醬香型白酒冬季堆積發(fā)酵過程中酒醅升溫機(jī)制初探

張德芹，胡建鋒，吳 成，張二康，李嶺卓*

（1.貴州習(xí)酒投資控股集團(tuán)有限責(zé)任公司，貴州 遵義 564600；2.貴州習(xí)酒股份有限公司，貴州 遵義 564600；3.貴州省制造業(yè)創(chuàng)新中心，貴州 遵義 564500；4.中國(guó)輕工業(yè)醬香型白酒智能化釀造工程技術(shù)研究中心，貴州 遵義 564600）

堆積發(fā)酵是醬香型白酒獨(dú)具特色的生產(chǎn)工藝之一[1-2]，因該過程具有網(wǎng)羅環(huán)境微生物的作用[3-4]，也被稱為“二次制曲”。研究證實(shí)，堆積發(fā)酵過程中種類、數(shù)量十分豐富的酒醅微生物生長(zhǎng)代謝與演替變化，分解大分子物質(zhì)，產(chǎn)生了大量的風(fēng)味物質(zhì)以及其前體，為酒醅進(jìn)入窖池發(fā)酵產(chǎn)酒、產(chǎn)香創(chuàng)造必要的條件[5-6]。任婷婷等[7]對(duì)洞釀醬香酒一輪次堆積發(fā)酵過程微生物群落與理化因子關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明酒醅中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia），優(yōu)勢(shì)真菌屬為嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）和復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）。吳成等[8]探究了醬香酒造沙輪次堆積發(fā)酵酒醅微生物與理化指標(biāo)演替規(guī)律，表明在發(fā)酵末期乳桿菌屬（Lactobacillus）和畢赤酵母屬（Pichia）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，且與酒醅溫度呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。張春林等[9]研究了醬香酒二輪次堆積過程酒醅微生物與理化指標(biāo)變化規(guī)律，證實(shí)酒醅溫度與假絲酵母屬相對(duì)豐度呈正相關(guān)，與裸胞殼屬（Emericella）、畢赤酵母屬呈負(fù)相關(guān)。此外，還有研究表明，醬香型白酒堆積發(fā)酵過程微生物的代謝產(chǎn)熱作用帶動(dòng)酒醅溫度升高，進(jìn)而利于微生物生長(zhǎng)繁殖[10]。

一般地，醬香型白酒一、二輪次發(fā)酵生產(chǎn)處于氣溫較低的冬季（1～2月份），堆積酒醅容易出現(xiàn)“來溫慢、冷心、達(dá)不到頂溫”等發(fā)酵異?，F(xiàn)象，從而導(dǎo)致發(fā)酵不徹底，進(jìn)而影響基酒產(chǎn)質(zhì)量。袁再順等[11]研究表明，破堆移位處理能使異常堆恢復(fù)正常升溫、降低酒醅的總酸與水分含量，并顯著增加二輪次酒醅中還原糖含量，該處理對(duì)堆積酒醅中好氧細(xì)菌芽孢桿菌的生長(zhǎng)具顯著促進(jìn)作用，而乳酸桿菌大量減少。談沖等[12]對(duì)醬香型白酒一輪次酒醅微生物的溯源分析發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)環(huán)境為堆積酒醅提供了大多數(shù)細(xì)菌（93.8%），乳酸菌主要來源于車間過道以及生產(chǎn)工具。目前，盡管已有研究者對(duì)冬季醬香型白酒堆積發(fā)酵過程酒醅中微生物來源以及堆子溫度變化原因進(jìn)行了分析，但對(duì)于整個(gè)堆積發(fā)酵過程酒醅升溫的內(nèi)在機(jī)制仍缺乏較為清晰的認(rèn)知?；诖耍狙芯恳葬u香型白酒冬季一輪次堆積發(fā)酵酒醅為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)溫度監(jiān)測(cè)儀、傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)堆積發(fā)酵過程中酒醅溫度、微生物菌落總數(shù)、真菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律及其相關(guān)性進(jìn)行了探索，以期為闡釋醬香型白酒堆積發(fā)酵過程升溫機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅樣品：貴州習(xí)酒股份有限公司制酒車間。

1.1.2 化學(xué)試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國(guó)Omega BioTek公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物、2×HieffRRobust PCR Master Mix、Hieff NGSTMDNA Selection Beads：上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；WL培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F無菌操作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZQPW-70全溫振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；KG-AP32L自動(dòng)蒸汽滅菌器：日本ALP公司；Pico-21臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳托能達(dá)科技有限公司；L300T3實(shí)時(shí)溫度監(jiān)測(cè)桿：四川科學(xué)儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

酒醅經(jīng)出甑、攤晾、拌曲、完全收堆后開始采集，完全收堆時(shí)記為發(fā)酵0 h，每24 h采集樣品一次至入窖，如圖1所示。A、B、C、D、E、F分別為糖化堆上層中心、表面；中層中心、表面；下層中心、表面，不同位置采集樣品時(shí)繞堆子1周隨機(jī)取3個(gè)酒醅樣品混合進(jìn)行檢測(cè)分析。

圖1 堆積發(fā)酵過程中取樣示意圖Fig. 1 Sampling diagram during heap fermentation process

1.3.2 發(fā)酵溫度及菌落總數(shù)檢測(cè)

將3支實(shí)時(shí)溫度檢測(cè)桿插入糖化對(duì)上、中、下不同位置，從完堆開始（0 h）至堆積發(fā)酵結(jié)束（116 h），每4 h采集一次糖化堆各取樣點(diǎn)溫度。分別使用WL培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂分離篩選酒醅中的酵母菌、霉菌和細(xì)菌，并采用稀釋平板涂布法，記錄菌落總數(shù)[13]。

1.3.3 MiSeq高通量測(cè)序

采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA試劑盒提取樣本總DNA，具體操作流程見試劑盒說明書。分別選取不同堆積發(fā)酵時(shí)間和不同位置的酒醅樣品，進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)分析，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镮TS3～I(xiàn)TS4區(qū)，擴(kuò)增引物為ITS3（3'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-5'）和引物ITS4（3'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-5'）。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；25次循環(huán)；72℃終延伸5 min降至4 ℃。PCR擴(kuò)增體系為：2×HieffRRobust PCR Master Mix15 μL，正向及反向引物各1 μL，DNA模板20～30 ng，使用雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)齊體系至30 μL。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序下機(jī)序列經(jīng)cutadapt去除引物接頭序列后，根據(jù)PE reads間的overlap關(guān)系使用PEAR將成對(duì)的reads拼接成一條序列，再按照barcode對(duì)其進(jìn)行識(shí)別和過濾等處理后得到有效序列數(shù)據(jù)。將相似度為97%下的有效系列進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，采用UNITE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。數(shù)據(jù)的分析及計(jì)算使用Microsoft Office Excel 2016軟件；微生物相對(duì)豐度熱圖采用TBtools軟件繪制；選取相對(duì)豐度排名前10的真菌屬和酒醅溫度，采用SPSS 24.0軟件計(jì)算Spearman相關(guān)性系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅溫度和菌落總數(shù)變化

一輪次酒醅堆積發(fā)酵過程中酒醅溫度變化情況，結(jié)果見圖2。由圖2可知，完堆時(shí)，不同位點(diǎn)酒醅中心溫度均高于表面，上、中、下層中心溫度（18.8 ℃，24.4 ℃，25 ℃）＞上、中、下層表面溫度（16 ℃，15.8 ℃，15.7 ℃），而中層和下層溫差較大，中心溫度分別高于表面溫度8.6 ℃和9.3 ℃。在堆積發(fā)酵0～64 h階段，堆子上層中心和表面酒醅溫度升高較快，溫度分別由18.8 ℃和16 ℃上升至32.7 ℃和29 ℃；中層和下層中心酒醅溫度變化不大，中層中心溫度維持在24.4～26.6 ℃，下層中心溫度維持在25 ℃左右；而中、下層表面酒醅溫度呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，溫度分別由15.8 ℃和15.7 ℃上升至27.1 ℃和19.0 ℃。當(dāng)堆積發(fā)酵至67 h時(shí)進(jìn)行翻堆操作，堆子上、中、下層溫度均降至22.4 ℃左右，然后隨著堆積發(fā)酵至96 h，上層中心和表面酒醅溫度迅速上升，堆積發(fā)酵至116 h時(shí)頂溫達(dá)到最高48.7 ℃；而中層表面和下層表面酒醅溫度則升高緩慢，分別由23.6 ℃和24.2 ℃（67 h）上升至36.9 ℃和31 ℃（116 h），中心酒醅溫度基本維持恒定，分別在24 ℃和28 ℃左右。

圖2 堆積發(fā)酵過程中不同位置溫度變化Fig. 2 Changes of temperature at different positions during heap fermentation process

一輪次酒醅堆積發(fā)酵過程中酒醅不同位置微生物菌落總數(shù)平均值的變化情況，結(jié)果見表1。由表1可知，酵母菌菌落總數(shù)在堆積過程中大幅增長(zhǎng)，從完堆時(shí)的103數(shù)量級(jí)，到最高時(shí)（96 h）達(dá)到106數(shù)量級(jí)；細(xì)菌菌落總數(shù)在堆積過程中變化不大，從完堆到下窖，細(xì)菌數(shù)量在106～107數(shù)量級(jí)之間波動(dòng)，這與張健等[14]的報(bào)道一致；霉菌菌落總數(shù)穩(wěn)定在102～103數(shù)量級(jí)之間，發(fā)酵96 h后，霉菌菌落總數(shù)未檢出。需要特別注意的是，在堆積發(fā)酵48～72 h階段進(jìn)行了翻堆操作，堆子上層表面酒醅的酵母菌數(shù)量急劇上升（數(shù)量級(jí)從102增加至104），翻堆操作增加了酒醅中酵母菌數(shù)量，有利于解決糖化堆升溫較慢的問題。研究表明，醬香型白酒第二輪次堆積發(fā)酵過程經(jīng)“FD工藝”處理后酒醅真菌群落多樣性和豐富度均有明顯增加，且有利于大部分真菌群落的生長(zhǎng)，有效提高了出酒量和基酒的品質(zhì)[15]。由此可見，醬香型白酒一輪次酒醅堆積發(fā)酵過程中心位置酒醅率先啟動(dòng)發(fā)酵，溫度緩慢上升并擴(kuò)散至表層；表層酒醅達(dá)到一定溫度后，在較充足的溶氧條件下酵母菌快速生長(zhǎng)，溫度迅速上升，且翻堆操作可以顯著增加上層表面酒醅中酵母菌數(shù)量，有利于提升糖化堆快速達(dá)到頂溫。

表1 堆積發(fā)酵過程中不同位置微生物菌落總數(shù)變化Table 1 Changes of number of total microbial colonies at different positions during heap fermentation process CFU/g

2.2 微生物菌落總數(shù)與酒醅溫度相關(guān)性分析

溫度是評(píng)價(jià)堆積發(fā)酵狀態(tài)最直觀的指標(biāo)[15-17]。為了探究堆積發(fā)酵過程可培養(yǎng)微生物數(shù)量與溫度之間的相互作用關(guān)系，采用SPSS 24.0軟件對(duì)酒醅溫度和微生物數(shù)量進(jìn)行了Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。

表2 酒醅溫度與微生物菌落總數(shù)的相關(guān)性Table 2 Correlation between temperature of fermented grains and total number of microbial colonies

由表2可知，酒醅溫度與酵母菌總數(shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），這表明堆積發(fā)酵過程酒醅熱量可能主要來源于酵母菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)熱。而酒醅溫度與細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)無顯著相關(guān)（P＞0.05），相關(guān)研究表明，溫度和乙酸對(duì)酵母菌群的協(xié)同抑制可以導(dǎo)致釀造菌群失穩(wěn)，且粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）能夠通過提高丙酸和丁酸代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)水平從而提高相關(guān)醇酸的含量，促進(jìn)群落中其他揮發(fā)性風(fēng)味代謝產(chǎn)物的生成，進(jìn)而影響醬香型白酒發(fā)酵進(jìn)程[1，18]。

2.3 一輪次堆積發(fā)酵酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)組成及演替規(guī)律

基于菌落總數(shù)與溫度相關(guān)性分析結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)一輪次堆積發(fā)酵酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行高通量測(cè)序分析，結(jié)果見圖3。

圖3 基于門水平（A）和屬水平（B）堆積發(fā)酵過程中酒醅樣品真菌群落相對(duì)豐度變化Fig. 3 Changes of relative abundance of fungal communities of fermented grains samples during heap fermentation process at phylum level (A) and genus level (B)

由圖3可知，一輪次堆積發(fā)酵過程共檢測(cè)到真核微生物2個(gè)門、5個(gè)綱、5個(gè)目、13個(gè)科、17個(gè)屬和19個(gè)種。門水平上，全發(fā)酵過程以子囊菌門（Ascomycota）為主導(dǎo)；屬水平上，優(yōu)勢(shì)真菌屬主要有畢赤酵母屬（Pichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、根霉屬（Rhizopus）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）等，這與GUAN T W等[19-20]的研究報(bào)道一致。堆積發(fā)酵過程中Pichia相對(duì)豐度由初期的1.82%上升至結(jié)束時(shí)的49.14%，Issatchenkia相對(duì)豐度由6.03%上升至34.67%；Rhizopus相對(duì)豐度由19.67%下降至0.24%；Penicillium相對(duì)豐度由12.45下降至1.44%；Thermomyces相對(duì)豐度由22.63%下降至0.73%。發(fā)酵中后期Pichia和Issatchenkia成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，這與呂錫斌等[21]研究報(bào)道一致。

選擇相對(duì)豐度排名前10的優(yōu)勢(shì)真菌屬（包括Pichia、Issatchenkia、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、Penicillium、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、Thermomyces、Aspergillus和Rhizopus），對(duì)堆積發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)真菌屬進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。

圖4 堆積發(fā)酵過程中酒醅優(yōu)勢(shì)真菌屬聚類分析Fig. 4 Cluster analysis of dominant fungi genus in fermented grains during heap fermentation process

由圖4可知，在堆積發(fā)酵24～48 h階段，以Thermomyces、Aspergillus、Rhizopus、Penicillium，以及其他小類真菌屬為主。從完堆（0 h）至堆積發(fā)酵結(jié)束（116 h），由于Pichia、Issatchenkia、Zygosaccharomyces和Saccharomyces相 對(duì) 豐度發(fā)生變化，從而造成酒醅中心位置真菌群落結(jié)構(gòu)組成與表面、下層存在較大差異，被聚類在兩邊。堆積發(fā)酵至72 h時(shí)，酒醅不同位置真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，72A和72F、72B、72E、72D、72C樣品分別被單獨(dú)聚成一類，表明翻堆操作將重塑酒醅真菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成。王貴軍等[22]研究表明，醬香型酒醅在堆積發(fā)酵過程，不同部位升溫不同而使各層酒醅具有不同風(fēng)格。此外，采用破堆移位技術(shù)，可使堆積發(fā)酵酒醅再次網(wǎng)羅空氣中的微生物，提高醬香型白酒出酒率的同時(shí)，優(yōu)質(zhì)品率也得到了提升[23]。當(dāng)堆積發(fā)酵96～116 h階段時(shí)，堆子表面位置酒醅Pichia相對(duì)豐度顯著高于Issatchenkia，中心位置酒醅Pichia相對(duì)豐度則略低于Issatchenkia。由于Issatchenkia具有更強(qiáng)的厭氧耐受能力，本階段好氧條件下Pichia在與Issatchenkia的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，而厭氧條件下Pichia在與Issatchenkia的競(jìng)爭(zhēng)中則處于劣勢(shì)。研究表明，Saccharomyces、Issatchenkia、Zygosaccharomyces、Schizosaccharomyce、Kazachstania等酵母菌對(duì)高級(jí)醇、酸、酯、醛等風(fēng)味成分的貢獻(xiàn)很大[24]。

2.4 真菌群落組成與溫度相關(guān)性分析

選取溫度變化較為劇烈的堆積發(fā)酵48 h和96 h的酒醅，結(jié)合酒醅溫度與相對(duì)豐度排名前10的優(yōu)勢(shì)真菌屬進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。

表3 酒醅溫度與優(yōu)勢(shì)真菌屬相對(duì)豐度的相關(guān)性Table 3 Correlation between the temperature and the dominant fungi genus of fermented grains

由表3可知，Pichia與酒醅溫度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說明Pichia在糖化堆升溫過程中扮演了重要的角色。ZHANG H X等[25]研究發(fā)現(xiàn)，釀造環(huán)境是醬香型白酒堆積發(fā)酵過程中重要微生物Pichiasp.的主要來源，其具有較好的熱耐受性以及較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，對(duì)維持醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵穩(wěn)態(tài)具有重要意義。林良才等[26]在高溫、高酸雙脅迫條件下從醬香型白酒酒醅中篩選獲得11株具有高耐性的庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），利用玉米濃醪進(jìn)行模擬白酒發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)菌株XDNZ_PK05除可耐受45 ℃高溫、5 g/L乙酸、70 g/L乳酸和體積分?jǐn)?shù)14%乙醇之外，還具有高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級(jí)醇的代謝特性。將該株菌應(yīng)用于醬香型白酒的生物強(qiáng)化實(shí)際生產(chǎn)中，可提高原料利用率20%，提升乙醇產(chǎn)量13%，同時(shí)降低正丙醇含量53%，同時(shí)其他風(fēng)味物質(zhì)無顯著差異。堆積發(fā)酵48 h時(shí)，Aspergillus與酒醅溫度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；堆積發(fā)酵96 h時(shí)，Saccharomyces、Schizosaccharomyces與酒醅溫度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。醬香型白酒堆積發(fā)酵過程中霉菌和酵母是最重要的微生物，霉菌可以分泌水解酶類降解大分子物質(zhì)為酵母菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵提供底物，而酵母菌將底物轉(zhuǎn)化為乙醇和風(fēng)味物質(zhì)。陳筆[27]研究表明，米曲霉（A.oryzae）與釀酒酵母（S.cerevisiae）混合發(fā)酵，能夠提高酯類、酸類、醇類、醛酮類等風(fēng)味物質(zhì)的濃度，表明Aspergillus與Saccharomyces在醬香型白酒一輪次堆積發(fā)酵可能存在協(xié)同作用。袁再順[28]對(duì)“破堆移位”影響醬香型白酒冬季堆積發(fā)酵因素進(jìn)行了探究，結(jié)果表明發(fā)酵酒醅曲霉與溫度呈顯著負(fù)相關(guān)，與本研究結(jié)果一致，課題組擬在后續(xù)研究中進(jìn)一步探究溫度對(duì)Aspergillus、Saccharomyces和Schizosaccharomyces的作用機(jī)理。

3 結(jié)論

本研究以醬香型白酒一輪次堆積發(fā)酵為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)溫度監(jiān)測(cè)儀、傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，初步探究了醬香型白酒冬季堆積發(fā)酵酒醅升溫機(jī)制。結(jié)果表明，堆積發(fā)酵不同部位溫度變化存在差異，中心位置酒醅率先啟動(dòng)發(fā)酵，溫度緩慢上升并擴(kuò)散至表層，且溫度與酵母菌菌落總數(shù)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。進(jìn)一步結(jié)合高通量測(cè)序和相關(guān)性分析結(jié)果表明，溫度是醬香型白酒冬季堆積發(fā)酵菌群演替的重要驅(qū)動(dòng)因素，酒醅中心位置真菌群落結(jié)構(gòu)組成與表面、下層存在較大差異，Pichia與酒醅溫度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明酵母菌以Pichia為主的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)熱為糖化堆升溫提供了主要?jiǎng)恿?，本研究為進(jìn)一步解析醬香型白酒冬季堆積發(fā)酵升溫機(jī)制提供了理論參考。