熱毒寧注射液霧化吸入給藥的安全性研究

張騰之，宋 玲#，唐黎明，侯紅平，谷舒怡，高云航，航 艾，李 晗，彭 博，陳韡亞，陳騰飛，張廣平

熱毒寧注射液霧化吸入給藥的安全性研究

張騰之1，宋 玲1#，唐黎明2，侯紅平1，谷舒怡2，高云航1，航 艾2，李 晗1，彭 博1，陳韡亞1，陳騰飛1*，張廣平1*

1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700 2. 上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院藥理毒理所，上海 201112

針對熱毒寧注射液霧化吸入給藥后可能的安全性風(fēng)險開展研究，為熱毒寧注射液霧化吸入臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)和依據(jù)，探討中藥霧化吸入制劑臨床前安全性評價的技術(shù)方法。在GLP條件下開展熱毒寧注射液大鼠霧化吸入單次給藥和重復(fù)給藥30 d毒性實(shí)驗(yàn)，大鼠黏膜刺激（伴隨反復(fù)給藥觀察）和豚鼠全身主動過敏實(shí)驗(yàn)。在連續(xù)給藥7 d后，分別在停藥1、7、14 d時對熱毒寧注射液在肺中檢測到的31種成分進(jìn)行分析。大鼠單次口鼻暴露120 min/次、2次/d，動物未見明顯異常；熱毒寧低、中、高劑量（30、60、120 min/d）組大鼠口鼻吸入重復(fù)給藥30 d、恢復(fù)期14 d毒性實(shí)驗(yàn)對血液學(xué)、血液生化、肺系數(shù)、尿液、組織病理學(xué)未見藥物相關(guān)的病理改變，對呼吸道黏膜未見刺激性。豚鼠全身主動過敏實(shí)驗(yàn)為陰性。所分析到的熱毒寧注射液的31種成分在停藥14 d后所有成分均檢測不到或者在檢測限下。熱毒寧注射液霧化吸入給藥對呼吸道黏膜無刺激和過敏，大鼠口鼻暴露1個月未見明顯毒性反應(yīng)，所測定的31種成分均能夠在肺部代謝，無明顯沉積。

熱毒寧注射液；霧化吸入；安全性；肺沉積；梔子苷；新綠原酸；綠原酸；隱綠原酸

相對于傳統(tǒng)的口服和注射給藥，霧化吸入給藥治療呼吸道疾病具有明顯的優(yōu)勢。霧化吸入給藥為肺部靶向給藥，可提高呼吸道的藥物濃度，同時可以避免首過效應(yīng)和胃腸道降解，因而能夠提高藥物的療效。霧化吸入給藥劑量遠(yuǎn)低于注射和口服給藥，藥物進(jìn)入全身血液循環(huán)的濃度大幅度降低，因而極大地減少了藥物全身暴露可能的安全性風(fēng)險。盡管目前中藥仍然沒有霧化吸入制劑上市，但是其作為一種療法在臨床廣泛應(yīng)用。近年來將中藥注射劑霧化吸入應(yīng)用于臨床治療呼吸系統(tǒng)疾病有大量報道[1]。熱毒寧注射液是由青蒿、金銀花、梔子3味中藥經(jīng)過水蒸氣蒸餾技術(shù)、連續(xù)逆流萃取技術(shù)和超濾膜分離技術(shù)提純精制而成的中藥注射劑。臨床用于治療外感風(fēng)熱所致感冒、咳嗽，癥見高熱、微惡風(fēng)寒、頭痛身痛、咳嗽、痰黃等。臨床報道顯示熱毒寧注射液采用霧化吸入方式給藥，在治療急性上呼吸道感染[2-3]、急性支氣管炎[4]、慢性支氣管炎[5]、毛細(xì)支氣管炎[6-10]等呼吸道疾病上取得了良好的療效。然而將注射液霧化吸入給藥屬于用藥途徑改變，其臨床前的安全性研究仍然是空白，注射制劑用于霧化吸入方式給藥帶來的呼吸道高暴露、藥物成分肺沉積及對黏膜刺激等安全性問題尚需論證。本研究首先基于《中國藥典》2020年版四部0111吸入制劑項(xiàng)下供霧化器用液體制劑的規(guī)定，對熱毒寧注射液作為霧化吸入制劑的可行性進(jìn)行評估，在此基礎(chǔ)上通過熱毒寧注射液大鼠霧化吸入急性毒性、重復(fù)給藥30 d毒性、大鼠黏膜刺激和豚鼠全身主動過敏實(shí)驗(yàn)，對熱毒寧注射液在肺中成分進(jìn)行檢測，對熱毒寧注射液霧化吸入給藥的臨床前安全性進(jìn)行研究，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g，6～8周齡，雌雄各半，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0005。SPF級SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，6～8周齡，雌雄各半，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0006。SPF級Hartley豚鼠，體質(zhì)量298.0～371.3 g，5～6周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0011。動物合格證號為2015000548281、11400700359727、1100111911043753、1100111911043753、11400700359729、11400700262038。本實(shí)驗(yàn)中涉及操作均符合本單位倫理委員會要求和標(biāo)準(zhǔn)。動物倫理編號為IACUC-SIFDC17119、IACUC-SIFDC18103、IACUC-SIFDC17100。單次多次給藥毒性實(shí)驗(yàn)、過敏反應(yīng)均在上海市食品藥品檢驗(yàn)所藥物安全評價中心開展；肺組織沉積實(shí)驗(yàn)在北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)房開展，均為屏障環(huán)境。

1.2 藥品與試劑

熱毒寧注射液（批號180709）購自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司；氯化鈉注射液（批號16102102）購自華裕（無錫）制藥有限公司；梔子苷對照品（批號110749-201718，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.6%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品新綠原酸（批號MUST-18031001，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.67%）、綠原酸（批號MUST-18030620，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.39%）、隱綠原酸（批號MUST-18032403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.07%）購自成都曼思特生物科技有限公司；肝素鈉（批號B02M8S30252）購自上海源葉生物科技有限公司；戊巴比妥鈉、甲醇（色譜純）購自德國Merck公司；甲酸（色譜純）購自美國ROE公司；0.9%氯化鈉注射液（批號1901293203）購自石家莊四藥有限公司。

1.3 儀器

Pari LC PLUS霧化發(fā)生器、Turbo Boy N型藍(lán)芯霧化器（德國Pari公司）；IES-N型口鼻式吸入暴露系統(tǒng)（上海瑞曼信息科技有限公司）；PCXR8型采樣泵（美國SKC公司）；LLC型Intox7級聯(lián)撞擊器（美國In-Tox Products公司）；4146型流量校準(zhǔn)計（美國TSI公司）；ADVIA 2120i型血液分析儀（西門子公司）；CA1500型全自動血凝儀（日本Sysmex公司）；URIT-1600型全自動尿液分析儀（優(yōu)利特）；7100型全自動生化分析儀（日本HITACHI公司）；ASP6025型旋轉(zhuǎn)式組織處理機(jī)、Histocore組織包埋處理中心、ST5020型自動組織切片染色機(jī)（德國Leica公司）；MICROM HM 315型旋轉(zhuǎn)切片機(jī)（美國Thermo公司）；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)由ExionLC AC超高效液相儀及QTRAP 5500質(zhì)譜儀組成，系統(tǒng)工作軟件為Analyst 1.62（美國Sciex公司）；601-2202-002 Rev04型、601-2202-002 Rev05型動物口鼻暴露系統(tǒng)（美國DSI公司）；RVC 2-18 CD plus真空離心濃縮系統(tǒng)（德國CHRIST公司）；T18 digital ultra turrax高速分散勻漿機(jī)（德國IKA公司）；5424R型臺式離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Vortex-genie2型可調(diào)速渦旋混合器（美國Industrial Scientific公司）；BCD-189WDPV型?20 ℃低溫冰箱（海爾集團(tuán)公司）。

2 方法

2.1 霧化質(zhì)量控制

2個Y型并聯(lián)的Pari LC PLUS霧化發(fā)生器，發(fā)生體積流量4 L/min；口鼻式吸入暴露系統(tǒng)：雙層塔，每層12孔，每層裝12只動物。熱毒寧注射液符合相關(guān)治療標(biāo)準(zhǔn)，霧化器為Pari Turbo Boy N藍(lán)芯；呼吸模擬器型號為BRS2000。結(jié)果以綠原酸計，遞送速率0.71 mg/min，遞送總量1.92 mg。

按照吸入制劑微細(xì)粒子空氣動力學(xué)特征測定法（《中國藥典》2020年版四部0951）以裝置3（NGI）項(xiàng)下供霧化器用的液體制劑檢查法檢查微細(xì)粒子劑量。以綠原酸和梔子苷計，空氣動力學(xué)中值直徑（mass median aerodynamic diameter，MMAD）約為4.6 μm，微細(xì)粒子分?jǐn)?shù)（fine particle fraction，F(xiàn)PF）為46%。

2.2 熱毒寧注射液大鼠口鼻吸入單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)

取體質(zhì)量合格的Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為陰性對照組和熱毒寧組，每組20只，雌雄各半。熱毒寧組霧化吸入給藥120 min，2次/d，間隔4 h，陰性對照組動物同法吸入空氣。給藥后觀察14 d，觀察給藥后14 d內(nèi)動物反應(yīng)癥狀，對觀察期結(jié)束后的存活動物進(jìn)行大體解剖，觀察臟器病變情況。

2.3 熱毒寧注射液大鼠口鼻吸入重復(fù)給藥30 d恢復(fù)期14 d毒性實(shí)驗(yàn)

取Wistar大鼠120只，雌雄各半，隨機(jī)分為陰性對照組和熱毒寧低、中、高劑量組，每組30只，每籠5只飼養(yǎng)。熱毒寧低、中、高劑量組暴露時間分別為30、60、120 min。陰性對照組動物同法吸入空氣，吸入時間與同周期內(nèi)吸入時間最長的組相同，1次/d，連續(xù)30 d，停藥恢復(fù)期為14 d。實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠一般狀況（發(fā)病、死亡、體質(zhì)量、攝食攝水、毛發(fā)、皮膚、腺體分泌、糞便形狀、呼吸及循環(huán)系統(tǒng)、自主效應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)）及血液學(xué)指標(biāo)，每日給藥前觀察大鼠鼻腔黏膜與口腔黏膜可視范圍內(nèi)有無紅腫、流血、潰瘍等現(xiàn)象，給藥后即刻觀察動物局部刺激癥狀（如哮喘、咳嗽、嘔吐、窒息等癥狀），對解剖動物進(jìn)行大體觀察和組織病理學(xué)觀察。

2.4 熱毒寧注射液全身主動過敏試驗(yàn)

取體質(zhì)量合格的豚鼠32只，按隨機(jī)分組表均分為陰性對照組、陽性對照組和熱毒寧高、低劑量組。熱毒寧高劑量組取受試物原液作為致敏液與激發(fā)液，致敏給藥時間60 min，激發(fā)時給藥時間為120 min。熱毒寧低劑量組取受試物原液作為致敏液與激發(fā)液，致敏給藥時間為30 min，激發(fā)給藥時間為60 min。陰性對照組采用氯化鈉注射液原液，吸入時間與同周期內(nèi)吸入時間最長的組相同。陽性對照組致敏時取卵白蛋白，以氯化鈉注射液配制成3 mg/mL致敏液，與熱毒寧組同法霧化致敏液20 min。激發(fā)時取卵白蛋白，以氯化鈉注射液配制成6 mg/mL激發(fā)液，與熱毒寧組同法霧化致敏液最長至40 min。

實(shí)驗(yàn)中致敏階段受試物與對照品均采用口鼻霧化方式給藥，每隔1 d給藥1次，連續(xù)3次。激發(fā)階段仍采用口鼻霧化方式給藥，各組各取半數(shù)動物于末次致敏后第14、21天進(jìn)行激發(fā)。每次致敏和激發(fā)當(dāng)日稱量記錄每組每只動物的體質(zhì)量。致敏期間，每日觀察記錄動物的一般癥狀。激發(fā)當(dāng)日，動物口鼻霧化給予熱毒寧高、低劑量組或陰性、陽性對照藥物后即刻至30 min，詳細(xì)觀察每只動物的反應(yīng)，記錄癥狀的出現(xiàn)及消失時間。

2.5 熱毒寧注射液大鼠肺組織沉積實(shí)驗(yàn)

2.5.1 分組、給藥和取材 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，取體質(zhì)量合格的大鼠54只，隨機(jī)分為空白組、熱毒寧低、高劑量（30、120 min/次）組，每組18只，雌雄各半，每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。首次給藥前，大鼠禁食過夜，正常飲水，給藥開始時禁食禁水，給藥后2 h恢復(fù)飲水，4 h恢復(fù)飲食。各組大鼠分別在末次給藥結(jié)束后1、7、14 d進(jìn)行處理和取材，每組每個取材點(diǎn)各處理6只動物，雌雄各半。動物處理前禁食過夜，正常飲水。大鼠麻醉后，腹主動脈采盡血液，采集完整的肺組織。取肺組織用流動的生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，稱定質(zhì)量，?20 ℃保存。將肺組織37 ℃水浴解凍，剪成小塊，加入4倍體積的生理鹽水，冰浴勻漿3 min，?20 ℃保存。

2.5.2 工作溶液配制 精密稱取梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸對照品適量，分別置10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容，搖勻后取該母液適量，分別用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的對照品儲備液。取一定量的各化合物儲備液，混合后加甲醇配制成梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質(zhì)量濃度分別為1、10、2、5 μg/mL的混合對照品溶液（MIX0），用甲醇按一定比例將MIX0稀釋成梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質(zhì)量濃度分別為1、10、2、5 ng/mL的混合檢出限工作溶液；取一定量的各化合物儲備液，混合后加甲醇配制成梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質(zhì)量濃度分別為2、20、5、10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（MIX1），用甲醇按一定比例將MIX1稀釋成梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質(zhì)量濃度分別為2、20、5、50 ng/mL的混合定量限工作溶液。于?80 ℃冰箱冷凍保存。

2.5.3 樣品處理 精密吸取50 μL檢出限及定量限混合樣品溶液或大鼠肺組織勻漿樣品，加甲醇150 μL，渦旋2 min，超聲1 min，?4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取150 μL上清，45 ℃真空離心濃縮至干燥。加入75 μL 5%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋2 min，?4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)樣分析。

2.5.4 精密度 取“2.5.2”項(xiàng)下混合檢出限和定量限工作溶液各10 μL，各加入大鼠空白肺組織勻漿90 μL，渦旋混勻，得梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.1、1.0、0.2、0.5 ng/mL的混合檢出限質(zhì)控溶液，以及梔子苷、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.2、2.0、0.5、5.0 ng/mL的混合定量限質(zhì)控溶液，之后各取50 μL，按“2.5.3”項(xiàng)進(jìn)行樣品處理并分析，每個批次每個質(zhì)控樣品設(shè)置5個重復(fù)，測定3個批次。

2.5.5 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm），Waters VanGuard Cartridge for Symmetry C18，5 μm預(yù)柱；柱溫40 ℃；流動相為0.05%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～1.5 min，95% A；1.5～10 min，95%～5% A；10～12 min，5% A；12～15.5 min，5%～95% A；15.5～17 min，95% A。體積流量0.5 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；樣品盤溫度6 ℃；分析時間17 min。

2.5.6 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式，噴霧電壓?4 500 V，輔助氣1（N2）50 Arb，輔助氣2（N2）50 arb，輔助氣加熱溫度550 ℃，氣簾氣35 arb。采用MRM掃描方式對31個化合物進(jìn)行分析，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 熱毒寧注射液吸入溶液中31種檢測成分質(zhì)譜參數(shù)及保留時間

表1（續(xù)）

*為[M＋HCOO]?。

*is [M＋HCOO]?.

3 結(jié)果

3.1 單次給藥毒性

Wistar大鼠霧化吸入熱毒寧注射液，熱毒寧組給藥時間為120 min/次，2次/d，各組動物給藥后即刻均未見明顯異常，未見明顯急性毒性反應(yīng)及動物死亡。動物繼續(xù)觀察14 d，毛發(fā)、行動、精神狀態(tài)、采食、飲水、二便及腔道分泌物均未見明顯異常。給藥后第7、14天稱定質(zhì)量，動物體質(zhì)量均增長。兩組同性別動物在相同實(shí)驗(yàn)周期中體質(zhì)量無明顯組間差異。大體觀察與大體解剖均未見明顯異常。

3.2 多次給藥毒性

3.2.1 一般狀況觀察 給藥期間和給藥結(jié)束后觀察14 d，熱毒寧各劑量組與陰性對照組動物一般狀況未見明顯異常。

3.2.2 動物體質(zhì)量和耗食量觀察 如表2所示，實(shí)驗(yàn)期間動物各組動物的體質(zhì)量呈增長趨勢。與陰性對照組比較，熱毒寧高劑量組雄性動物自第11天起平均體質(zhì)量低于陰性對照組，同時在給藥期間動物耗食量減少，推測可能與動物霧化給藥過程中暴露時間長應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，停止給藥后耗食量較給藥期間增加，雖仍低于陰性對照組，但動物體質(zhì)量增加與其他各劑量組無明顯差異。

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化(, n = 15)

C-陰性對照；RH-熱毒寧高劑量組；RM-熱毒寧中劑量組；RL-熱毒寧低劑量組；與陰性對照組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同。

C-negative control; RH-Reduning high-dose group; RM-Reduning medium-dose group; RL-Reduning low-dose group;*< 0.05**< 0.01negative control group, same as below tables.

3.2.3 血液學(xué)觀察 如表3、4所示，與陰性對照組比較，給藥30 d雄鼠熱毒寧中劑量組紅細(xì)胞、血紅蛋白、血細(xì)胞比容出現(xiàn)明顯異常（＜0.05）；恢復(fù)期末雄鼠熱毒寧高劑量組平均紅細(xì)胞體積、嗜堿性粒細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞，熱毒寧中劑量組嗜堿性粒細(xì)胞以及熱毒寧低劑量組白細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞出現(xiàn)明顯異常（＜0.05、0.01），血液學(xué)其余各檢查指標(biāo)均未見明顯差異。盡管上述指標(biāo)統(tǒng)計數(shù)值出現(xiàn)異常變化，但其相關(guān)聯(lián)的其余血液學(xué)檢查均未見明顯異常，未見明顯量效關(guān)系，故不認(rèn)為以上這些改變具有生物學(xué)意義。

表3 各組雄性大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果(, n = 15)

表4 各組雌性大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果(, n =15)

3.2.4 血液生化結(jié)果 如表5、6所示，與陰性對照組比較，給藥30 d雌鼠熱毒寧中劑量組TG水平出現(xiàn)明顯異常（＜0.05），恢復(fù)期末雄鼠熱毒寧中劑量組GLU水平以及熱毒寧低劑量組GLU和BUN水平出現(xiàn)明顯異常（＜0.05、0.01），血液生化學(xué)其余各項(xiàng)指標(biāo)均未見明顯差異。由于上述指標(biāo)改變?yōu)榕及l(fā)且不具備劑量相關(guān)性，故不認(rèn)為以上這些改變具有生物學(xué)意義。

表5 各組雄性大鼠血生化檢查結(jié)果(, n = 15)

ALT-丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST-天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALP-堿性磷酸酶；TP-血清總蛋白；ALB-血清白蛋白；TB-血清總膽紅素；GLU-血糖；BUN-血尿素氮；CRE-血肌酐；CHO-膽固醇；TG-三酰甘油；CK-肌酸激酶；γ-GT-γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，表6同。

ALT-alanine aminotransferase; AST-aspartate aminotransferase; ALP-alkaline phosphatase; TP-total protein; ALB-albumin; TB-total bilirubin; GLU-glucose; BUN-blood urea nitrogen; CRE-creatinine; CHO-cholesterol; TG-triglyceride; CK-creatine kinase; γ-GT-γ-glutamyl transferase, same as Table 6.

表6 各組雌性大鼠血生化檢查結(jié)果(, n = 15)

3.2.5 臟器系數(shù)結(jié)果 如表7、8所示，與陰性對照組比較，給藥30 d雄鼠熱毒寧高劑量組腦、睪丸、附睪指數(shù)具有顯著差異（＜0.01），熱毒寧中劑量組腦指數(shù)具有顯著差異（＜0.01），熱毒寧低劑量組腦指數(shù)具有顯著差異（＜0.05）；恢復(fù)期末雄鼠熱毒寧高劑量組腎臟、肺臟指數(shù)具有顯著差異（＜0.05），熱毒寧中劑量組肺臟指數(shù)具有顯著差異（＜0.05），熱毒寧低劑量組肝臟指數(shù)具有顯著差異（＜0.01）。給藥30 d雌鼠熱毒寧中劑量組肺臟指數(shù)具有顯著差異（＜0.05），熱毒寧低劑量組腎上腺指數(shù)具有顯著差異（＜0.01）。但是數(shù)值異常變化未見明顯劑量相關(guān)性，臟器系數(shù)以及動物血液學(xué)、血清生化學(xué)結(jié)果均未見明顯相關(guān)性的改變，考慮這些改變無生物學(xué)意義，與給予受試物無關(guān)。

表7 各組雄性大鼠臟器指數(shù)變化(, n = 10)

與RH組比較：#＜0.05##＜0.01，表8同。

#< 0.05##< 0.01RH group, same as below table 8.

表8 各組雌性大鼠臟器指數(shù)變化(, n =10)

3.2.6 組織病理學(xué)觀察 對各組動物的鼻甲、口腔黏膜、咽喉部、氣管及肺部均進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，并對陰性對照組及熱毒寧高劑量組的其他臟器包括心、肝、脾、肺、腎等器官進(jìn)行常規(guī)組織病理學(xué)檢查。大體剖檢與組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，上述檢測未見與藥物相關(guān)的病理表現(xiàn)，各組動物臟器[腦、脊髓、垂體、胸腺、甲狀腺、胃、小腸和大腸、肝臟、腎臟、腎上腺、脾臟、胰腺、氣管、肺、主動脈、心臟、附睪、睪丸、卵巢、子宮、前列腺、坐骨神經(jīng)、膀胱、食管旁淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、骨髓（股骨）、陰道、精囊、眼-哈氏腺]未見明顯異常；所有受試動物鼻黏膜、口腔黏膜及咽喉部組織未見明顯出血、變性等明顯異常改變，肺及氣管組織無明顯滲出、出血及組織壞死等病理反應(yīng)，提示熱毒寧注射液對大鼠口腔黏膜、咽喉部組織及呼吸系統(tǒng)不產(chǎn)生明顯的刺激作用，見圖1。綜上，認(rèn)為熱毒寧注射液未對受試動物產(chǎn)生藥物毒性相關(guān)性病理改變。

3.3 全身主動過敏實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)過程中各組動物致敏和激發(fā)階段體質(zhì)量均增長，均未見其他明顯異常癥狀。陰性對照組和熱毒寧高、低劑量組動物采用不同激發(fā)物質(zhì)霧化激發(fā)后，均未見明顯過敏反應(yīng)，激發(fā)后觀察30 min，動物未見明顯異常。陽性對照組動物激發(fā)后出現(xiàn)不安寧、咳嗽、呼吸急促、呼吸困難、紫紺、痙攣、潮式呼吸、死亡。熱毒寧注射液吸入經(jīng)豚鼠全身主動過敏實(shí)驗(yàn)，過敏反應(yīng)呈陰性。

a-口腔黏膜組織；b-鼻腔前庭部鼻黏膜組織；c-鼻呼吸部鼻黏膜組織；d-鼻嗅部鼻黏膜組織；e-咽喉部組織；f-氣管壁組織；g-肺臟組織。

3.4 大鼠肺組織沉積實(shí)驗(yàn)

3.4.1 熱毒寧注射液藥物成分篩選結(jié)果 梔子苷、新綠原酸、綠原酸及隱綠原酸4種成分是熱毒寧注射液的質(zhì)控成分。其定量分析方法已經(jīng)在前期經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證[10]。另外從熱毒寧注射液中共篩選出其他27種成分。31種成分的相對分子質(zhì)量為138～756，包括環(huán)烯醚萜及其苷類、咖啡?？鼘幩犷?、黃酮及其苷類以及其他糖苷類等。優(yōu)化了31種藥物成分的質(zhì)譜參數(shù)，通過對稀釋2 000倍和4 000倍的熱毒寧溶液樣品進(jìn)行分析和檢測，確定31種藥物成分的保留時間。保留時間見表1，相應(yīng)圖譜見圖2。

3.4.2 4種指標(biāo)成分在大鼠肺組織的檢出限與定量限

（1）檢出限：本實(shí)驗(yàn)條件下，肺組織中梔子苷的檢出限低于0.1 ng/mL，新綠原酸的檢出限低于1 ng/mL，綠原酸的檢出限低于0.2 ng/mL，隱綠原酸的檢出限低于0.5 ng/mL。

（2）定量限：本實(shí)驗(yàn)條件下，肺組織中梔子苷的定量限約為0.2 ng/mL，新綠原酸的定量限約為2 ng/mL，綠原酸的定量限為0.5 ng/mL，隱綠原酸的定量限約為1 ng/mL。

（3）精密度：以各化合物的峰面積計算精密度，結(jié)果顯示，4個化合物檢出限的批內(nèi)精密度RSD在10.0%～11.9%，批間精密度RSD在9.9%～11.2%；4個化合物定量限的批內(nèi)精密度RSD在5.6%～10.3%，批間精密度RSD在6.3%～8.8%。

3.4.3 熱毒寧注射液連續(xù)給藥后不同恢復(fù)期大鼠肺組織沉積研究

（1）4種代表成分的大鼠肺組織沉積研究：如圖3-A所示，隨著恢復(fù)天數(shù)的增加，肺組織中梔子苷的峰面積呈現(xiàn)遞減的趨勢。恢復(fù)期第7天，低劑量組梔子苷的峰面積已經(jīng)基本低于定量限?；謴?fù)期第14天，低、高劑量組梔子苷的峰面積已經(jīng)基本低于檢出限。如圖3-B所示，隨著恢復(fù)天數(shù)的增加，肺組織中新綠原酸的峰面積呈現(xiàn)遞減的趨勢，恢復(fù)期第7、14天，低、高劑量組雌、雄大鼠肺組織中均未檢測到新綠原酸。如圖3-C所示，恢復(fù)期第7天，低、高劑量組綠原酸的峰面積已經(jīng)基本低于定量限?；謴?fù)期第14天，低、高劑量組梔子苷的峰面積已經(jīng)基本低于檢出限。如圖3-D所示，恢復(fù)期第1天大鼠肺組織中均檢測到隱綠原酸；恢復(fù)期第7、14天，低、高劑量組雌、雄大鼠肺組織中均未檢測到隱綠原酸。上述結(jié)果表明梔子苷、綠原酸、新綠原酸均夠在大鼠肺組織中逐漸被代謝和消除。

（2）其他27種藥物成分的大鼠肺組織沉積研究：在其他27種藥物成分的沉積研究中，來源于金銀花的咖啡酸在每個恢復(fù)期取材點(diǎn)僅有1只大鼠肺中可檢測到，其余5只均未檢測到，說明該成分在肺組織中被代謝和消除。京尼平龍膽雙糖苷、jasminoside、山梔子苷、京尼平苷酸、6′′--芥子酰基京尼平龍膽雙糖苷均為環(huán)烯醚萜苷類成分；木犀草苷、芹菜素-7--葡萄糖苷、蘆丁均為黃酮類成分，以及斷氧化馬錢子苷、斷氧馬錢子酸和獐牙菜苷僅能在恢復(fù)期第1、7天能檢測到，其余15種成分在恢復(fù)期1、7和14 d均未檢測到。

1-梔子苷；2-新綠原酸；3-綠原酸；4-隱綠原酸；5-山梔子苷；6-京尼平苷酸；7-京尼平龍膽雙糖苷；8-6′′-O-香豆?；┠崞烬埬戨p糖苷；9-6′′-O-阿魏?；┠崞烬埬戨p糖苷；10-6′′-O-芥子?；┠崞烬埬戨p糖苷；12-奎寧酸；13-咖啡酸；14-1,5-二咖啡?？鼘幩?；15-異綠原酸B；16-異綠原酸A；17-異綠原酸C；18-馬錢苷酸；19-斷氧化馬錢子苷；20-斷氧馬錢子酸；23-阿魏酸；24-原兒茶醛；25-獐牙菜苷；26-蘆??；27-山奈酚；28-芹菜素-7-O-葡萄糖苷；29-木犀草苷；30-槲皮素-3-O-半乳糖苷。

圖3 連續(xù)給藥后不同恢復(fù)期大鼠肺組織中梔子苷 (A)、新綠原酸(B)、綠原酸(C) 和隱綠原酸(D) 的峰面積變化(, n = 18)

4 討論

吸入給藥在治療呼吸道疾病方面具有明顯的優(yōu)勢，近幾年吸入給藥的產(chǎn)品開發(fā)獲得藥品生產(chǎn)企業(yè)的重點(diǎn)關(guān)注，其中毒理研究是其關(guān)鍵的一環(huán)。目前針對吸入藥物非臨床評價的技術(shù)要求，僅經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）頒布了吸入藥物非臨床試驗(yàn)技術(shù)指南。美國FDA提出了針對吸入藥物的非臨床評價建議[11]，2008年藥品審評中心組織專家對于吸入給藥的安全性進(jìn)行討論，針對化藥吸入給藥的安全性公布了《肺部吸入制劑毒理研究的關(guān)注點(diǎn)》。指出吸入給藥藥物直接作用于肺部且有全身吸收，因此肺部、全身性吸入毒性研究十分有價值，其他給藥途徑的毒性無法替代。

霧化吸入給藥為呼吸道的局部給藥，藥物在呼吸道的高暴露，需要關(guān)注藥物對呼吸道黏膜的刺激和過敏。肺泡表面積巨大，血?dú)馄琳媳。x酶少，血流豐富，吸入后藥物能夠迅速入血，藥物吸入給藥的過程中會沉積在口咽部可通過胃腸道入血使藥物在全身暴露，因此還需要關(guān)注藥物全身暴露導(dǎo)致的其他臟器以及胃腸道的毒性。不同于單一成分化藥，中藥成分復(fù)雜藥物成分吸入肺部后期代謝情況尚不清楚，因此對于多成分復(fù)方中藥藥物成分在肺部的滯留可能帶來的風(fēng)險是中藥吸入給藥安全性關(guān)注的焦點(diǎn)。熱毒寧注射液是2005年版《藥品注冊管理辦法》實(shí)施后獲批的第1個中藥注射劑新藥，已經(jīng)在臨床應(yīng)用多年，開展過系統(tǒng)的注射給藥的臨床前的安全性研究。本研究重點(diǎn)關(guān)注呼吸道高暴露以及藥物成分在肺部滯留導(dǎo)致的安全性風(fēng)險，包括霧化吸入給藥黏膜刺激、過敏、重復(fù)給藥對呼吸道帶來的損害以及藥物成分在肺部的滯留。

藥物在肺部沉積的量和沉積部位是影響藥物的安全性和有效性的重要因素，而粒徑的大小是關(guān)鍵，粒徑大小和分布影響著吸入制劑氣溶膠在呼吸道不同部位的沉積量，只有具有足夠小的空氣動力學(xué)粒徑的藥物氣溶膠才可能隨著吸氣進(jìn)入肺部，才能充分暴露因霧化給藥帶來的風(fēng)險。在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，推薦的氣溶膠顆粒MMAD數(shù)值應(yīng)為1～4 μm，而幾何標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)為1.5～3.0[12]。本研究對霧化粒徑進(jìn)行檢測，其MMAD符合相關(guān)要求。實(shí)驗(yàn)采用口鼻暴露系統(tǒng)對動物進(jìn)行霧化給藥，考慮到藥物的濃度不同，藥物霧化產(chǎn)生的粒徑大小、分布以及遞送速率和遞送總量等霧化特性參數(shù)也會產(chǎn)生變化，因而在實(shí)驗(yàn)中不同的劑量是以霧化吸入不同的給藥時間區(qū)分，低、中、高劑量連續(xù)給藥時間分別為30、60、120 min。藥物的毒性與其吸入后藥物的沉積量密切相關(guān)，目前對吸入藥物的沉積測定體內(nèi)技術(shù)包括以放射性同位素標(biāo)記氣霧粒子采用γ閃爍掃描法、單光子發(fā)射計算機(jī)斷層成像、正電子發(fā)射計算機(jī)斷層成像等影像技術(shù)和藥物動力學(xué)體內(nèi)方法和采用模擬支氣管樹觀察粒子在不同部位的沉積的體外方法[13-16]。根據(jù)動物肺活量、霧化氣溶膠濃度、給藥時間計算出吸入量，以此作為毒性的給藥劑量，計算所得低、中、高劑量分別為0.14、0.27、0.54 mL/kg，該劑量包括吸入沉積在口咽的量以及隨著呼吸呼出的量，文獻(xiàn)報道藥物沉積量是吸入量的5%～30%[17]。

重復(fù)給藥一般狀況結(jié)果顯示未見藥物全身暴露導(dǎo)致的明顯毒性反應(yīng)，呼吸系統(tǒng)是藥物的主要靶器官，因此對于呼吸系統(tǒng)的組織病理學(xué)檢查要求的更為細(xì)致，需要對口鼻到肺部整個系統(tǒng)不同切面進(jìn)行病理檢查，結(jié)果顯示，陰性對照組和受試物各劑量組所有受試動物肺、氣管、鼻黏膜、口腔黏膜及咽部均未見明顯病理性改變，其他臟器系統(tǒng)也未見明顯異常，亦未出現(xiàn)豚鼠全身過敏反應(yīng)。

中藥霧化吸入藥液由于其是多成分的復(fù)雜體系，其成分吸入后的代謝清除往往不清楚，其藥物成分在肺部滯留可能帶來的安全性的風(fēng)險是關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究通過檢測熱毒寧注射液吸入后不同時間點(diǎn)藥物成分在肺臟中的濃度來探討藥物在肺部的滯留情況。熱毒寧注射液成分主要包括環(huán)烯醚萜類、木脂素類、香豆素類、倍半萜類、黃酮類、咖啡?？鼘幩犷悺⒎铀犷惡蛦屋祁惖榷喾N成分[18-19]，以及一些微量物質(zhì)如莫諾香、獐牙菜香[20]。熱毒寧注射液化學(xué)成分除了來源于其組成藥材中的成分外[21]還發(fā)現(xiàn)其在制備過程中產(chǎn)生了新的化合物[22]。目前已經(jīng)從熱毒寧注射液中分離和鑒定了100種成分。本研究首先選擇了熱毒寧注射液中的梔子苷、綠原酸、新綠原酸及隱綠原酸4種質(zhì)控成分在肺組織的清除情況開展了重點(diǎn)研究，其次，根據(jù)文獻(xiàn)資料及通過MRM-IDA-EPI方法從熱毒寧注射液中鑒定出的27種成分作為補(bǔ)充研究，從而更全面地評價熱毒寧注射液霧化吸入給藥后藥物成分從肺組織中消除的情況。本研究結(jié)果顯示連續(xù)給藥7 d，停藥恢復(fù)14 d后，4種指標(biāo)成分和其他27種藥物成分均能夠從肺中清除。

在吸入毒理的評價方面，中藥制劑與單一化藥成分有一致的部分，如在實(shí)驗(yàn)方案的總體設(shè)計、動物選擇、實(shí)驗(yàn)的技術(shù)和方法以及指標(biāo)評價等，但中藥因?yàn)槎喑煞謴?fù)雜體系也有其特殊的地方，如何進(jìn)行毒性評價需要進(jìn)一步探討。本研究為熱毒寧注射液吸入制劑的臨床應(yīng)用提供依據(jù)和基礎(chǔ)，同時也為中藥吸入給藥的安全性研究進(jìn)行有益的探索。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Safety study of Reduning Injection after atomization inhalation administration

ZHANG Tengzhi1,SONG Ling1,TANG Liming2, HOU Hongping1,GU Shuyi2, GAO Yunhang1,HANG Ai2,LI Han1,PENG Bo1,CHEN Weiya1,CHEN Tengfei1,ZHANG Guangping1

1. Institute of Chinese Materia Medica China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700, China 2. Department of Pharmacology and Toxicology of Shanghai Institute for Food and Drug Control,Shanghai 201112, China

To carry out a study on the possible safety risks after the administration of Reduning Injection (熱毒寧注射液) by atomization inhalation, to provide a basis for the clinical application of Reduning Injection by atomization inhalation, and to explore the methods of preclinical safety evaluation of traditional Chinese medicine nebulized inhalation preparations.Toxicity tests for single-dose administration and repeated-dose administration for 30 d of Reduning Injection by nebulized inhalation in rats, and mucosal irritation in rats (observed with repeated administration) and active systemic anaphylaxis in guinea pigs were carried out under GLP conditions. The 31 components detected by the compositional analysis of Reduning Injection were examined in the lungs by stopping the drug for 1, 7, 14 d after seven consecutive days of administration.Rats were exposed orally and nasally 120 min/time, 2 times/d, and animals did not show obvious abnormalities; Reduning Injection low-, medium-, high-dose (30, 60, 120 min/d) groups of rats orally and nasally inhalation repeated administration of 30 d and recovery period of 14 d of toxicity test on the hematology, blood biochemistry, lung coefficients, urine, histopathology did not in the drug-related pathology, the mucous membranes of the respiratory tract did not see the irritation. The active systemic anaphylaxis in guinea pigs was negative. All 31 components analyzed for Reduning Injection were either undetectable or below the detection line after 14 d of withdrawal.The nebulized inhalation administration of Reduning Injection did not cause irritation and sensitization to the respiratory mucosa, and no obvious toxic reaction was observed in rats exposed orally and nasally for one month, and all the 31 components determined were able to be metabolized in the lungs without any deposition.

Reduning Injection; atomization inhalation; safety; lung deposition; geniposide;neochlorogenic acid;chlorogenic acid;cryptochlorogenic acid

R285.53

A

0253 - 2670(2024)09 - 3015 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.016

2023-12-04

中國中醫(yī)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程重大攻關(guān)項(xiàng)目（CI2021A04615）；國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（82204740）；中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥藥理創(chuàng)新團(tuán)隊項(xiàng)目（CI2021B015）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（ZXKT22045）；中國中醫(yī)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程課題（CI2023E001TS12）

張騰之（2001—），女，碩士研究生，主要從事中藥藥理研究。E-mail: ztz0113@163.com

宋 玲（1987—）女，助理研究員，主要從事中藥藥理研究。E-mail: lsong@icmm.ac.cn

通信作者：陳騰飛（1986—），男，副研究員，主要從事中藥藥動學(xué)研究。E-mail: flychen04@126.com

張廣平（1975—），男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理毒理研究。E-mail: iamzgp@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]