荊防顆粒對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用

劉冬光，趙文學(xué)#，徐 燕*，姚 茹，孟 雪，姚景春，劉 忠*

荊防顆粒對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用

劉冬光1, 2, 3，趙文學(xué)1, 2, 3#，徐 燕1, 2, 3*，姚 茹1, 2, 3，孟 雪1, 2, 3，姚景春1, 2, 3，劉 忠1, 2, 3*

1. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 新藥藥理中心，山東 臨沂 276006 2. 經(jīng)方與現(xiàn)代中藥融合創(chuàng)新全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006 3. 臨沂市天然藥物免疫藥理毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006

探討荊防顆粒對(duì)db/db小鼠血糖代謝的調(diào)控作用及對(duì)其視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopaphy，DR）的保護(hù)作用。將60只雄性db/db小鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍（120 mg/kg）組及荊防顆粒（1、2 g/kg）組，每組15只，另取15只雄性db/m小鼠作為對(duì)照組，每周檢測(cè)小鼠體質(zhì)量、空腹血糖、攝食量及飲水量等基礎(chǔ)指標(biāo)，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）；采用ELISA檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜組織白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用PAS染色檢測(cè)視網(wǎng)膜組織病理變化；采用Western blotting檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、緊密連接跨膜蛋白（Claudin-1）、胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）、磷酸化IRS1（phosphorylated IRS1，p-IRS1）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠空腹血糖、攝食量、飲水量明顯升高（＜0.01），OGTT中曲線下面積（AUC）顯著升高（＜0.01）；視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA含量顯著升高（＜0.01），CAT、SOD活性顯著下降（＜0.01）；視網(wǎng)膜組織周細(xì)胞降低，新生血管增多（＜0.01），并且視網(wǎng)膜組織中Claudin-1、p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)（＜0.01），VEGF、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)（＜0.01）。與模型組比較，荊防顆粒組小鼠體質(zhì)量明顯升高（＜0.05、0.01），空腹血糖、攝食量、飲水量均有不同程度下降（＜0.05、0.01）；視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA含量顯著下降（＜0.05、0.01），CAT、SOD活性顯著上升（＜0.05、0.01）；視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)有所改善，視網(wǎng)膜組織中Claudin-1、p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.05、0.01），VEGF、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.05、0.01）。荊防顆粒對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜病變具有一定的改善作用，其作用機(jī)制可能為調(diào)節(jié)小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF及Claudin-1蛋白表達(dá)，進(jìn)而激活胰島素受體IRS-1/PI3K/Akt信號(hào)通路，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)視網(wǎng)膜病變起到一定的保護(hù)作用。

荊防顆粒；糖尿?。灰暰W(wǎng)膜；氧化應(yīng)激；凋亡；IRS-1/PI3K/Akt通路

伴隨著人們生活質(zhì)量的提高，糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，糖尿病主要表現(xiàn)為血糖過(guò)高及一系列相關(guān)癥狀，是血糖自平衡失調(diào)而引起的慢性代謝性綜合征[1]，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopaphy，DR）是糖尿病微血管病變中最常見(jiàn)的表現(xiàn)，是一種具有特異性改變的眼底病變。DR是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)糖尿病人群中DR的患病率為20.86%，因DR臨床癥狀較少而不被人們重視，但隨著DR能夠嚴(yán)重影響患者視力，甚至存在致盲的風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)已逐漸進(jìn)入研究范疇[2-3]。

DR的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，推測(cè)其機(jī)制主要涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、新血管生成及視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡等過(guò)程[4]。一方面，當(dāng)機(jī)體的高糖不能通過(guò)正常途徑降解時(shí)，會(huì)激活細(xì)胞多元醇途徑，從而使細(xì)胞內(nèi)形成高滲透狀態(tài)，損傷視網(wǎng)膜的微循環(huán)。同時(shí)，視網(wǎng)膜內(nèi)的高糖環(huán)境會(huì)促進(jìn)糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的形成，從而進(jìn)一步激活活性氧（reactive oxygen species，ROS）信號(hào)通路，促進(jìn)周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。另一方面，高血糖環(huán)境還能夠激活胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）途徑，上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)，促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管生成[5-6]。

目前臨床治療DR的方法主要包括使用各類(lèi)控制代謝的藥物和激素、激光治療及玻璃體切割術(shù)等[7]。但由于DR發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，藥物及手術(shù)治療都存在一定的局限性。傳統(tǒng)藥物治療DR并不能起到根治作用[8]，且藥物治療可能引發(fā)胃腸道反應(yīng)、高熱等不良反應(yīng)；而激光光凝術(shù)雖然能有效降低DR分期并提升臨床有效率[9]，但其不適用于嚴(yán)重玻璃體積血或視網(wǎng)膜前出血的患者，且可能造成患者永久性視網(wǎng)膜損傷及不同程度的視力下降[10]。因此，探尋不良反應(yīng)低、療效好的藥物已成為糖尿病治療的首要問(wèn)題，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為DR屬于“視瞻昏渺”“云霧移睛”等范疇，稱(chēng)其為“消渴內(nèi)障”，中醫(yī)的基本治則是“益氣養(yǎng)陰，活血化瘀通絡(luò)”。越來(lái)越多的研究表明，中藥單體、組方以及中成藥可通過(guò)多種機(jī)制共同作用于DR，有效改善其臨床癥狀。陳晶等[11]研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能夠通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)，從而抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變；桃紅四物湯聯(lián)合激光治療能夠增加患者血清中一氧化氮合酶水平，降低血清中VEGF和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平[12]；荊防顆粒由荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、桔梗、甘草等組成，可通過(guò)影響谷氨酸代謝、能量代謝、葡萄糖代謝等通路調(diào)節(jié)蕁麻疹誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)紊亂，且藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，干預(yù)免疫性炎癥反應(yīng)等作用發(fā)揮抗炎作用[13-16]。因此本研究基于DR的發(fā)病機(jī)制，對(duì)荊防顆粒治療DR的療效及作用機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為中藥治療DR提供研究證據(jù)和思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性db/db小鼠（8～12周、體質(zhì)量40～42 g），SPF級(jí)雄性db/m小鼠（8～12周，體質(zhì)量25～27 g），均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011。小鼠飼養(yǎng)于魯南制藥集團(tuán)股份有限公司新藥安評(píng)中心（GLP）屏障區(qū)大、小鼠實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（魯）2018-0008。飼養(yǎng)條件為室溫20～26 ℃，日溫差≤4 ℃；相對(duì)濕度40%～70%；人工照明，12 h/12 h明暗交替；換氣次數(shù)≥15次/ h；飼喂SPF大小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料，自由飲水和飲食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)魯南制藥集團(tuán)股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)AN-IACUC-2020-034）。

1.2 藥品與試劑

荊防顆粒（批號(hào)802230115）由魯南制藥集團(tuán)股份有限公司提供；鹽酸二甲雙胍腸溶片（批號(hào)H52020955）購(gòu)自貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（批號(hào)P0010S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)2118S）、p-IRS1抗體（批號(hào)2385S）、IRS-1抗體（批號(hào)3089S）、PI3K抗體（批號(hào)4255S）、p-PI3K抗體（批號(hào)17366S）、Akt抗體（批號(hào)9272S）、p-Akt抗體（批號(hào)4060S）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)3498S）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)2772S）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號(hào)9661S）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；VEGF抗體（批號(hào)MA5-13182）、Claudin-1抗體（批號(hào)PA1-37465）均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)A0208）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（批號(hào)A0216）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（批號(hào)ml003057）、小鼠IL-6試劑盒（批號(hào)ml102828）、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號(hào)ml002859）、小鼠過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（批號(hào)ml037079）、小鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)ml059387）、小鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)ml077384）均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 儀器

EVOS FL型顯微鏡、Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；ONETOUCH強(qiáng)生-穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀[強(qiáng)生（中國(guó)）醫(yī)療器材有限公司]；WP-UP-1840型超純水機(jī)（沃特浦）；1645050型電泳儀[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]；FL1000型蛋白成像系統(tǒng)（上海哈靈生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以db/m小鼠作為對(duì)照組，db/db小鼠按血糖值隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍（120 mg/kg）組和荊防顆粒（1、2 g/kg，分別相當(dāng)于臨床等效劑量的1、2倍）組，每組15只。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig等體積生理鹽水（10 mL/kg），1次/d，連續(xù)6周。

2.2 基礎(chǔ)指標(biāo)檢測(cè)

每周定時(shí)禁食6 h后，對(duì)各組小鼠的體質(zhì)量、血糖值、攝食量及飲水量進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）

末次給藥前禁食6 h，并在給藥1 h后ig 4 g/kg的葡萄糖溶液，檢測(cè)各組小鼠在0、30、60、90、120 min后的血糖值變化[17]。

2.4 視網(wǎng)膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平及CAT、SOD活力的檢測(cè)

于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠腹主動(dòng)脈取血后，取各組小鼠視網(wǎng)膜組織制備勻漿液，3 200×離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平及CAT、SOD活力[18-21]。

2.5 PAS染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各組小鼠眼組織，于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，流水輕輕沖洗5 min，從睫狀體后部經(jīng)鋸齒緣環(huán)形剪開(kāi)鞏膜，去除眼前節(jié)部分，隨后將后眼杯以視乳頭為中心切3瓣，輕輕分離出視網(wǎng)膜，將分離出的視網(wǎng)膜用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）輕輕漂洗10 min，加入3%胰蛋白酶于37 ℃恒溫箱消化2 h，用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）漂洗，當(dāng)僅剩下一層透明的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)時(shí)，將其取出并平鋪于載玻片上，置于37 ℃展片器上5 min，以利于血管網(wǎng)展開(kāi)[22]。用流水輕輕沖洗視網(wǎng)膜消化鋪片5 min，隨后加入PAS氧化劑處理5 min，流水輕輕沖洗5 min，以除去殘留的氧化劑，擦干載玻片上多余的水分后滴加Schiff染液，染色10 min，流水沖洗5 min，隨后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)[23]。

2.6 Western blotting檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中VEGF、Claudin-1、p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各組小鼠眼組織并迅速分離出視網(wǎng)膜，按1∶6的比例加入RIPA裂解液，于組織研磨儀以4 ℃、1 200 r/min研磨10 min，隨后以4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，次日PBST洗膜后，加入二抗，室溫孵育2 h，PBST洗膜后，加適量的ECL發(fā)光液顯影，并分析蛋白條帶灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠體質(zhì)量和血糖的影響

如圖1-A所示，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量呈平緩上升趨勢(shì)，db/db小鼠在實(shí)驗(yàn)初期（0～3周）體質(zhì)量均有所增加，但各組之間無(wú)顯著性差異。與模型組比較，第4周荊防顆粒（2 g/kg）組及二甲雙胍組小鼠體質(zhì)量顯著升高（＜0.05），第5～6周各給藥組小鼠體質(zhì)量均顯著升高（＜0.05、0.01）。

如圖1-B所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠各時(shí)間點(diǎn)空腹血糖均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，給予二甲雙胍干預(yù)2周后，小鼠空腹血糖顯著下降（＜0.05、0.01）；給予荊防顆粒干預(yù)3周后，小鼠空腹血糖顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.2 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠攝食量和飲水量的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠攝食量及飲水量明顯增多（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠在給藥3周后攝食量及飲水量均有不同程度的減少（＜0.05、0.01）。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同。

圖2 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠攝食量和飲水量的影響(, n = 15)

3.3 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠OGTT的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖值均顯著升高（＜0.01），曲線下面積顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，荊防顆粒（1 g/kg）組小鼠在0、60、90、120 min時(shí)血糖值均顯著下降（＜0.05），荊防顆粒（2 g/kg）組和二甲雙胍組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖值均顯著下降（＜0.05、0.01），各給藥組曲線下面積均顯著下降（＜0.05、0.01）。

3.4 荊防顆粒對(duì)視網(wǎng)膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平及CAT、SOD活力的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6及TNF-α水平均顯著降低（＜0.05、0.01），表明荊防顆粒對(duì)糖尿病引起的視網(wǎng)膜炎性反應(yīng)具有明顯的改善作用。

圖3 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠OGTT的影響(, n = 15)

圖4 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響(, n = 7)

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中MDA含量明顯升高（＜0.01），CAT、SOD活性均顯著下降（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組MDA含量明顯下降（＜0.05、0.01），CAT、SOD活性均明顯升高（＜0.05、0.01），表明荊防顆粒能夠增強(qiáng)db/db小鼠視網(wǎng)膜組織的抗氧化能力，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。

3.5 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)的影響

如圖6所示，對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)無(wú)異常改變；與對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)微動(dòng)脈瘤、非細(xì)胞毛細(xì)血管增多、內(nèi)皮細(xì)胞增生以及周細(xì)胞選擇性丟失（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠視網(wǎng)膜未見(jiàn)微動(dòng)脈瘤組織，并且非細(xì)胞毛細(xì)血管減少，內(nèi)皮細(xì)胞增生減少及周細(xì)胞丟失率明顯下降（＜0.05、0.01），表明荊防顆粒對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜并發(fā)癥具有良好的改善作用。

3.6 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、Claudin-1蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），Claudin-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01），Claudin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.7 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜組織p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)的影響

如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠視網(wǎng)膜組織中p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖5 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜組織MDA含量及CAT、SOD活力的影響(, n = 7)

圖7 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、Claudin-1蛋白表達(dá)的影響(, n = 15)

圖8 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜組織p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)的影響(, n = 15)

3.8 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜組織Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

如圖9所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），Bcl-2/Bax值顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），Bcl-2/ Bax值顯著升高（＜0.05、0.01）。

4 討論

隨著現(xiàn)代社會(huì)的快速發(fā)展，DR是一種常見(jiàn)和特殊的糖尿病微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致患者視網(wǎng)膜出現(xiàn)慢性損傷，最終導(dǎo)致患者視力模糊，甚至失明的主要原因[24]，因此糖尿病視網(wǎng)膜并發(fā)癥已逐漸成為日益突出的社會(huì)健康問(wèn)題，其病因復(fù)雜，患者由于體內(nèi)長(zhǎng)期的高糖反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體視網(wǎng)膜等多種器官出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[25]，因此開(kāi)展糖尿病視網(wǎng)膜并發(fā)癥的研究有著重大的意義[26-29]。

隨著近幾年的研究發(fā)展，DR已被認(rèn)為是一種長(zhǎng)期低炎癥導(dǎo)致的微血管疾病，可導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜缺血、血管通透性增加、視網(wǎng)膜新生血管增生及糖尿病黃斑水腫等表現(xiàn)[30]，其中細(xì)胞內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致DR發(fā)生及發(fā)展的主要元兇，炎癥因子水平上調(diào)能夠激活VEGF/ Claudin-1、IRS-1/PI3K/Akt、Caspase-3等通路，從而引起視網(wǎng)膜內(nèi)新生血管增加，毛細(xì)血管通透性增加，進(jìn)而發(fā)生BRB滲漏，最終導(dǎo)致患者失明[31]，本研究通過(guò)db/db小鼠模型探討荊防顆粒對(duì)小鼠DR的早期保護(hù)作用。

圖9 荊防顆粒對(duì)db/db小鼠視網(wǎng)膜組織Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響(, n = 15)

據(jù)報(bào)道，VEGF是最有效的促血管生長(zhǎng)因子，在高血糖狀態(tài)下可改變視網(wǎng)膜微環(huán)境，導(dǎo)致缺氧引起內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，從而上調(diào)VEGF的表達(dá)，VEGF上調(diào)可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白Claudin-1的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管生成[32]。Zhang等[33]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)，可阻止血管的生成，改善DR。也有文獻(xiàn)報(bào)道IL-6可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，與VEGF等產(chǎn)生協(xié)同作用，最終導(dǎo)致新生血管形成及微導(dǎo)管閉塞，加快DR的進(jìn)展[34]。TNF-α也可引起VEGF水平的提高，使視網(wǎng)膜通透性有所增加，同時(shí)誘發(fā)新生血管[34]。SOD是維護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和血管功能的關(guān)鍵酶，也是主要的自由基清除劑，在胰島β細(xì)胞內(nèi)高度集中，維持β細(xì)胞在體內(nèi)的平衡[35]。MDA是膜脂過(guò)氧化的一種重要產(chǎn)物，可以使視網(wǎng)膜細(xì)胞通透性和流通性改變，最終導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的改變。有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)中藥治療后糖尿病大鼠靜脈血清SOD、MDA值均有顯著性改變[36]，本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA含量升高，CAT、SOD活性下降，同時(shí)VEGF表達(dá)上調(diào)，Claudin-1表達(dá)下調(diào)，給予荊防顆粒處理可顯著改善上述異常指標(biāo)。

IRS-1/PI3K/Akt作為胰島素抵抗的經(jīng)典信號(hào)通路，是其調(diào)節(jié)血糖平衡的重要信號(hào)通路之一[37-38]，IRS-1是胰島素受體激活后發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要因子，也是參與胰島素等重要細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的磷酸化蛋白，參與調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)也參與著細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝過(guò)程，當(dāng)胰島素受體底物被激活，會(huì)促進(jìn)IRS-1蛋白磷酸化，促使下游PI3K/Akt信號(hào)通路被激活[39]，活化的PI3K參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種功能，Akt作為PI3K信號(hào)通路的主要下游信號(hào)傳導(dǎo)物，活化后在胰島素傳導(dǎo)通路中也扮演著重要的降血糖功能，并且激活的IRS-1/PI3K/Akt信號(hào)通路可以增加體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)糖原代謝，從而達(dá)到降血糖的目的[40]，本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中p-IRS1/IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達(dá)下調(diào)，給予荊防顆粒處理可顯著上調(diào)其表達(dá)水平。

有文獻(xiàn)表明，視網(wǎng)膜與視神經(jīng)中含有大量的線粒體，為視覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)提供三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）[41]，細(xì)胞凋亡損傷視網(wǎng)膜細(xì)胞及血管功能，不可避免地引起DR的進(jìn)展[42]。Caspase正常情況下以酶原形式位于細(xì)胞質(zhì)中，并無(wú)活性，當(dāng)收到凋亡信號(hào)的刺激后，可被激活，裂解為有酶解活性的異二聚體，并通過(guò)裂解特異底物和激活內(nèi)源性核酸酶，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[43]。細(xì)胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，是線粒體凋亡通路激活的標(biāo)志[44]。在正常情況下，Cyt-C主要存在于線粒體內(nèi)外膜之間的腔隙內(nèi)，當(dāng)線粒體損傷時(shí)，Cyt-C從線粒體膜間隙釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）結(jié)合形成寡聚體復(fù)合物，進(jìn)一步結(jié)合Caspase-9酶原形成凋亡體，Caspase-9活化后能激活下游Caspase-3，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[45]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào)、Bcl-2表達(dá)下調(diào)，給予荊防顆粒處理可顯著下調(diào)Bax、cleaved Caspase-3的表達(dá)水平，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平，由此推測(cè)，荊防顆?？赏ㄟ^(guò)激活VEGF/Claudin-1、IRS1/PI3K/Akt、Caspase-3等信號(hào)通路，發(fā)揮視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。

綜上，荊防顆粒緩解DR的機(jī)制已初步明確，前期亦有文獻(xiàn)表明，防風(fēng)通圣散聯(lián)合二甲雙胍片可治療腹型肥胖2型糖尿病[46]，桂枝茯苓丸對(duì)于治療DR也具有很好的療效，可有效改善糖尿病大鼠眼底病變[47]，同時(shí)，丹參川芎嗪注射液可用于治療2型糖尿病血管病變的臨床觀察，并且能有效降低血糖、血脂、糖化血紅蛋白及血液流變學(xué)等指標(biāo)[48]，由此推測(cè)荊防顆粒發(fā)揮抗DR藥效的成分主要為防風(fēng)、羌活、川芎、茯苓等，但其具體的作用靶點(diǎn)還需進(jìn)一步深入研究，為DR的臨床治療提供更多的科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect of Jingfang Granules on retina of diabetic mice

LIU Dongguang1, 2, 3, ZHAO Wenxue1, 2, 3, XU Yan1, 2, 3, YAO Ru1, 2, 3, MENG Xue1, 2, 3, YAO Jingchun1, 2, 3, LIU Zhong1, 2, 3

1. New Drug Pharmacology Center of Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China 2. State Key Laboratory of Integration and Innovation of Classic Formula and Modern Chinese Medicine, Linyi 276006, China 3. Linyi Key Laboratory of Immunopharmacology and Toxicology of Natural Drugs, Linyi 276006, China

To investigate the regulation of Jingfang Granules (荊防顆粒) on blood glucose metabolism and protective effect of diabetic retinopaphy (DR) in db/db mice.A total of 60 male db/db mice were randomly divided into model group, metformin (120 mg/kg) group, Jingfang Granules (10, 20 mg/kg) groups, with 15 mice in each group, and 15 male db/m mice were selected as control group. The basic indexes such as body weight, fasting blood glucose, food intake and water intake of mice were detected weekly. After the experiment, oral glucose tolerance test (OGTT) was detected; The levels of interleukin-1β (IL-1β), IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α), malondialdehyde (MDA) and the activities of catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) in mouse retinal tissue were detected by ELISA; PAS staining was used to detect the pathological changes of retinal tissue; Western blotting was used to detect the protein expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF), tight junction transmembrane protein (Claudin-1), insulin receptor substrate 1 (IRS1), phosphorylated IRS1 (p-IRS1), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), phosphorylated PI3K (p-PI3K), protein kinase B (Akt), phosphorylated Akt (p-Akt), B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2 associated X protein (Bax), and cleaved cystein-asparate protease-3 (cleaved Caspase-3) in retinal tissue.Compared with control group, fasting blood glucose, food intake and water intake of mice in model group were significantly increased (< 0.01), AUC in OGTT was significantly increased (< 0.01); The levels of IL-1β, IL-6, TNF-α, MDA in retinal tissue were increased (< 0.01). CAT and SOD activities were decreased (< 0.01); The number of peripheral cells in retinal tissue was decreased and the number of new blood vessels was increased (< 0.01), protein expressions of Claudin-1, p-IRS1/IRS1, p-PI3K/PI3K, p-Akt/Akt and Bcl-2 were down-regulated (< 0.01), VEGF, Bax and cleaved Caspase-3 protein expressions were up-regulated (< 0.01). Compared with model group, body weight of mice in Jingfang Granules group was significantly increased (< 0.05, 0.01), fasting blood glucose, food intake and water intake were decreased to varying degrees (< 0.05, 0.01); The levels of IL-1β, IL-6, TNF-α and MDA in retinal tissue were decreased (< 0.05, 0.01). CAT and SOD activities were increased (< 0.05, 0.01); The histopathologic morphology of retina was improved, and the protein expressions of Claudin-1, p-IRS1/IRS1, p-PI3K/PI3K, p-Akt/Akt, Bcl-2 in retinal tissue were up-regulated (< 0.05, 0.01), VEGF, Bax and cleaved Caspase-3 protein expressions were down-regulated (< 0.05, 0.01).Jingfang Granules can improve retinopathy in db/db mice to a certain extent, and its mechanism may be related to regulating the expressions of VEGF and Claudin-1 protein in retinal tissue of mice, thus activating the insulin receptor IRS-1/PI3K/Akt signaling pathway, initiating the Caspase cascade reaction, and inhibiting the apoptosis of retinal epithelial cells. Thus, it has a certain protective effect on retinopathy.

Jingfang Granules; diabetes; retina; oxidative stress; apoptosis; IRS-1/PI3K/Akt pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2024)09 - 2996 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.014

2023-11-04

山東省重大科技創(chuàng)新工程（2020CXGC010505，2021CXG010508）

劉冬光（1986—），男，碩士，中藥新藥研發(fā)與安全性評(píng)價(jià)。E-mail: 15866975281@163.com

趙文學(xué)（1994—），男，碩士，中藥新藥研發(fā)與安全性評(píng)價(jià)。E-mail: zwx940108@163.com

通信作者：徐 燕（1982—），女，碩士，中藥新藥研發(fā)與安全性評(píng)價(jià)。E-mail: xuyan119716@163.com

劉 忠（1975—），男，研究員，中藥新藥研發(fā)與安全性評(píng)價(jià)。E-mail: clevertree@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]