忍冬屬囊管組植物葉綠體基因組進(jìn)化分析

張晶晶，袁 慶，魏 瑤，劉 歡，鄭雪梅，王英芳，劉海瑞*

忍冬屬囊管組植物葉綠體基因組進(jìn)化分析

張晶晶1，袁 慶1，魏 瑤1，劉 歡1，鄭雪梅3，王英芳2，劉海瑞1*

1. 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016 2. 三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016 3. 青海省國家公園科研監(jiān)測(cè)評(píng)估中心，青海 西寧 810000

揭示忍冬屬囊管組16種植物葉綠體基因組特征及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。以16種囊管組植物為研究材料，利用CodonW、EMBOSS、Excel等軟件分析其葉綠體基因組密碼子使用偏好性；利用IRscope、mVISTA、DNAsp進(jìn)行葉綠體基因組比較分析；利用PhyloSuite基于最大似然法及貝葉斯法2種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示ENC值為46.54～47.37，均大于35，密碼子偏好性較弱。GCall含量范圍為38.92%～39.22%，均小于40%，具有明顯的A/U偏好性，且GC1＞GC2＞GC3，密碼子第3位堿基以A/U為主。通過中性繪圖、ENC-plot及PR2-plot分析，發(fā)現(xiàn)影響密碼子使用偏好性的主要因素是自然選擇。篩選出最優(yōu)密碼子7個(gè)，且密碼子第3位均以A/U結(jié)尾。16種囊管組植物中均出現(xiàn)1假基因。IR邊界保守，差異較小。變異主要集中在非編碼區(qū)，且單拷貝區(qū)域核苷酸多態(tài)性大于反向重復(fù)區(qū)域，存在更多的變異位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，紅花亞組與紫花亞組內(nèi)物種系統(tǒng)發(fā)育位置與《中國植物志》存在差異。揭示了影響忍冬屬囊管組植物密碼子偏好性的因素。結(jié)合葉綠體基因組比較分析，系統(tǒng)發(fā)育分析，有助于進(jìn)一步理解忍冬屬植物的進(jìn)化和適應(yīng)機(jī)制。

忍冬屬；囊管組；葉綠體基因組；密碼子偏好性；系統(tǒng)進(jìn)化

忍冬屬L.植物具有藥用和觀賞價(jià)值，屬內(nèi)有《中國藥典》2020年版收載的著名中藥植物—金銀花，可以清熱解毒、消炎退腫[1]。囊管組（Sect.）隸屬于忍冬屬忍冬亞屬Chamaecerasus，組下有8個(gè)亞組，在我國分布有51種3亞種和7變種，物種多，在屬內(nèi)占比大，且變異明顯，全國各省均有分布，在忍冬屬內(nèi)占據(jù)著重要的地位[2]。組內(nèi)有不少入藥物種，具有重要的資源利用價(jià)值，如藍(lán)果忍冬Linn.富含多種微量元素和人體所需的氨基酸，有較好的醫(yī)療保健價(jià)值，且果實(shí)酸甜可口，被廣泛引種栽培用作保健水果[3]；唐古特忍冬Maxim.在青海、甘肅、寧夏等地作金銀花用，有效成分含量高，適應(yīng)性強(qiáng)[4]。加強(qiáng)忍冬屬植物葉綠體基因組的基礎(chǔ)研究對(duì)其高效利用具有重要意義。近年來，對(duì)忍冬屬的研究主要集中于成分開發(fā)以及基于葉綠體基因片段的系統(tǒng)發(fā)育研究[5-6]，然而基于葉綠體全基因組進(jìn)化特征和遺傳多樣性的研究較少。同時(shí)有關(guān)忍冬屬密碼子偏好性的研究尚不完整，僅何志敏探討忍冬屬木犀草苷關(guān)鍵合成酶基因在進(jìn)化過程中形成的密碼子使用模式，為實(shí)現(xiàn)異源高表達(dá)提供依據(jù)[7]。另外，張加強(qiáng)[8]基于葉綠體全基因組探究金銀花大毛花單個(gè)物種密碼子使用偏好性影響因素。本實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法對(duì)16種囊管組植物進(jìn)行分析，所用物種覆蓋組內(nèi)所有亞組，分析更加全面，將為忍冬屬植物遺傳進(jìn)化研究提供參考。

葉綠體是植物重要的半自主細(xì)胞器，具有獨(dú)立的遺傳系統(tǒng)，可以獨(dú)立復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和翻譯，在次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和植物發(fā)育中起著重要的作用[9]。與核基因組和線粒體基因組相比，葉綠體基因組結(jié)構(gòu)保守，變異率低[10]，核苷酸替換率適中、適用于不同階元的系統(tǒng)進(jìn)化研究。同時(shí)葉綠體中蘊(yùn)含著豐富的變異位點(diǎn)信息，可以用于揭示物種的起源，是當(dāng)前研究系統(tǒng)發(fā)育的有力工具[11]。

密碼子是核酸和蛋白質(zhì)傳遞遺傳信息的橋梁，在生物遺傳變異中有著至關(guān)重要的地位。密碼子具有簡(jiǎn)并性，除個(gè)別氨基酸外，大多數(shù)的氨基酸均由2～6個(gè)密碼子編碼，不止具有單一密碼子，由前后相連的3個(gè)核苷酸組成，64個(gè)密碼子共編碼20種氨基酸[12]。密碼子使用偏好性是對(duì)同義密碼子編碼氨基酸時(shí)不同的使用頻率進(jìn)行定義，也是影響外源基因表達(dá)量的重要因素。密碼子偏好性會(huì)受到多種因素的影響，而造成密碼子偏倚的主要因素則是自然選擇以及基因突變[13]，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種偏好性大，且蛋白質(zhì)表達(dá)或者基因功能也存在差異。因此，研究囊管組物種密碼子使用偏好性，有助于理解生物與環(huán)境適應(yīng)的機(jī)制，為植物品種改良等提供參考[14]。

本研究擬探究囊管組植物的密碼子使用偏好性，囊管組植物的葉綠體基因組基本特征及比較分析以及囊管組植物的親緣關(guān)系，以期為后續(xù)品種改良以及開發(fā)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料

測(cè)序?qū)ο蟛勺院笔《魇┦邪沤多l(xiāng)（地理坐標(biāo)：42°05′N，128°04′E）。經(jīng)青海大學(xué)劉海瑞副教授鑒定為忍冬屬蕊帽忍冬Oliv. var.Rehd.，憑證標(biāo)本存放于青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院。從NCBI數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome）下載其余15種囊管組內(nèi)已公布的葉綠體基因組數(shù)據(jù)，包括蕊被忍冬Hemsl.（NC064373）、紫花忍冬(Rupr.) Regel（NC050941）、下江忍冬Rehder（MW801018）、紅脈忍冬Maxim.（NC040961）、華北忍冬Maxim.（MN524606）、郁香忍冬Lindl. ex Paxton（NC058578）、早花忍冬Batalin（NC039635）、北京忍冬F(xiàn)ranch.（MN524603）、蔥皮忍冬F(xiàn)ranch.（MW242825）、唐古特忍冬Maxim.（OP388440）、四川忍冬Maxim.（OP388441）、丁香葉忍冬K. S. Hao ex P. S. Hsu（NC064932）、藍(lán)果忍冬Linn.（OP345475）、剛毛忍冬Pall. ex Roem.（MN524605）、冠果忍冬F(xiàn)ranch.（NC037954）。外類群選擇糯米條R. Br.（NC045043、錦帶花(Bunge) A. DC.（MW788539）、鬼吹簫Wall.（NC057000）。

2 方法

2.1 葉綠體基因組測(cè)序、組裝及注釋

用改良的CTAB法從蕊帽忍冬新鮮嫩葉組織中提取DNA[15]，測(cè)序平臺(tái)選擇Illumina NovaSeq 6000。采用SPAdes進(jìn)行拼接組裝，獲得完整葉綠體基因組。利用Geseq和Sequin v15.50對(duì)葉綠體基因組進(jìn)行注釋和修正。完成后向NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行提交，獲得登錄號(hào)OR146745。

2.2 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)基本特征

用Chloroplot（http://irscope.shinyapps.io/ Chloroplot/）進(jìn)行基因組圖譜的繪制[16]。

2.3 密碼子偏好性分析

2.3.1 密碼子組成分析 利用16種囊管組物種的葉綠體基因組蛋白質(zhì)編碼序列進(jìn)行密碼子偏好性分析。用CodonW 1.4.2軟件，計(jì)算RSCU以及ENC值，并使用在線網(wǎng)站EMBOSS（http://emboss.toulouse.inra.fr/cgibin/emboss/cusp），計(jì)算不同位置（GC1、GC2、GC3、GC3S、GCall）GC含量17]。

2.3.2 中性繪圖分析 同義密碼子突變位點(diǎn)為GC3，作為橫坐標(biāo)；非同義密碼子突變位點(diǎn)為GC1、GC2，取2個(gè)位點(diǎn)的平均值為縱坐標(biāo)，在Excel中繪制散點(diǎn)圖，分析兩者之間的相關(guān)性[18]。

2.3.3 ENC-plot分析 ENC值能表明密碼子偏離隨機(jī)選擇的程度，作為縱坐標(biāo)；以GC3為橫坐標(biāo)，在Excel中繪制散點(diǎn)圖，以公式ENC=2＋GC3＋29/[GC32＋(1?GC3)2]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。

2.3.4 PR2-plot分析 以G3/(G3＋C3)為橫坐標(biāo)；A3/(A3＋T3)為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖，對(duì)密碼子第3位堿基上的A、T、C、G含量進(jìn)行分析，避免A/T 和C/G之間突變的不平衡[20]。

2.3.5 同義密碼子分析 利用TBtools對(duì)整理后的同義密碼子數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖繪制[21]。

2.3.6 最優(yōu)密碼子分析 最優(yōu)密碼子由ENC值和RSCU值共同確定[22]，篩選出高低表達(dá)基因構(gòu)建表達(dá)庫，利用CodonW 1.4.2軟件計(jì)算ΔRSCU值。同時(shí)滿足RSCU＞1和ΔRSCU≥0.08的密碼子即為最優(yōu)密碼子[23]。

2.4 葉綠體基因組比較分析

2.4.1 序列差異性分析 以蕊帽忍冬基因組注釋文件作參考，Python3.10.1運(yùn)行腳本對(duì)所有物種注釋得到gbk文件，用mVISTA（https://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit. shtml）進(jìn)行全序列差異性分析，選擇全局比對(duì)模式，最小差異設(shè)置為0.5，估測(cè)序列差異、統(tǒng)計(jì)倒位、缺失情況[24]。

2.4.2 邊界分析 用IRscope（https://irscope. shinyapps.io/irapp/）對(duì)LSC，SSC和IR區(qū)域邊界進(jìn)行差異分析，包括邊界收縮可視化等[25]。并對(duì)邊界基因定位，顯示邊界基因種類及大小差異進(jìn)行分析，評(píng)估葉綠體基因組邊界穩(wěn)定性。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于葉綠體全基因組序列，利用MAFFT對(duì)囊管組及其外類群葉綠體基因組進(jìn)行全序列比對(duì)。用PhyloSuite基于最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（GTR＋R，5 000次）[27]?；谪惾~斯法（Bayes）構(gòu)建BI樹（GTR＋I(xiàn)＋G，10 000 000次）[24]。導(dǎo)入FigTree進(jìn)行可視化及樹形優(yōu)化。

3 結(jié)果與分析

3.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

蕊帽忍冬葉綠體基因組全長(zhǎng)為154 759 bp（圖1），呈典型的四分體結(jié)構(gòu)。包含的基因類型與數(shù)目與忍冬屬內(nèi)物種基本一致，共有130個(gè)基因，其中蛋白編碼基因85個(gè)，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）基因37個(gè)，核糖體RNA（rRNA）基因8個(gè)。4類葉綠體基因統(tǒng)計(jì)詳情見表1。

3.2 密碼子偏好性分析

3.2.1 密碼子組成分析 由表2可知，囊管組內(nèi)的物種GCall含量范圍為38.92%（四川忍冬）～39.22%（蔥皮忍冬），且16種囊管組物種的GCall含量小于40%，說明A/U堿基多于G/C堿基，對(duì)A/U結(jié)尾的密碼子有更高的偏好性。GC含量在不同位置分布不同，GC1＞GC2＞GC3，密碼子第３位堿基以A/U為主。16種囊管組植物葉綠體基因組ENC值整體相差不大，范圍為46.54（冠果忍冬）～47.37（唐古特忍冬），均大于35，表明16種囊管組植物的密碼子偏好性較弱。

3.2.2 中性繪圖分析 中性分析（圖2）可用GC12和GC3的相關(guān)性來表示密碼子使用偏差值的大小，估算自然選擇和突變壓力對(duì)密碼子偏好性的影響程度。16種忍冬屬植物中性圖斜率為0.0748（唐古特忍冬）～0.308（紫花忍冬，丁香葉忍冬），表明突變壓力的影響占7.48%～30.80%，選擇壓力占比為69.20%～92.52%，選擇壓力與突變壓力數(shù)值相差很大，表明囊管組植物主要受選擇壓力影響，突變壓力影響較小。

圖1 葉綠體基因組圖譜

表1 蕊帽忍冬葉綠體基因組基因

*-內(nèi)含子為1：**-內(nèi)含子為2：():多拷貝基因，為拷貝數(shù)。

*-contains an intron; *-containing two introns; (n): multi copy gene, n is copy number.

表2 16種囊管組植物葉綠體基因組密碼子參數(shù)特征

3.2.3 ENC-plot分析 ENC-plot是對(duì)密碼子的ENC和GC3進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析（圖3）。囊管組16種植物的基因分布很接近，大部分基因都與標(biāo)準(zhǔn)曲線有一定的距離，只有小部分基因在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，且大多數(shù)基因點(diǎn)都位于曲線以下，只有極少數(shù)的點(diǎn)位于曲線上方，說明16種囊管組植物主要受到選擇壓力影響，突變壓力影響較小。唐古特忍冬和藍(lán)果忍冬位于曲線上方的點(diǎn)數(shù)量多于其他物種，說明突變壓力的影響相較于其他同組的物種來說更大。

3.2.4 PR2-plot分析 PR2-plot又被稱為偏倚性分析（圖4），中心點(diǎn)代表A和T、C和G的使用頻率一樣，表明密碼子使用偏好性完全受基因突變影響，通過判斷散點(diǎn)與中心點(diǎn)（A＝T，C＝G）的矢量距離，來確定偏移的程度和方向。16種囊管組植物坐標(biāo)點(diǎn)分布相似，不均勻地分布在4個(gè)區(qū)域內(nèi)，主要分布在右下角TG區(qū)，極少數(shù)基因分布在左上角AC區(qū)，表明第3位密碼子使用頻率表現(xiàn)T＞A，G＞C。進(jìn)一步說明16種囊管組植物葉綠體基因主要受到自然選擇影響。

3.2.5 同義密碼子分析 16種囊管組植物葉基因組的RSCU值極為相似，相差較?。▓D5），一定程度上說明其葉綠體基因組進(jìn)化較為保守。57個(gè)同義密碼子中共有的RSCU＞1即使用偏好性強(qiáng)的密碼子數(shù)為29個(gè)。RSCU值最高的為編碼精氨酸的密碼子AGA。密碼子RSCU≥2時(shí)，有極強(qiáng)偏好性，冠果忍冬的AGA密碼子RSCU值為2.07＞2，早花忍冬RSCU值為2.00＝2，說明這2個(gè)物種有極強(qiáng)的偏好性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)以A/U結(jié)尾的有24個(gè)，說明高頻密碼子偏好使用A/U結(jié)尾，因此偏好使用G/C結(jié)尾的為負(fù)偏倚密碼子。

3.2.6 最優(yōu)密碼子分析 根據(jù)RSCU值確定最優(yōu)密碼子（表3），16種囊管組植物的最優(yōu)密碼子介于15個(gè)（藍(lán)果忍冬）～19個(gè)（冠果忍冬、剛毛忍冬和丁香葉忍冬）之間。經(jīng)篩選共同的最優(yōu)密碼子有7個(gè)，分別是CGA（精氨酸）、UGU（半胱氨酸）、CAA（谷酰胺酸）、GGU（甘氨酸）、UUA（亮氨酸）、AAA（賴氨酸）、GUA（亮氨酸），密碼子第3位均以A/U結(jié)尾，有明顯的A/U偏好性。

3.3 葉綠體基因組比較分析

3.3.1 序列差異 本研究以蕊帽忍冬的葉綠體全基因組序列作為參考，對(duì)16種囊管組植物的葉綠體基因組進(jìn)行比對(duì)（圖6）。結(jié)果表明，編碼區(qū)（Exon）差異較小，其基因組成和排列順序的相似度都較高；差異主要集中在非編碼區(qū)（CNS），序列的變異程度也相對(duì)較高。差異存在于-、-、--和--4基因間隔區(qū)。

圖2 16種囊管組植物中性繪圖分析

3.3.2 邊界分析 葉綠體基因組長(zhǎng)度差異較小（分布在154 553～163 413 bp）且序列高度相似（圖7）。除北京忍冬和冠果忍冬23基因位于LSC區(qū)，距邊界99 bp外，其余物種23基因均橫跨JLB（LSC/IRb）邊界。在IRb區(qū)域內(nèi)，蔥皮忍冬，紫花忍冬，丁香葉忍冬以及下江忍冬的H基因距JLB邊界286 bp，其余物種I基因距JLB邊界74～286 bp。蕊帽忍冬，蕊被忍冬以及下江忍冬的JSB邊界在F基因內(nèi)部，其余物種此基因距JSB（SSC/IRb）邊界5～151 bp。四川忍冬較為特殊，15基因位于SSC區(qū)內(nèi)，距JSB邊界132 bp，F(xiàn)基因位于位于SSC區(qū)內(nèi)，距JSA（SSC/IRa）邊界47 bp。其余15種囊管組物種中，JSA邊界附近分布的基因一致，但基因序列長(zhǎng)度與距邊界的距離稍有不同。JLA（LSC/IRa）邊界在H基因內(nèi)部，其余物種此基因距邊界0～459 bp，冠果忍冬和北京忍冬發(fā)生了明顯的邊界收縮。

3.4 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

為明確囊管組的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，闡述蕊帽忍冬的系統(tǒng)發(fā)育位置，本研究選擇16個(gè)囊管組物種及3個(gè)外類群物種基于2種不同的算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖9），樹形完全一致，BI樹后驗(yàn)概率都為1，ML樹除單個(gè)節(jié)點(diǎn)的支持率較低外，其余均大于85，說明基于葉綠體全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可信度較高。結(jié)果顯示，囊管組物種聚為一支，屬間親緣關(guān)系顯示，忍冬屬與鬼吹簫的親緣關(guān)系較近，與北極花屬以及錦帶花屬親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。組內(nèi)親緣關(guān)系顯示，同屬于紫花亞組的四川忍冬與唐古特忍冬顯示并未聚為一支，而四川忍冬與紅花亞組的紅脈忍冬聚為一支，與唐古特忍冬距離較遠(yuǎn)。紅花亞組除華北忍冬外，其余物種聚為一支，而華北忍冬與郁香亞組的早花忍冬親緣關(guān)系更為相近。蕊帽亞組的蕊帽忍冬與短冠亞組的丁香葉忍冬聚為一支，而與同亞組的蕊被忍冬相距較遠(yuǎn)。

圖3 16種囊管組植物ENC與GC3關(guān)聯(lián)分析

4 討論

忍冬屬植物具有重要的藥用價(jià)值和資源利用價(jià)值，對(duì)于金銀花有效成分的開發(fā)以及選育優(yōu)質(zhì)新品種一直是研究的重點(diǎn)，因此對(duì)于其遺傳信息的研究尤為重要。本研究完成了蕊帽忍冬葉綠體全基因組的測(cè)序，組裝和注釋工作，結(jié)合NCBI下載的其余15種囊管組植物的序列進(jìn)行葉綠體基因組特征，比較分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析。16種囊管組植物葉綠體基因組高度保守，呈典型的四分體結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為154 553～163 413 bp，同大多數(shù)被子植物葉綠體基因組相似[28]。

密碼子偏好性分析是一種可以揭示植物進(jìn)化歷史，為提高異源基因表達(dá)效率提供參考[29]。密碼子的第3位堿基改變并不會(huì)影響編碼氨基酸的種類，GC3含量高表明由基因突變主導(dǎo)，反之則由自然選擇影響，因此GC3含量被作為判定物種進(jìn)化主導(dǎo)因素的一種指標(biāo)[31]。本研究GCall含量為38.92%～39.22%，均小于40%，具有明顯的A/U偏好性，說明囊管組物種主要受自然選擇影響。與線粒體或者核基因相比，葉綠體基因高度保守，其GC含量在不同物種間相差極小，且GC1＞GC2＞GC3，與本研究結(jié)果一致[30]。密碼子第3位堿基以A/U為主，與酸棗[32]、巴山松[33]、茄科[34]等雙子葉植物研究結(jié)論一致[35]；而單子葉植物如石斛屬[35]、杓蘭[36]等也存在類似的現(xiàn)象，說明不同物種間的密碼子使用偏好性存在著相似性。另外像煙草[37]此類雙子葉植物的核基因，其GC3值則高于GC2值；而玉米[38]此類單子葉植物的核基因組GC3值為69.77%，更傾向于G/C結(jié)尾的密碼子，與葉綠體基因明顯不同。這也證明葉綠體基因組可能是獨(dú)立于核基因組進(jìn)化和起源的，保守性更強(qiáng)。有效密碼子數(shù)（ENC）在20～61，當(dāng)ENC值低于35時(shí)，認(rèn)為密碼子使用偏好性較強(qiáng)且基因表達(dá)量較高，反之則表明密碼子偏好性較弱即每個(gè)氨基酸均勻使用所有的同義密碼子[39]。在16種囊管組植物中，ENC值（46.54～47.37）均大于35，說明密碼子偏好性較弱。57個(gè)同義密碼子中RSCU＞1即高頻密碼子為29個(gè)，具有明顯的A/U偏好性。不同物種同義密碼子的使用偏好性存在差異，這是環(huán)境與植物在漫長(zhǎng)的適應(yīng)演變中產(chǎn)生的進(jìn)化結(jié)果[40]。自然選擇會(huì)使植物在對(duì)環(huán)境的適應(yīng)中優(yōu)先編碼最優(yōu)密碼子，而基因突變則會(huì)產(chǎn)生一部分非偏好性密碼子。本研究篩選出7個(gè)共同最優(yōu)密碼子，第3位均以A/U結(jié)尾，這與王杰敏[41]關(guān)于忍冬屬葉綠體基因組密碼子使用偏好分析的結(jié)果一致。且表現(xiàn)形式為NNA或NNU的模式，與油茶[42]等陸地物種最優(yōu)密碼子使用偏好性結(jié)果一致。不同物種間密碼子使用偏好性相同，也是葉綠體基因組保守性的體現(xiàn)。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，紫花忍冬與下江忍冬共享17個(gè)相同的最優(yōu)密碼子，因此兩者的親緣關(guān)系較其與同亞組的其余物種，紅脈忍冬以及華北忍冬更相近。這也驗(yàn)證了Liu等[43]的結(jié)論，遺傳距離越小，密碼子使用偏好性越相似。

圖4 16種囊管組植物偏倚性分析

圖5 16種囊管組植物同義密碼子分析

表3 16種囊管組植物最優(yōu)密碼子分析

下劃線為16個(gè)囊管組物種共有的最優(yōu)密碼子。

The underlines represent the optimal codons shared by the 16 Sect.species.

圖6 16種囊管組植物cp DNA序列比對(duì)

圖7 16種囊管組物種葉綠體基因組的LSC、SSC和IR邊緣區(qū)的比較

圖8 16種囊管組物種核苷酸多態(tài)性

圖9 16種囊管組植物系統(tǒng)進(jìn)化樹

ENC-plot分析、中性繪圖分析結(jié)果均表明影響16種囊管組植物葉綠體基因組密碼子使用偏好性的主要因素為自然選擇，而突變壓力則影響較小，這與蝴蝶蘭[44]、陽春砂[40]等植物的研究結(jié)果類似。PR2-plot分析顯示第3位密碼子使用頻率表現(xiàn)T＞A，G＞C，也可以證明囊管組植物受自然選擇影響。這與金銀花大毛花[8]、燈盞花[14]等多數(shù)植物研究結(jié)果一致。但乳油木[45]受到突變壓力的影響超過了自然選擇；而菠蘿[46]選擇和突變影響相對(duì)均衡，受多種因素影響。推測(cè)雖然密碼子使用偏好性影響因子在不同物種間存在差異，但都是由突變壓力和自然選擇共同作用的結(jié)果。環(huán)境和人為因素都會(huì)對(duì)自然選擇產(chǎn)生影響，使不同的密碼子有不同的翻譯效率和折疊性，影響蛋白質(zhì)的功能和表達(dá)[30]。例如嚴(yán)寒和干旱會(huì)使GC含量高的密碼子使用頻率增加[47]，而雜交、引種馴化等人類活動(dòng)會(huì)改變物種基因流、種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，導(dǎo)致密碼子改變[48]。同時(shí)密碼子偏好性可能通過影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率來影響蛋白質(zhì)的合成速度和量，進(jìn)而影響植物的形態(tài)和生理特性。雖然，目前已有相關(guān)研究在探索密碼子偏好性在植物基因表達(dá)和進(jìn)化中的作用[49]，但這是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到多重因素，調(diào)控植物形態(tài)和生理特性的機(jī)制還需要深入研究。

IR區(qū)邊界的收縮和擴(kuò)張會(huì)造成葉綠體基因組長(zhǎng)度差異，影響植物進(jìn)化[33]。16種囊管組植物IR區(qū)差異較小，雖存在部分?jǐn)U張或收縮情況，但整體邊界較為保守且存在1假基因。LSC/IRb邊界位置一般為23及H、I基因簇，除北京忍冬和冠果忍冬23距邊界99 bp外，其余物種該基因均橫跨JLB邊界，且進(jìn)入IRb區(qū)的基因長(zhǎng)度一致，這與Liu等[50]對(duì)于忍冬屬7個(gè)物種的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了葉綠體基因組的保守性。冠果忍冬和北京忍冬H基因在LSC/IRa邊界中發(fā)生了明顯的邊界收縮，其余物種該基因均在JLA邊界內(nèi)部。囊管組植物葉綠體基因組全序列比對(duì)及核苷酸多態(tài)性結(jié)果顯示，編碼區(qū)序列更保守，變異主要集中在非編碼區(qū)，IR區(qū)遺傳多態(tài)性比SC區(qū)低，這與大多數(shù)被子植物研究結(jié)果類似[28]。位于LSC區(qū)的LI基因?yàn)楦咦儏^(qū)域，這與全序列比對(duì)結(jié)果相一致。變異率高的區(qū)域被認(rèn)為是進(jìn)化分析的潛在分子標(biāo)記，姚輝等[51]利用高變異基因間隔區(qū)序列K-I對(duì)18種藥用石斛及其混偽品進(jìn)行成功辨別。本研究篩選出高變區(qū)域LI、NF、15N和32L，可作為忍冬屬植物DNA條形碼的候選片段，結(jié)合核基因片段聯(lián)合分析，將為后續(xù)物種鑒定等研究奠定基礎(chǔ)。

基于葉綠體全基因組的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系表明，囊管組內(nèi)物種聚為一支，且屬間親緣關(guān)系表明忍冬屬與鬼吹簫屬親緣關(guān)系較近，這與Nina基于ITS序列[52]、Nakaji利用5個(gè)葉綠體基因組非編碼區(qū)序列[6]構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果一致。紅花亞組的聚類情況與《中國植物志》囊管組內(nèi)的亞組劃分相悖[45]，華北忍冬與早花忍冬親緣關(guān)系更為相近，而與同亞組的下江忍冬、紅脈忍冬和紫花忍冬相距較遠(yuǎn)。蕊帽忍冬與丁香葉忍冬聚為一支，而與同亞組的蕊被忍冬親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，通過全序列比對(duì)結(jié)果也可以看出丁香葉忍冬與蕊帽忍冬的序列更為相似[53]。但本研究所用物種量較小，部分物種系統(tǒng)發(fā)育位置的確定仍有爭(zhēng)議，應(yīng)完善該屬物種取樣覆蓋度，以便從分子層面明確屬內(nèi)植物分類地位，為后續(xù)忍冬屬植物系統(tǒng)發(fā)育，資源鑒定及進(jìn)化等研究提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Evolutionary analysis of chloroplast genomes of Sect.() species

ZHANG Jingjing1, YUAN Qing1, WEI Yao1, LIU Huan1, ZHENG Xuemei3, WANG Yingfang2, LIU Hairui1

1. College of Eco-Environmental Engineering, Qinghai University, Xining 810016, China 2. State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture, Qinghai University, Xining 810016, China 3. Qinghai National Park Research Monitoring and Evaluation Centre, Xining 810000, China

To explore the characteristic of chloroplast genomes and phylogenic relationship of 16 species of Sect.()The codon usage bias parameters of 16 Sect.plants were analyzed by CodonW, EMBOSS, and Excel. Comparative analysis of chloroplast genome was performed using IRscope, mVISTA and DNAsp. And the phylogenetic tree was constructed by PhyloSuite using maximum likelihood method and Bayesian method.The results showed that the ENC values were 46.54—47.37, all of which were greater than 35, indicating a weak codon bias. The GCallcontent ranged from 38.92% to 39.22%, all values being less than 40%, which revealed a clear A/U bias as well as GC1>GC2>GC3pattern, and the third position of codon tends to use A/U base. Through the analysis of neutrality plot, ENC-plot and PR2-plot, it was determined that natural selection was the primary factor influencing codon usage bias. Seven optimal codons of 16 Sect.plants were screened out, and the third position of the codons all ended with A/U. The1 pseudogenes were found in all 16 Sect.plants. The IR boundaries were conserved, with little difference. The variable regions were mainly in the non-coding regions and the nucleotide polymorphism of the single-copy region was greater than that of the inverted repeat region, and there were more variable sites. The results of phylogenetic analyses showed that the phylogenetic positions of the species within the safflower subgroup and the purple flower subgroup differed from those of.Factors affecting the codon bias of Sect.() were revealed. By combining comparative chloroplast genome analysis and phylogenetic analysis, the study could enhance the understanding about evolutionary and adaptive mechanisms of this genus.

L., Sect.chloroplast genome, codon usage bias, phylogenetic evolution

R286.12

A

0253 - 2670(2024)09 - 3085 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.022

2023-12-02

青海省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2024-ZJ-723）；西寧植物多樣性資源調(diào)查與種質(zhì)資源圃建設(shè)（2023-Z-13）；生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院研究生三江源一流學(xué)科建設(shè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2023-stxy-Y21）

張晶晶，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锵到y(tǒng)進(jìn)化。Tel: 15833929266 E-mail: jiuchangan666@sina.com

通信作者：劉海瑞，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向?yàn)橹参锓肿酉到y(tǒng)學(xué)。Tel: 13709760916 E-mail: lhrbotany@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]