郁厚重的風(fēng)味[24]，酸味影響果酒的口感，果酒中適量的酸類物質(zhì)可以使酒有清新感和爽口感，沒(méi)有酸味的果酒品嘗起來(lái)口味比較平淡[25]。在檢測(cè)到的酯類成分中，丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯等都是廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)的食用香料，丁酸乙酯具有菠蘿香蘊(yùn)的果香氣味，己酸乙酯具有菠蘿-香蕉香型的氣味，苯甲酸甲酯具有橙花及葡萄糖香氣和甜味，苯甲酸乙酯具有令人愉悅的水果香氣，苯乙酸乙酯具有花香及蜂蜜香氣味。

2.2.3 醛類分析

3種龍眼果酒檢測(cè)出醛類成分共有7種，分別是甘油縮甲醛、巴豆醛、丙烯醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛和4-苯基丁醛。CRI酵母發(fā)酵的龍眼果酒中醛類成分為5種，其余2種酵母發(fā)酵的龍眼果酒中醛類成分均為3種，其中苯甲醛為三種酵母在發(fā)酵過(guò)程中形成的共有醛類物質(zhì)。一般認(rèn)為醛類物質(zhì)的產(chǎn)生主要來(lái)源于發(fā)酵過(guò)程中各種代謝途徑，其中包括糖代謝、脂肪酸代謝以及氨基酸代謝等。

2.2.4 其他類分析

3種龍眼果酒檢測(cè)出其他類成分主要有酚類、醛酮類、呋喃類等，共同含有的4種物質(zhì)分別是萘、1-甲基萘、2-甲基萘、1-（1-乙氧基乙氧基）戊烷。其中萘和1-甲基萘有溫和芳香氣味；2-甲基萘和1-（1-乙氧基乙氧基）戊烷有令人愉快的氣味。

2.3 不同酵母發(fā)酵龍眼果酒中主要酯類成分的ROAV分析

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)食品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)依賴其濃度和閾值共同決定[30]，果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)酒體氣味有直接影響的物質(zhì)主要是酯類物質(zhì)[31]。3種酵母釀造龍眼果酒中的主要酯類成分的ROAV見(jiàn)表3。由表3可知，L-EL酵母釀造的龍眼果酒中關(guān)鍵香氣成分（ROAV≥1）有3種，分別是己酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯；CRI酵母釀造的龍眼果酒中關(guān)鍵香氣成分（ROAV≥1）有7種，分別是丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、水楊酸甲酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯；LABA酵母釀造的龍眼果酒中關(guān)鍵香氣成分（ROAV≥1）有6種，分別為丁酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯。其中共有的關(guān)鍵香氣成分為辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、己酸乙酯，而辛酸乙酯在3種龍眼果酒中對(duì)總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)度最大。與LABA和L-EL這兩種酵母相比，CRI酵母釀造的龍眼果酒中多了水楊酸甲酯和苯乙酸乙酯這2種關(guān)鍵香氣成分，水楊酸甲酯具有冬青葉香味，苯乙酸乙酯具有發(fā)酵香、花香和蜂蜜香，這兩種香氣的結(jié)合豐富了龍眼果酒醇正淡雅的特性，由此可知CRI酵母釀造的龍眼果酒香氣層次更加豐富，賦予酒體更加獨(dú)特的花香和果香特征，增加了香氣復(fù)雜性。

表3 LABA、CRI、L-EL酵母發(fā)酵的龍眼果酒主要酯類成分相對(duì)氣味活度值分析Table 3 Relative odor activity values of main esters in longan fruit wine fermented with yeast LABA, CRI, L-EL

3 結(jié)論

本研究采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析酵母L-EL、CRI和LABA釀造龍眼果酒的香氣成分，3種釀酒酵母釀造的龍眼果酒中共檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)58種，包括酯類19種、醇類8種、醛類7種、烯類2種、酸類4種、醚類3種、酚類5種、醛酮類6種、呋喃類4種。結(jié)合ROAV計(jì)算，篩選出由L-EL酵母釀造的龍眼果酒中關(guān)鍵香氣成分（ROAV≥1）有3種；由CRI酵母釀造的龍眼果酒中關(guān)鍵香氣成分（ROAV≥1）有7種；由LABA酵母釀造的龍眼果酒中關(guān)鍵香氣成分（ROAV≥1）有6種，其中，辛酸乙酯在3種龍眼果酒中對(duì)總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)度最大。綜合考慮，CRI酵母發(fā)酵果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類最為豐富，其酯類物質(zhì)含量最高，更適合釀造龍眼果酒。