氧化芍藥苷在正常與抑郁大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的比較研究

金 朝，鄭大華，何昊奇，于 猛，鄒忠梅

氧化芍藥苷在正常與抑郁大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的比較研究

金 朝1，鄭大華2，何昊奇2，于 猛2*，鄒忠梅2*

1. 遵義醫(yī)科大學藥學院，貴州 遵義 563000 2. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193

研究氧化芍藥苷在正常和抑郁大鼠血漿、尿液、糞便中代謝產(chǎn)物的差異，并推測其主要的代謝途徑。選取Wistar大鼠，復制慢性應激抑郁大鼠，分別連續(xù)ig給予正常和抑郁大鼠氧化芍藥苷水溶液3 d，收集大鼠血清、尿液和糞便；利用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術結合UNIFI分析平臺鑒定氧化芍藥苷在正常和抑郁模型大鼠體內(nèi)的原型成分及代謝產(chǎn)物。在正常和抑郁大鼠血漿中均檢測到氧化芍藥苷原型成分，且在抑郁大鼠血漿中的相對含量是正常大鼠血漿的10倍；在抑郁大鼠血漿、尿液和糞便中分別鑒定出4、13、2個代謝產(chǎn)物，在正常大鼠血漿、尿液和糞便中分別鑒定出1、12、3個代謝產(chǎn)物，其中11個共有代謝產(chǎn)物，主要發(fā)生的代謝途徑為氧化、去飽和等I相代謝反應，甲基化、葡萄糖醛酸化、乙酰化等II相代謝反應。氧化芍藥苷ig給藥后主要以原型成分進入體內(nèi)，且抑郁大鼠血漿中原型成分的相對含量較正常大鼠高10倍；在抑郁和正常大鼠中的代謝產(chǎn)物有差異，其中葡萄糖醛酸化為正常大鼠體內(nèi)特有的代謝途徑，乙?；癁橐钟舸笫篌w內(nèi)特有的代謝途徑。推測氧化芍藥苷可能是以原型成分為主發(fā)揮藥效作用，通過尿液和糞便以原型或代謝產(chǎn)物排泄。

氧化芍藥苷；抗抑郁；代謝產(chǎn)物；代謝途徑；芍藥苷

抑郁癥是一種慢性情緒障礙類疾病，其主要的臨床表現(xiàn)為厭食、快感消失、注意力不集中等，具有高發(fā)病率和高自殺率等特點?，F(xiàn)今全世界抑郁癥患者約有3.5億，患病率約為5%[1-2]，嚴重威脅人類的生命健康。抑郁癥的發(fā)病機制復雜，多種因素可導致抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展，治療抑郁癥的藥物包括單胺類神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)劑（如氟西?。?、5-羥色胺再攝取抑制劑（如舍曲林）等[3]，但長期使用這些藥物易產(chǎn)生耐藥性，不良反應也很明顯[4]。因此，目前市場上的抗抑郁癥藥物遠遠不能滿足患者的需求。近年來，天然產(chǎn)物來源的小分子藥物，因其療效顯著、不良反應小等優(yōu)勢，已成為藥物開發(fā)的重要來源[5]。

氧化芍藥苷是一種來源于芍藥、牡丹等藥用植物中的單萜類小分子化合物[6-8]，研究發(fā)現(xiàn)氧化芍藥苷具有明確的抗抑郁活性[9-10]。藥物進入體內(nèi)發(fā)揮藥效的物質(zhì)可能是其原型成分，也可能是其代謝產(chǎn)物，因此研究藥物體內(nèi)代謝過程對其藥效成分的篩選具有重要意義[11]。采用單次口服給予正常小鼠氧化芍藥苷，經(jīng)HPLC-DAD-ESI-IT-TOF-MSn從小鼠血漿中鑒定到原型成分及其代謝產(chǎn)物[12]。但病理狀態(tài)與正常動物的體內(nèi)微環(huán)境不同，其對藥物的代謝情況也存在差異[13-15]。因此，基于病理狀態(tài)的動物模型考察藥物代謝更能直觀的反映藥物進入體內(nèi)的動態(tài)過程。

因此，本研究采用超高效液相色譜四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術結合UNIFI軟件研究氧化芍藥苷在抑郁大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物及其代謝途徑，并與正常大鼠體內(nèi)的代謝過程進行比較，以期為研究氧化芍藥苷的體內(nèi)作用機制提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY TM UPLC?超高效液相色譜串聯(lián)SYNAPT G2 HDMS高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國Waters公司）；ET3301A型全自動氮吹濃縮儀（上海歐陸科儀有限公司）；S0200-230V-EU型渦旋混合儀（美國Labnet公司）；MassLynx TM工作站（美國Waters公司，Version 4.1）；96孔正壓提取裝置（美國Waters公司）。

1.2 試劑及材料

質(zhì)譜級甲醇、乙腈（美國Thermo Fisher公司）；質(zhì)譜級甲酸（美國Thermo Fisher公司）；水為超純水；戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥公司上海化學試劑公司，批號65-06-24）；氧化芍藥苷（oxypaeoniflorin，批號201912，質(zhì)量分數(shù)≥98%）由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所國家中藥化合物庫提供，其化學結構見圖1。

圖1 氧化芍藥苷的化學結構

1.3 動物及給藥

雄性Wistar大鼠，SPF級，體質(zhì)量180～200 g，購于維通利華實驗動物有限公司，所有大鼠在動物房中適應性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)條件：溫度20～25 ℃，濕度（50±10）%，保持12 h照明與12 h黑暗交替循環(huán)，實驗前8 h禁食，自由飲水。本研究涉及的動物實驗已得到中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所動物倫理委員會的批準（動物實驗倫理審批文號SLXD-20220124015）。

2 方法

2.1 分組及給藥

參照已發(fā)表文獻中的動物分組及給藥劑量[10,16-18]，選取大鼠9只，隨機分成空白對照組（＝3）、正常給藥組（＝3）、抑郁模型給藥組（＝3）；首先參照課題組前期報道的方法復制慢性不可預知應激（CUMS）抑郁大鼠模型[19]；待造模成功后，選取正常和抑郁大鼠各3只，通過ig給予0.6 mg/mL（40 mg/kg）的氧化芍藥苷溶液，每天1次，連續(xù)3 d；空白對照組大鼠給予同體積的蒸餾水。

2.2 生物樣本的采集及處理

2.2.1 尿液和糞便 連續(xù)給藥3 d后，通過代謝籠收集各組大鼠的尿液和糞便樣本。糞便樣本置于70 ℃烘箱烘干水分，轉(zhuǎn)入研缽中碾碎。精密稱取糞便樣本粉末約0.8 g，置于25 mL具塞錐形瓶中，加入8 mL 50%甲醇溶液，超聲輔助提取30 min，靜置放冷，加50%甲醇溶液補足溶劑，搖勻，取出1 mL溶液，保持4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清液，待測；取尿液樣本1mL，保持4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清，待測。

2.2.2 血漿 采集完尿液和糞便后，麻醉大鼠，通過大鼠腹主動脈取血，置于含有肝素鈉的采血管中，靜置1 h，保持4 ℃、3 500 r/min下離心15 min，取上清液，即得血漿樣本。精密移取200 μL加入到Ostro 96孔板中，再加入3倍體積的乙腈溶液（含1%甲酸），然后采用正壓儀器對樣品進行前處理處理，收集濾液，并采用氮氣揮干溶劑，再用100 μL 60%甲醇水溶液復溶，保持4 ℃下13 000 r/min離心10 min，取上清，待測。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；梯度洗脫程序為0～4 min，1%～4% B；4～6 min，4%～12% B；6～16 min，12%～23% B；16～18 min，23%～50% B；18～20 min，50%～99% B；體積流量為0.3 mL/min；檢測波長為210～400 nm；進樣量為5 μL；柱溫為40 ℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件 采用Waters SYNAPT G2 HDMS系統(tǒng)，氮氣作為質(zhì)譜ESI（電噴霧離子化，Electrospray ionization）離子源的霧化錐孔氣；電噴霧電離：負離子模式；毛細管電壓：2.1 kV；錐孔電壓：40 V；萃取錐孔電壓：3 V；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；反向錐孔氣流50 L/h；脫溶劑氣體積流量600 L/h；碰撞氣體積流量0.5 mL/min；掃描時間0.5 s；掃描時間間隔0.02 s；質(zhì)荷比/50～1 200；數(shù)據(jù)采集形式：Continuum；靈敏性：Normal；動態(tài)范圍：Extended；采用亮氨酸－腦啡肽進行精確質(zhì)量校正（鎖定質(zhì)量數(shù)：負離子模式下/554.261 5）。

2.4 統(tǒng)計分析

采集各組大鼠血液、尿液、糞便樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并采用MassLynx 4.1軟件進行預處理，然后結合UNIFI軟件進行分析。依次設定目標篩選設置、特定分析設置和氧化芍藥苷可能的轉(zhuǎn)化途徑，包括I相代謝和II相代謝途徑（表1），通過質(zhì)譜碎片離子和精確質(zhì)量數(shù)對相應的化合物進行濾過、篩選和鑒定，代謝產(chǎn)物準分子離子峰的預測值設定為小于1×10?5的質(zhì)量偏差范圍。

表1 體內(nèi)代謝產(chǎn)物加合離子信息

3 結果

3.1 血漿、尿液和糞便樣本的UPLC-Q-TOF/MS分析

按“2.2”項下樣品處理方法，采用“2.3”項下UPLC-Q/TOF-MS分析條件，分析空白樣品以及正常和抑郁組大鼠給與氧化芍藥苷后血漿、尿液和糞便樣品的質(zhì)譜圖（圖2、3）。

3.2 氧化芍藥苷在正常和抑郁大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定

因氧化芍藥苷在質(zhì)譜負離子模式下的離子化響應較好，故本實驗僅對其原型及代謝產(chǎn)物負離子的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析。首先將采集到的負離子模式下血漿、尿液和糞便樣本數(shù)據(jù)導入到UNIFI軟件中，然后導入氧化芍藥苷信息（C23H28O12，/495.150 3）作為母體化合物，參照表1中可能的加合離子，并與空白樣品對比扣除干擾，根據(jù)碎片離子信息、準確度、理論碎片、響應度對代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)進行鑒定。結果從正常大鼠樣品和抑郁大鼠樣品中均鑒定到原型成分，同時還在正常大鼠血漿、尿液和糞便中分別鑒定出1、12、3個代謝產(chǎn)物（圖4），在抑郁大鼠血漿、尿液和糞便中分別鑒定出4個、13個和2個代謝產(chǎn)物（圖5），2組有11個相同的代謝產(chǎn)物，推測的代謝途徑見圖6、7，鑒定結果見表2。

3.2.1 氧化芍藥苷原型成分的鑒定 在正常和抑郁大鼠血漿、尿液中均鑒定到氧化芍藥苷原型成分（MA0），其在抑郁大鼠血漿中的相對含量（相對峰面積）是正常大鼠血漿的10倍（圖8），但其在抑郁大鼠尿液中的相對含量要低于正常大鼠。MA0的準分子離子峰質(zhì)荷比為/495.150 3（ESI?），分子式為C23H28O12，特征碎片離子/137是蒎烷結構與苯甲酸基團發(fā)生裂解所致，接著蒎烷骨架連接的葡萄糖殘基發(fā)生斷裂，產(chǎn)生特征碎片離子/165，通過與對照品比對，確定MA0為氧化芍藥苷原型。

圖2 空白血漿(A)、尿液(B)、糞便(C) 樣本的質(zhì)譜基峰離子(BPI) 圖

圖3 正常大鼠 (A～C)和抑郁大鼠 (D～F) ig氧化芍藥苷后血漿(I)、尿液(II) 和糞便 (III) 樣本的質(zhì)譜基峰離子圖

3.2.2 氧化芍藥苷在大鼠血漿中代謝產(chǎn)物的鑒定 在抑郁大鼠血漿中鑒定到4個代謝產(chǎn)物（MB10～MB12、MB16），在正常大鼠血漿中鑒定到1個（MA6）代謝產(chǎn)物，其中代謝產(chǎn)物MA6是相同的代謝產(chǎn)物。

MA6的準分子離子峰/671.183 7（ESI?），通過元素組成推測分子式為C29H36O18，比氧化芍藥苷多17，在ESI-MS質(zhì)譜圖中，出現(xiàn)/495為氧化芍藥苷的特征離子，因此，本實驗推測MA6為氧化芍藥苷葡糖醛酸化的II相代謝產(chǎn)物。MB10的準分子離子峰/179.055 6（ESI?），分子式為C6H12O6，比氧化芍藥苷少316，初步推測代謝產(chǎn)物MB10是由氧化芍藥苷發(fā)生葡萄糖負離子I相代謝反應產(chǎn)生的。MB11的準分子離子峰/407.099 7（ESI?），通過元素組成推測分子式為C18H18O8，依據(jù)ESI-MS質(zhì)譜圖產(chǎn)生的碎片離子/245，推測MB11是由氧化芍藥苷丟失1分子葡萄糖后發(fā)生氧化去飽和及甲基化I相、II相結合代謝反應而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。MB12的準分子離子峰/527.138 0（ESI?），通過元素組成推測其分子式為C23H28O14，較氧化芍藥苷多32，初步推測氧化芍藥苷發(fā)生了2×氧化代謝反應。MB16的準分子離子峰/523.145 7（ESI?），通過元素組成推測分子式為C24H28O13，參考ESI-MS產(chǎn)生的質(zhì)譜碎片離子推測其可能為氧化芍藥苷脫去1分子甲基后發(fā)生乙?；磻a(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

3.2.3 氧化芍藥苷在大鼠尿液中代謝產(chǎn)物的鑒定 在抑郁大鼠尿液中鑒定到13個代謝產(chǎn)物，在正常大鼠尿液中鑒定到12個代謝產(chǎn)物，其中9個代謝產(chǎn)物（MA1、MA2、MA4、MA6、MA8、MA10、MA11、MA14、MA15）為共有代謝產(chǎn)物。3個代謝產(chǎn)物（MA9、MA12、MA13）只在正常大鼠尿液中鑒定到，4個代謝產(chǎn)物（MB2、MB4、MB8、MB14）只在抑郁大鼠尿液中鑒定到，其中代謝產(chǎn)物MA1、MA12及MB14的鑒定結果如下。

MA1的準分子離子峰/716.222 3（ESI?），通過元素組成推測分子式為C26H43N3O18S，比氧化芍藥苷多221，再依據(jù)ESI-MS質(zhì)譜圖中產(chǎn)生的特征碎片離子/385、122，因此，推測可能為氧化芍藥苷脫去1分子C7H4O2，繼而發(fā)生水合及谷胱甘肽I相、II相結合代謝反應而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。MA12的準分子離子峰/391.122 6（ESI?），通過元素組成推測分子式為C16H24O11，據(jù)ESI-MS質(zhì)譜圖中碎片離子/350、292推測可能為氧化芍藥苷脫去1分子C7H4O2后發(fā)生氧化反應而產(chǎn)生。MB14的準分子離子峰質(zhì)荷比為/439.121 3（ESI?），比氧化芍藥苷少56，參考質(zhì)譜碎片離子/304、145，推測可能是氧化芍藥苷丟失1分子葡萄糖后發(fā)生水合與乙?；疘相、II相結合代謝反應而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

圖4 正常大鼠口服氧化芍藥苷后的代謝產(chǎn)物在負離子模式下的提取離子色譜圖

3.2.4 氧化芍藥苷在大鼠糞便中代謝產(chǎn)物的鑒定 在抑郁大鼠糞便中鑒定到2個代謝產(chǎn)物（MA3、MA5），在正常大鼠糞便中鑒定到的3個代謝產(chǎn)物（MA3、MA5、MA7），其中MA3與MA5是二者共有的代謝產(chǎn)物。

MA3的準分子離子峰/377.088 2（ESI?），通過元素組成推測分子式為C18H18O9，比氧化芍藥苷少118，質(zhì)譜圖產(chǎn)生特征碎片離子/165，推測其可能為氧化芍藥苷丟失1分子葡萄糖，接著發(fā)生氧化、氧化去飽和、甲基化反應產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

MA5的準分子離子峰/391.161 5（ESI?），通過元素組成推測分子式為C17H28O10，比氧化芍藥苷少104，質(zhì)譜圖產(chǎn)生碎片離子/124，推測可能為氧化芍藥苷先脫去1分子C7H4O3，接著發(fā)生水合及甲基化代謝反應而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

圖5 抑郁大鼠口服氧化芍藥苷的代謝產(chǎn)物在負離子模式下的提取離子色譜圖

4 討論

本研究基于UPLC-Q-TOF/MS技術結合UNIFI分析平臺研究氧化芍藥苷在正常和抑郁大鼠血漿、尿液和糞便中的原型成分及代謝產(chǎn)物，并推測可能的代謝途徑。本研究發(fā)現(xiàn)正常和抑郁大鼠口服給藥氧化芍藥苷后體內(nèi)代謝過程存在顯著差異，特別是在血漿中的代謝。雖然在正常大鼠和抑郁大鼠的血漿中均能檢測到氧化芍藥苷的原型成分（MA0），但在抑郁大鼠血漿中MA0的相對含量較高，約為正常大鼠血漿中的10倍。另外，在正常大鼠血漿中僅檢測到氧化芍藥苷的1個葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物（MA6），而在抑郁大鼠血漿中檢測到氧化芍藥苷的4個II相代謝產(chǎn)物（MB10～MB12、MB16）。因此，推測氧化芍藥苷可能是以原型成分為主發(fā)揮藥效作用，檢測到血漿代謝產(chǎn)物的藥效作用有待進一步確證。

本研究也嘗試針對大鼠血漿、尿液和糞便樣本的檢測方法，主要包括色譜質(zhì)譜方法進行了初步考察，結果發(fā)現(xiàn)血漿中的原型成分和葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物（如MA0、MA6）同時也在尿液中檢測到，考慮到相同代謝產(chǎn)物在色譜質(zhì)譜檢測中的保留行為一致，因此本研究采用相同的色譜質(zhì)譜方法對正常和抑郁大鼠口服氧化芍藥苷后的血漿、尿液和糞便中代謝產(chǎn)物進行檢測。另外，雖然本研究推測氧化芍藥苷進入體內(nèi)后可能是以原型成分為主發(fā)揮藥效作用，但其體內(nèi)代謝產(chǎn)物對其藥效同樣具有貢獻作用。本實驗中氧化芍藥苷的代謝產(chǎn)物鑒定僅根據(jù)其產(chǎn)生的碎片離子及藥物體內(nèi)代謝過程可能的加和離子信息進行推測，因此，后續(xù)實驗有必要針對相對含量較高的代謝產(chǎn)物進行富集，分離制備，結構表征及活性確證。

圖6 正常大鼠口服氧化芍藥苷 (MA0) 的代謝產(chǎn)物及代謝途徑

圖7 抑郁大鼠口服氧化芍藥苷(MA0) 的代謝產(chǎn)物及代謝途徑

表2 氧化芍藥苷在正常和抑郁大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物鑒定結果

/為未檢測到代謝產(chǎn)物，P：血漿，U：尿液，F(xiàn)：糞便。

/No metabolites were detected; P: plasma; U: urine; F: feces.

圖8 氧化芍藥苷(MA0) 在正常組與模型組的血漿與尿液中相對含量差異

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative study on metabolites of oxypaeoniflorin in normal and depressed rats

JIN Zhao1, ZHENG Dahua2, HE Haoqi2, YU Meng2, ZOU Zhongmei2

1. School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

To compare the difference of oxypaeoniflorin metabolites in plasma, urine and feces between normal and depressed rats, and to deduce its main metabolic pathways.Wistar rats were selected to establish the model of chronic stress depression in this experiment, and oxypaeoniflorin aqueous solution was given to normal and depressed rats respectively by gavage for 3 d. The serum, urine and feces were collected and UPLC-Q-TOF/MS combined with UNIFI analysis platform was used to identify the prototype component and metabolites of oxypaeoniflorin in normal and depressed rats.The prototype component of oxypaeoniflorin were detected in plasma from both normal and depressed rats, and the relative content in plasma of depressed rats was ten times higher than that in normal rats; four, 13 and two metabolites were identified in plasma, urine and feces of depression rats, and one, 12 and three in normal rats, respectively. Among them, 11 metabolites were detected in both depressed mice and normal rats. The metabolic pathways of oxypaeoniflorin include oxidation and desaturation in phase I metabolic reactions or methylation, glucuronidation and acetylation in phase II metabolic reactions.Oxypaeoniflora enters the body mainly as a prototype after intragastric administration in rats, and the relative content of prototype components in plasma of depressed rats was ten times higher than that in normal rats. In addition, the metabolites of oxypaeoniflorin were different in depressed and normal rats, and glucuronidation metabolism occurred mainly in normal rats, whereas acetylation metabolism occurred mainly in depressed rats. Therefore, we speculated that the prototype of oxypaeoniflorin should be responsible for its therapeutic effect, which excreted as prototype or metabolite through urine and feces.

oxypaeoniflorin; anti-depression; metabolites; metabolic pathways; paeoniflorin

R284.1

A

0253 - 2670(2024)09 - 2887 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.004

2024-01-12

國家自然科學基金資助項目（82073991）；中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程項目（2021-I2M-1-071）

金 朝（1998—），碩士研究生，研究方向為中藥質(zhì)量與控制。E-mail: jzz09032022@163.com

通信作者：鄒忠梅，博士生導師，研究員，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎。E-mail: zmzou@implad.ac.cn

于 猛，副研究員，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎。E-mail: myu@implad.ac.cn

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