復(fù)方阿膠漿化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展及質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）預(yù)測(cè)

于小鈞，王 彬，王常瞵，高 鵬，高 燕, 3, 4*，趙渤年, 3, 4*

復(fù)方阿膠漿化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展及質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）預(yù)測(cè)

于小鈞1, 2, 3, 4，王 彬1，王常瞵1，高 鵬2，高 燕2, 3, 4*，趙渤年2, 3, 4*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥物研究院，山東 濟(jì)南 250355 3. 黃河流域特色中藥生態(tài)保護(hù)和高質(zhì)量發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250355 4. 國家中醫(yī)藥管理局高水平重點(diǎn)學(xué)科-中藥藥劑學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

復(fù)方阿膠漿具有補(bǔ)氣養(yǎng)血的功效，臨床主要用于治療腫瘤、血液系統(tǒng)及婦科類疾病，但對(duì)其化學(xué)成分及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少，質(zhì)量控制手段落后。通過對(duì)復(fù)方阿膠漿的化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，在此基礎(chǔ)上，依據(jù)“五原則”對(duì)復(fù)方阿膠漿的質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，初步確定-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R2（型）、地黃苷D、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、黨參炔苷、綠原酸、牡荊素鼠李糖苷等可作為復(fù)方阿膠漿的Q-Marker，為復(fù)方阿膠漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升與后續(xù)研究提供參考。

復(fù)方阿膠漿；質(zhì)量標(biāo)志物；質(zhì)量控制；-羥脯氨酸；人參皂苷Re；三七皂苷R2（型）；地黃苷D；綠原酸

復(fù)方阿膠漿（Fufang E’jiao Syrup，F(xiàn)ES）源自明代《景岳全書》中的補(bǔ)氣養(yǎng)血經(jīng)典名方“兩儀膏”，是《中國藥典》2020年版收載的中藥復(fù)方制劑，由阿膠、紅參、熟地黃、黨參、山楂5味中藥經(jīng)現(xiàn)代工藝提取加工而成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血之功效，可用于氣血兩虛、頭暈?zāi)垦！⑿募率?、食欲不振及白?xì)胞減少癥和貧血等[1]。方中阿膠具有滋陰補(bǔ)血之功，熟地黃具有填精益髓之效，共為君藥；紅參、黨參甘溫益氣，養(yǎng)血生津，助君藥增強(qiáng)療效，共為臣藥；山楂健胃消食、活血行滯，為佐藥；諸藥合用，起到補(bǔ)氣養(yǎng)血、滋陰養(yǎng)榮、填精益髓之功效[2-4]。

FES臨床療效顯著，應(yīng)用廣泛，市場(chǎng)需求量大，目前關(guān)于FES的藥理作用及臨床療效評(píng)價(jià)也比較清晰，但對(duì)其化學(xué)成分及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少，《中國藥典》2020年版FES中含量測(cè)定項(xiàng)下僅對(duì)總氮量進(jìn)行的控制，質(zhì)量評(píng)價(jià)不完善，且與藥效無關(guān)聯(lián)，難以保證質(zhì)量的均一穩(wěn)定。因此，本文對(duì)近年來FES的化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行整理與分析，從質(zhì)量傳遞與溯源、成分可測(cè)性、成分有效性、成分特有性、復(fù)方配伍環(huán)境5個(gè)方面對(duì)其質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[5]，為FES質(zhì)量控制體系的完善提供參考。

1 化學(xué)成分

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同起效的特點(diǎn)，但其化學(xué)成分復(fù)雜，解析困難，其化學(xué)成分的鑒定及有效成分的篩選是中藥復(fù)方制劑研究的重要內(nèi)容[6]。隨著現(xiàn)代分析儀器和技術(shù)的發(fā)展，F(xiàn)ES中的成分逐漸明晰。許嘯等[3,7]采用薄層色譜法針對(duì)FES中的植物藥建立了“4-3-2-2”鑒別模式（即4味中藥、3種供試品溶液制備方法、2種展開劑、2種對(duì)照物的雙對(duì)照方法），可快速專屬性的鑒別出復(fù)方中的人參皂苷Rg1、黨參炔苷、毛蕊花糖苷、牡荊素鼠李糖苷等成分；針對(duì)動(dòng)物藥阿膠，則采用高效液相色譜法建立了一測(cè)多評(píng)法，可快速鑒別復(fù)方中-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸4種氨基酸類成分。對(duì)全方進(jìn)行液相分析，共鑒別了咖啡酸、綠原酸、洋地黃葉苷C、阿魏酸、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、異毛蕊花糖苷8個(gè)成分。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一門綜合分析技術(shù)，在組分復(fù)雜樣品的研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于復(fù)雜中藥體系的物質(zhì)基礎(chǔ)研究中。方忠華[8]采用HPLC-MS技術(shù)檢測(cè)并識(shí)別出了FES中人參皂苷類（紅參）、炔苷類（黨參）、苯乙醇苷類（熟地黃）、有機(jī)酸類和黃酮類成分（山楂）等共計(jì)29種成分。朱求方[9]運(yùn)用高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜/質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry/mass spectrometry，HPLC-ESI-MSn）技術(shù)對(duì)FES的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了深入研究，共鑒定或推測(cè)出35個(gè)化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，主要包括人參皂苷類、苯乙醇苷類、咖啡酰奎寧酸及黃酮類成分。Shen等[10]采用HPLC-MSn技術(shù)從FES中鑒定出72種成分。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）技術(shù)也被用于分析FES中的化學(xué)成分。Li等[11]采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)從FES中鑒定出了13中低聚糖，包括3種雙糖、4種三糖、3種四糖和3種五糖。為研究FES中的阿膠源性成分，陳佳等[12]采用胰蛋白酶將FES酶解后，經(jīng)超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)，得到源于阿膠的特征分子離子峰/539.8（雙電荷）→612.4和/539.8（雙電荷）→923.8作為檢測(cè)離子對(duì)，可用于FES中阿膠的鑒別。FES中的主要化學(xué)成分見表1。

2 藥理作用

FES具有補(bǔ)氣養(yǎng)血的功效，臨床用于治療血液和免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤及婦科類疾病，相應(yīng)的藥理作用表現(xiàn)為保護(hù)骨髓、補(bǔ)血、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗腫瘤、改善子宮內(nèi)膜、促進(jìn)卵泡發(fā)育等。

2.1 保護(hù)骨髓作用

骨髓是造血的主要部位，由造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）、造血祖細(xì)胞（hematopoietic progenitor cell，HPC）、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等組成，為HSC等自我更新和分化提供微環(huán)境，在造血因子的調(diào)控下，HSC可增殖、分化為粒/單系、紅系和巨核系HPC，各系祖細(xì)胞進(jìn)一步增殖、分化形成造血前體細(xì)胞，最后形成成熟的血細(xì)胞（白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等）進(jìn)入到外周血液循環(huán)[13-15]。當(dāng)骨髓功能被抑制后，其下游的各系細(xì)胞均受影響，繼而出現(xiàn)貧血、免疫下降等現(xiàn)象。骨髓抑制是化療和放療引起的一種常見毒性反應(yīng)，會(huì)限制治療效果并危及患者的生命[16-17]。FES作為抗骨髓抑制藥物在癌癥治療中應(yīng)用廣泛，可通過促進(jìn)HPC的增殖，保護(hù)受損的骨髓[18]。Zhang等[19]通過研究FES對(duì)5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）誘導(dǎo)的骨髓抑制小鼠的藥理作用并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可顯著提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的HSC百分比及紅系祖細(xì)胞和粒/單系祖細(xì)胞的數(shù)量，刺激HSC的增殖和HSC向所有譜系分化，從而加速骨髓抑制小鼠造血功能的恢復(fù)。轉(zhuǎn)錄組及生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路可能是關(guān)鍵通路，基質(zhì)金屬蛋白酶2和I型膠原蛋白α1肽鏈?zhǔn)顷P(guān)鍵的相關(guān)調(diào)控因子。

表1 FES中主要的化學(xué)成分

2.2 抗貧血作用

FES具有“氣血雙補(bǔ)”之功效，可促進(jìn)造血、改善造血微環(huán)境，臨床可用于一般貧血、缺鐵性貧血、溶血性貧血等的治療[20-24]，療效確切，常被用作補(bǔ)血研究的陽性藥[25-28]?，F(xiàn)代研究表明，F(xiàn)ES可以顯著增加血液中紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容等水平，改善貧血狀態(tài)[25,27-30]。FES能增強(qiáng)成纖維細(xì)胞集落形成單位的形成能力、改善骨髓造血微環(huán)境，促進(jìn)骨髓有核細(xì)胞（bone marrow nucleated cell，BMNC）的增殖，抑制其凋亡，提高BMNC數(shù)量。并能促進(jìn)機(jī)體造血生長(zhǎng)因子如白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-3、IL-6、促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）和粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等的表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的表達(dá)，從整體和根源上改善貧血狀態(tài)[25-26,31-33]。杜青等[27]等研究發(fā)現(xiàn)，在再生障礙性貧血模型大鼠中，F(xiàn)ES改善造血的功能可能與其降低骨髓細(xì)胞中Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，）和核因子-κB（nuclear factor-κB，）的mRNA及蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)骨髓炎癥信號(hào)通路TLR4/NF-κB的表達(dá)有關(guān)。

鐵是血紅蛋白的重要組成部分，缺鐵會(huì)引起血紅蛋白生成減少，導(dǎo)致缺鐵性貧血。鐵調(diào)素是由肝臟合成并分泌的具有降低機(jī)體鐵水平作用的多肽[34-35]，F(xiàn)ES能下調(diào)肝臟鐵調(diào)素mRNA的表達(dá)，降低外周血中鐵調(diào)素的含量，從而提升機(jī)體鐵水平，改善缺鐵性貧血[28]。另外，F(xiàn)ES還能上調(diào)十二指腸中與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（divalent metal-ion transporter-1，）、金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（putative metal transport protein，）、亞鐵氧化酶（hephaestin，）mRNA的水平，促進(jìn)十二指腸對(duì)鐵的吸收，同時(shí)提高血清鐵和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量，降低鐵蛋白（儲(chǔ)存鐵）含量，進(jìn)而促進(jìn)血紅蛋白的合成及紅細(xì)胞的生成，改善缺鐵性貧血[31]。

在代謝調(diào)控方面，張妤等[36]發(fā)現(xiàn)FES可回調(diào)溶血性貧血大鼠乳酸、脂質(zhì)、-乙酰糖蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺等的含量，表明其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸代謝等途徑有關(guān)。FES抗貧血作用機(jī)制見圖1。

2.3 增強(qiáng)免疫作用

FES能增加荷瘤小鼠的脾臟、胸腺指數(shù)，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，提高免疫功能[37]。研究表明，F(xiàn)ES中的低聚糖是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要成分，如黨參低聚糖、人參低聚糖、地黃低聚糖等均具有增強(qiáng)免疫的生物活性[11,38-40]。FES對(duì)血液和免疫系統(tǒng)的作用見圖2。

圖1 FES抗貧血作用機(jī)制

圖2 FES對(duì)血液和免疫系統(tǒng)的作用

2.4 抗腫瘤作用

FES具有良好的抗腫瘤效果，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，保護(hù)正常細(xì)胞。李素芬等[24]模擬消化系統(tǒng)獲得了FES納米級(jí)組分，該組分對(duì)胃癌和乳腺癌細(xì)胞均有抑制作用。王子夏等[41]采用系統(tǒng)分離精制方法得到FES醇提物、低聚糖、多糖3類組分，這3類組分對(duì)正常大鼠無影響，但對(duì)胃癌前病變（precancerous lesions of gastric cancer，PLGC）大鼠具改善作用，可改善胃黏膜組織病理病變程度，抑制大鼠體質(zhì)量降低，改善血液生化指標(biāo)和血清理化指標(biāo)水平，且以FES醇提物的作用最佳。除直接抗腫瘤外，F(xiàn)ES在臨床中常作為惡性腫瘤化療的輔助藥物，具有明顯的增效減毒效果，聯(lián)合化療應(yīng)用具有協(xié)同增效作用，增效率達(dá)24.46%，并可減少化療引起的白細(xì)胞減少及免疫力低下等不良反應(yīng)。因此在臨床上患者在放化療的同時(shí)應(yīng)用FES可以起到增效減毒及保證放化療的順利進(jìn)行的作用[42-46]。

對(duì)FES的抗癌機(jī)制研究大多集中在其調(diào)節(jié)凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、黏附分子CD44上。cyclin D1是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)因子，在癌癥發(fā)病機(jī)制中起著核心作用，能引起細(xì)胞增殖失控[47]。CD44是一種非激酶細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，已被廣泛認(rèn)為是幾種癌癥中的癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物，與癌癥的發(fā)作和侵襲性有關(guān)[48-49]。孫敘敏等[50]研究表明，F(xiàn)ES能下調(diào)腫瘤組織中cyclin D1、CD44的表達(dá)，從干擾細(xì)胞周期和抑制腫瘤的侵襲性方面發(fā)揮抗腫瘤作用。Bcl-2蛋白是一種重要的腫瘤細(xì)胞凋亡抑制基因，已被證明可減少細(xì)胞收縮、染色質(zhì)凝聚和DNA切割。Bcl-2的過度表達(dá)可能與阻斷細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生有關(guān)，是Bcl-2的同源基因，可拮抗Bcl-2的抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)基因表達(dá)升高時(shí)，基因受到抑制[51]。FES可能通過下凋Bcl-2蛋白表達(dá)，上凋Bax蛋白表達(dá)，降低Bcl-2/Bax的值，從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡[45,52]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在癌癥中也具有重要作用，其異常激活與患病率的增加、惡性進(jìn)展、預(yù)后不良的發(fā)展，甚至癌癥相關(guān)死亡率的上升密切相關(guān)[53]。FES多糖對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)具有雙向性，可以激活其受抑制狀態(tài)，發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，也可以抑制其異常激活狀態(tài)，使其處于正常水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[54]。FES還可以通過抑制PI3K/Akt/缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）信號(hào)通路過度激活，調(diào)節(jié)胃腸激素和抑制炎癥來改善PLGC大鼠胃黏膜損傷[55]。

綜上，F(xiàn)ES主要通過抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞、防止細(xì)胞發(fā)生癌變，干擾癌變細(xì)胞周期，促進(jìn)凋亡等方面發(fā)揮抗腫瘤作用。具體機(jī)制見圖3。

圖3 FES抗腫瘤作用的作用機(jī)制

2.5 對(duì)子宮內(nèi)膜的作用

FES可促進(jìn)小鼠子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)，使子宮增大，內(nèi)膜增厚腺體數(shù)量增多。在超促排卵小鼠模型中，F(xiàn)ES可以降低子宮內(nèi)膜中整合素αvβ3、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A，減少促排卵藥物對(duì)子宮的不利影響，從而改善其子宮內(nèi)膜容受性[56-57]。

2.6 抗氧化作用

FES能提高腎性貧血大鼠血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活力，增強(qiáng)抗氧化能力，降低大鼠體內(nèi)自由基水平，從而延緩腎病變程度[32]。Shen等[10]研究表明，F(xiàn)ES對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用。

2.7 其他作用

此外，F(xiàn)ES能降低血乳酸、肌酸激酶的含量，增加乳酸脫氫酶、血清尿素氮的含量，增強(qiáng)小鼠的抗疲勞能力[58]。FES還能縮短小鼠的凝血時(shí)間[59]、增強(qiáng)小鼠耐缺氧[60]、耐寒[61]等能力。

3 Q-Marker預(yù)測(cè)分析

基于“五原則”，從質(zhì)量傳遞與溯源、成分特有性、成分有效性、復(fù)方配伍環(huán)境以及成分可測(cè)性5個(gè)方面對(duì)FES的Q-Marker進(jìn)行預(yù)測(cè)[62-64]。

3.1 基于質(zhì)量傳遞與溯源的Q-Marker預(yù)測(cè)分析

以“紅參”“熟地黃”“黨參”為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中共篩選出51個(gè)活性成分，其中包括紅參的活性成分14個(gè)（人參皂苷Rh2、桉油烯醇、β-柏木烯、鄰苯二甲酸二正辛酯等），熟地黃的11個(gè)（地黃素B、焦地黃素A、焦地黃素B、焦地黃素D、棕櫚油酸甲基酯、亞油酸、十六碳二烯酸甲酯、野菰酸等）、黨參的活性成分26個(gè)（亞油酸、亞油酸甲酯、川芎哚、鄰苯二甲酸二異辛酯、7-甲氧基-2-甲基-3-苯基-4-色烯-4-酮、菠菜甾醇、灌木遠(yuǎn)志酮A、黃豆黃素、蓖麻堿、乙基-β--呋喃果糖苷等）。阿膠和山楂并未在數(shù)據(jù)庫中收錄，但孫敬勇等[65]從山楂中分離鑒定了6種化合物（包括牡荊素鼠李糖苷、槲皮素等）。王紫馨等[66]采用HPLC法從11批山楂飲片中標(biāo)示了14個(gè)特征峰并指認(rèn)了2個(gè)特征峰，分別為綠原酸、金絲桃苷。此外，熊雅茹等[67]基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)從阿膠酶解液中鑒定到63條多肽，并根據(jù)構(gòu)效關(guān)系預(yù)測(cè)了9條活性多肽。王瑩雪等[68]從阿膠消化產(chǎn)物中鑒定到519種多肽，經(jīng)分子對(duì)接獲得3條最具潛力的活性肽。

中藥成分眾多且復(fù)雜，但一般認(rèn)為只有被吸收入血，經(jīng)分布和代謝后才能發(fā)揮作用[69]。目前暫無針對(duì)FES整方的入血成分研究，但在其他研究中有FES組方藥材入血成分的研究。崔瑛等[70]采用HPLC法對(duì)熟地黃的入血成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)口服熟地黃后，血清中會(huì)新增1個(gè)色譜峰，并會(huì)有2個(gè)色譜峰發(fā)生變化。劉開心等[71]采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)從大鼠血清中鑒定出梓醇、毛蕊花糖苷代謝產(chǎn)物和地黃苷D代謝產(chǎn)物等歸屬于熟地黃的成分。此外，熟地黃中毛蕊花糖、水蘇糖、棉子糖、小檗堿鄰硫酸鹽鄰葡糖苷酸、焦地黃苯乙醇苷B1、astragalin和地黃苷D、8-表番木鱉酸、梔子酮苷、乙酰梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷、異地黃苷、齊墩果酸、甘露醇、鄰苯二甲酸二丁酯、原兒茶酸等成分均能入血[72-75]。黨參中黨參炔苷可能是主要入血成分[76]。劉翠[77]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究山楂炒焦前后組方大山楂丸的體內(nèi)外化學(xué)成分變化，結(jié)果從生山楂丸提取液中鑒定出-葡萄糖二酸、兒茶酸、-果糖、紫云英苷和硬脂酰胺等8個(gè)特有成分，從焦山楂丸提取液中鑒定出葡萄糖酸、水楊酸、柚皮苷、油酸酰胺和棕櫚酰胺等8個(gè)特有成分。在含藥血清中檢測(cè)到50個(gè)空白血清不含有的成分，其中生山楂丸血清中有30個(gè)成分峰，焦山楂丸血清中有34個(gè)成分峰。二者相同的入血成分有14個(gè)，不同的有16個(gè)，主要為黃酮類成分。王和宇等[78]采用UPLC-MS技術(shù)對(duì)紅參的入血成分進(jìn)行研究，結(jié)果在大鼠血清中共檢測(cè)到達(dá)瑪烷型原人參二醇型人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3，達(dá)瑪烷型原人參三醇型人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2，齊墩果烷型人參皂苷Ro及稀有皂苷Rk1共12種人參皂苷。

3.2 基于成分特有性的Q-Marker預(yù)測(cè)分析

3.2.1 阿膠的特征性成分分析 阿膠是馬科動(dòng)物驢L.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠，含有蛋白質(zhì)/多肽、糖類、脂肪酸等化學(xué)成分，一般認(rèn)為其蛋白/多肽類成分是其主要藥理活性成分，驢源多肽A1（C41H68N12O13）、驢源多肽A2（C51H82N18O18）為其特征性成分[79-80]。

3.2.2 熟地黃的特征性成分分析 熟地黃為玄參科植物地黃Libosch.干燥塊根的炮制加工品，主要含有環(huán)烯醚萜苷類、氨基酸類、苯乙醇苷類、多糖類、紫羅蘭酮類等成分，其中梓醇、地黃苷A～D、桃葉珊瑚苷、蜜力特苷、益母草苷等環(huán)烯醚萜苷類，毛蕊花糖苷、松果菊苷等苯乙醇苷類等是其特征性成分[81-82]，但梓醇在加工成熟地黃的過程中容易損失，不適合作為Q-Marker候選成分[83]。

3.2.3 紅參的特征性成分分析 紅參為五加科植物人參C. A. Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖，主要含有皂苷類、揮發(fā)油類、多糖類等成分，人參皂苷是紅參的主要生物活性物質(zhì)，其中人參皂苷（Rg3、Rh1、Rh2）、人參炔醇、精氨酸雙糖苷、麥芽酚等可作為紅參的特征性成分[84]。

3.2.4 黨參的特征性成分分析 黨參為桔?？浦参稂h參(Franch.) Nannf.、素花黨參Nannf. var(Nannf.) L. T. Shen或川黨參Oliv的干燥根，主要含有黃酮類、生物堿類、糖類、皂苷類、甾體類等成分[85]，其中黨參炔苷、黨參多糖和蒼術(shù)內(nèi)酯III等是黨參的特征性成分[86]。

3.2.5 山楂的特征性成分分析 山楂為薔薇科植物山里紅Bge. var. major N. E. Br.或山楂Bge.的干燥成熟果實(shí)，主要含有黃酮類、三萜類、有機(jī)酸類、木脂素類、甾體類等成分，其中槲皮素、枸櫞酸、熊果酸、齊墩果酸、蘋果酸、阿魏酸、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、表兒茶素、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、山柰酚、牡荊素葡萄糖苷等研究較多，是山楂的標(biāo)志性成分[87-88]。

3.3 基于成分與藥效關(guān)聯(lián)的Q-Marker預(yù)測(cè)分析

3.3.1 保護(hù)骨髓、增強(qiáng)免疫作用 研究表明，地黃苷、三七皂苷R2（型）及20()-人參皂苷Rg2均能刺激5-FU誘導(dǎo)的骨髓抑制小鼠模型中BMNC和HSC的生長(zhǎng)，及紅細(xì)胞和集落形成單位粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落的擴(kuò)增[89]。李雪等[14,89]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ES中地黃苷?三七皂苷R2（型）?20()-人參皂苷Rg2、20()-人參皂苷Rg3、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1等可以直接刺激“血虛”小鼠來源的骨髓細(xì)胞增殖效應(yīng)。地黃苷可回調(diào)粒系集落生長(zhǎng)相關(guān)因子、造血抑制因子的表達(dá)，三七皂苷R2（型）和20()-人參皂苷Rg2可回調(diào)紅系、粒單系集落生長(zhǎng)相關(guān)因子的表達(dá)。Shen等[10]研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷R2（型）和焦地黃苯乙醇苷A1對(duì)骨髓細(xì)胞的免疫增強(qiáng)活性呈劑量相關(guān)性。

有研究表明，F(xiàn)ES中的低聚糖是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要成分，如黨參低聚糖、人參低聚糖、地黃低聚糖等均具有增強(qiáng)免疫的生物活性[11,38-40]。此外，地黃寡糖還具有促進(jìn)造血的藥理作用[90]。低聚糖可能是FES的重要免疫活性組分，但低聚類成分組成復(fù)雜，物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，且不同來源低聚糖間（如人參低聚糖與地黃低聚糖、人參低聚糖與輔料蔗糖等）無明顯差異，因此FES低聚糖雖有一定活性但不適于作Q-Marker。

3.3.2 抗腫瘤作用 黨參炔醇、黨參炔苷和黨參炔苷寧是黨參中重要的聚乙炔類化合物具有多種功能，如抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)活性，尤其是抗腫瘤活性[91-93]。研究表明，黨參炔苷可通過下調(diào)丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[91,94]。Shen等[93]發(fā)現(xiàn)黨參炔醇以時(shí)間和劑量相關(guān)性的方式誘導(dǎo)人胃癌MKN45細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。

3.3.3 抗氧化作用 研究表明，20()-人參皂苷Rg3對(duì)小鼠腦微血管內(nèi)皮bEnd.3細(xì)胞的氧化損傷具有細(xì)胞保護(hù)作用[10]。焦地黃苯乙醇苷A1、牡荊素鼠李糖苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷對(duì)H2O2處理的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用[10]。

綜上，地黃苷、三七皂苷R2（型）、20()-人參皂苷Rg2、20()-人參皂苷Rg3、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、焦地黃苯乙醇苷A1、黨參炔醇、黨參炔苷、黨參炔苷寧、牡荊素鼠李糖苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷等成分與FES的藥理作用息息相關(guān)，推測(cè)其可能是FES中潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.4 基于復(fù)方配伍環(huán)境的Q-Marker的預(yù)測(cè)分析

中藥復(fù)方配伍是指在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，按照“君臣佐使”“升降浮沉”“四氣五味”“七情和合”等，使藥物之間相互作用，產(chǎn)生系列反應(yīng)，最終起到增效減毒的作用，體現(xiàn)了中醫(yī)藥的特色和優(yōu)勢(shì)[95]。FES以阿膠滋陰補(bǔ)血，以黨參、紅參大補(bǔ)元?dú)?，以熟地黃補(bǔ)血填髓，以山楂健脾消食、行氣消積，諸藥配伍以達(dá)氣血雙補(bǔ)之功效[14]。劉茂玄[31]發(fā)現(xiàn)FES中的阿膠和其他組分在治療缺鐵性貧血大鼠的過程中發(fā)揮相互協(xié)同作用，整方的治療效果優(yōu)于單用阿膠或單用無阿膠的FES。李成楠[54]研究表明，F(xiàn)ES中各組方藥材的多糖對(duì)低氧誘導(dǎo)的人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞損傷均有保護(hù)作用，但均不如FES整方多糖療效好。在對(duì)人胃黏膜AGS細(xì)胞增殖的抑制作用及改善胃癌前病變大鼠的作用的研究中，單獨(dú)的黨參多糖、紅參與黨參配伍多糖、熟地黃與紅參配伍多糖的作用均不如FES整方多糖。體現(xiàn)了FES組方配伍的合理性，提示在復(fù)方配伍的條件下能夠充分發(fā)揮其療效。但FES中藥材復(fù)方配伍后是產(chǎn)生了新物質(zhì)，還是哪些物質(zhì)在配伍后含量存在變化均沒有相關(guān)報(bào)道。

3.5 基于成分可測(cè)性的Q-Marker預(yù)測(cè)分析

《中國藥典》2020年版中FES及其組方藥材阿膠、熟地黃、紅參、山楂的含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定的成分有總氮量、驢源多肽A1、驢源多肽A2、-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、-脯氨酸、地黃苷D、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、枸櫞酸等。許嘯等[3,7]采用HPLC建立了FES中阿膠源性成分-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及黨參和熟地黃源性成分黨參炔苷、異毛蕊花糖苷的含量測(cè)定方法。張淹等[96]采用HPLC-MS法建立了FES中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、黨參炔苷、綠原酸、毛蕊花糖苷5種化學(xué)成分的定量方法。石曉晨等[97]基于HPLC建立的一測(cè)多評(píng)法，可同時(shí)檢測(cè)山楂中牡荊素鼠李糖苷、牡荊素葡萄糖苷、槲皮素、蘆丁、綠原酸、牡荊素、金絲桃苷7種成分的含量。

何嘉偉等[98]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)山楂的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取分析，共檢測(cè)到烯類、醇類、醛類等25種成分，其中19種成分被鑒定出，其中檸檬烯含量最高，還有(?)-α-蒎烯（10.08%）、4-萜烯醇（6.78%）、壬醛（6.37%）、2,2,4, 6,6-五甲基庚烷（4.25%）、肉桂醛（3.19%）等成分。

綜上，-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R2（型）、地黃苷D、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、黨參炔苷、綠原酸、牡荊素鼠李糖苷等可作為FES的潛在Q-Marker，詳細(xì)信息見表2和圖4。

4 結(jié)語

FES作為現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，具有氣血雙補(bǔ)之功效，臨床主要用于治療貧血、白細(xì)胞減少癥、輔助治療癌癥等。本文在全面總結(jié)其化學(xué)成分、藥理作用的基礎(chǔ)上，基于Q-Marker五原則，從處方的質(zhì)量傳遞與溯源出發(fā)，以有效性為核心，結(jié)合成分特有性、可定量性及復(fù)方配伍合理性等，最終確認(rèn)FES的Q-Marker，為FES的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。但目前研究中，對(duì)FES整方的化學(xué)成分含量測(cè)定主要集中在紅參、黨參、熟地黃、山楂等中藥上，對(duì)君藥阿膠的成分研究較少，其本身化學(xué)成分并不完全清晰，因此在所篩選的Q-Marker中，來源于阿膠的成分只有幾個(gè)氨基酸，這顯然不夠合理，但基于目前的研究無法找到更合適的成分，因此對(duì)于FES的研究尤其是對(duì)其君藥阿膠的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究尤為迫切。

阿膠是我國傳統(tǒng)動(dòng)物藥，主要含有蛋白多肽類成分，該類成分種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)其中藥效成分的結(jié)構(gòu)解析一直是限制阿膠發(fā)展的瓶頸問題。以往研究者多采用傳統(tǒng)的色譜法、質(zhì)譜法等對(duì)阿膠進(jìn)行分離并鑒定，再以體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其活性，這種方式是片面的，而且難以解釋各成分間的協(xié)同作用，不符合中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。近年來基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，該技術(shù)可同時(shí)發(fā)現(xiàn)樣品中數(shù)萬種蛋白質(zhì)，為阿膠中蛋白多肽類成分進(jìn)行定性和定量表征提供技術(shù)上的支持。筆者認(rèn)為，未來可充分利用蛋白組學(xué)技術(shù)，基于大樣本解析阿膠中穩(wěn)定且大量存在的蛋白、多肽類成分，配合藥理實(shí)驗(yàn)及數(shù)學(xué)模型可建立阿膠的成分譜與藥效之間的關(guān)聯(lián)，挖掘阿膠活性成分群，形成阿膠乃至動(dòng)物藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)的新方向，推動(dòng)阿膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升。FES以阿膠為君藥，其整體療效以阿膠的藥理作用為基礎(chǔ)，因此需要在明晰阿膠活性成分的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究整方中阿膠貢獻(xiàn)的活性成分，進(jìn)而推動(dòng)FES的質(zhì)量控制水平全面提升。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和研究的不斷深入，更多的活性成分將會(huì)被發(fā)掘并成為其Q-Marker的候選，使FES的質(zhì)量控制更加科學(xué)合理。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents and pharmacological effects of Fufang E’jiao Syrup and predictive analysis of its quality marker

YU Xiaojun1, 2, 3, 4, WANG Bin1, WANG Changlin1, GAO Peng2, GAO Yan2, 3, 4, ZHAO Bonian2, 3, 4

1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. Institute of Pharmaceutical Research, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 3. Collaborative Innovation Center for Ecological Protection and High Quality Development of Characteristic Traditional Chinese Medicine in Yellow River Basin, Jinan 250355, China 4. High Level Traditional Chinese Medicine Key Disciplines of the National Administration of Traditional Chinese Medicine: Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

Fufang E’jiao Syrup (復(fù)方阿膠漿, FES) has the effects of tonifying blood and nourishing. Clinically, it is mainly used for the treatment of tumors, hematological systems, and gynecological diseases. However, there are few studies on its chemical composition and pharmacodynamic material basis, and the quality control methods are backward. Based on research progress on chemical constituents and pharmacological effects of FES, its quality markers were predicted and analyzed according to the “Five Principles”. The results suggested that-hydroxyproline, glycine, alanine, proline, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re,-notoginsenoside R2, rehmannioside D, jionoside A1, acteoside, isoacteoside, lobetyolin, chlorogenic acid and vitexin-rhamnoside can be used as quality markers of FES, which can provide reference for its quality standard improvement and other research in the future.

Fufang E’jiao Syrup; quality markers; quality control;-hydroxyproline; ginsenoside Re;-notoginsenoside R2; rehmannioside D; chlorogenic acid

R285

A

0253 - 2670(2024)09 - 3157 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.029

2023-11-10

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021CXGC010511）；山東省自然科學(xué)基金聯(lián)合基金（ZR2021LZY021）

于小鈞，男，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量綜合評(píng)價(jià)。E-mail: yxj970331@sina.com

通信作者：趙渤年，男，研究員，博士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)、中藥有效成分分離和新藥研究。E-mail: bon-ianzh@163.com

高 燕，女，博士，副教授，從事中藥質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)及新藥研究。E-mail: gaoyaningyes@163.com

[責(zé)任編輯 趙慧亮]