多組學(xué)分析揭示潰瘍性結(jié)腸炎緩解期脾虛濕困證與活動(dòng)期濕熱阻滯證間的潛在分子機(jī)制及靶向中藥預(yù)測

黎祖鳴，封杰妮，陳雪如，陳劍坤，盧 月，李際強(qiáng)，馮 艷

多組學(xué)分析揭示潰瘍性結(jié)腸炎緩解期脾虛濕困證與活動(dòng)期濕熱阻滯證間的潛在分子機(jī)制及靶向中藥預(yù)測

黎祖鳴1，封杰妮1，陳雪如1，陳劍坤2，盧 月2，李際強(qiáng)2*，馮 艷2*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（廣東省中醫(yī)院），廣東 廣州 510006

綜合分析潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）相關(guān)scRNA-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)集，探討UC緩解期脾虛濕困證與活動(dòng)期濕熱阻滯證間的潛在分子機(jī)制，并挖掘潛在干預(yù)中藥。運(yùn)用差異基因表達(dá)分析和韋恩圖鑒定出UC緩解期脾虛濕困證和活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因及兩者間的對話基因。通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）及Spearman相關(guān)性分析深入探討對話基因參與的生物過程及潛在功能。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析探討UC緩解期與活動(dòng)期的差異情況及對話基因在其中的作用。基于循環(huán)算法構(gòu)建UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型。運(yùn)用外部數(shù)據(jù)集、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）進(jìn)一步驗(yàn)證對話基因的表達(dá)情況。借助SoFDA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“基因-中醫(yī)癥狀/現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀”網(wǎng)絡(luò)；借助TCMIP和COREMINE數(shù)據(jù)庫預(yù)測對話基因的潛在靶向中藥。鑒定出31個(gè)UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因，其主要富集在代謝相關(guān)途徑；鑒定出160個(gè)UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因，其主要富集在炎癥免疫相關(guān)途徑。鑒定出22個(gè)UC緩解期脾虛濕困證與活動(dòng)期濕熱阻滯證之間的對話基因，上調(diào)對話基因與炎癥免疫相關(guān)途徑呈顯著相關(guān)性，下調(diào)對話基因與代謝途徑呈顯著相關(guān)性。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析顯示，相比于正常對照及UC緩解期，UC活動(dòng)期中B細(xì)胞占比上調(diào)；B細(xì)胞在UC活動(dòng)期濕熱阻滯證中作用貢獻(xiàn)較大，而在UC緩解期脾虛濕困證中的作用貢獻(xiàn)較?。籙C活動(dòng)期B細(xì)胞的受體信號通路活性明顯高于UC緩解期；上調(diào)的對話基因CD55在B細(xì)胞中表達(dá)水平較高，CD55+B細(xì)胞與CD55?B細(xì)胞之間存在差異的細(xì)胞通訊及細(xì)胞代謝水平。6個(gè)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測基因（、、、、、）可以較為準(zhǔn)確預(yù)測UC緩解期脾虛濕困證向UC活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及RT-PCR驗(yàn)證了其表達(dá)水平。通過數(shù)據(jù)庫檢索得到人參、黃芪、枸杞子等45味潛在靶向中藥。鑒定出22個(gè)關(guān)鍵對話基因，它們可能通過影響炎癥免疫和代謝相關(guān)途徑誘導(dǎo)UC緩解期脾虛濕困證向UC活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展。B細(xì)胞在UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。CD55可能通過影響炎癥免疫和代謝相關(guān)途徑，促進(jìn)B細(xì)胞活性，從而促進(jìn)UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展。22個(gè)關(guān)鍵對話基因與UC相關(guān)中醫(yī)癥狀和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀關(guān)聯(lián)密切。

潰瘍性結(jié)腸炎；單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組；轉(zhuǎn)錄組；緩解期；脾虛濕困證；活動(dòng)期；濕熱阻滯證；人參；黃芪；枸杞子

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種影響直腸和結(jié)腸的終身炎癥性疾病。2023年，全球UC的患病人數(shù)估計(jì)為500萬例，且發(fā)病率呈上升趨勢[1]。UC是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的2種類型之一，其特點(diǎn)是從直腸到近端結(jié)腸的慢性炎癥，該病病程纏綿，活動(dòng)期與緩解期常交替出現(xiàn)，活動(dòng)期以腹痛腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)[2]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，UC屬于“泄瀉”“痢疾”和“腹痛”等范疇，脾虛濕困證和濕熱阻滯證是UC的兩大基本病因病機(jī)[3]，UC緩解期以脾虛濕困證為主[4]，在脾胃虛弱濕邪內(nèi)蘊(yùn)的基礎(chǔ)上會(huì)產(chǎn)生諸多變證[3]。UC活動(dòng)期以濕熱阻滯證為主，大腸濕熱易導(dǎo)致血瘀腸絡(luò)，最后累及脾陽腎陽[3,5]。雖然這些理論已經(jīng)過臨床實(shí)踐檢驗(yàn)，但UC緩解期脾虛濕困證向UC活動(dòng)期濕熱阻滯證的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不清楚，證候作為中醫(yī)理論的核心，其生物學(xué)基礎(chǔ)不清、病證關(guān)聯(lián)機(jī)制不明是制約中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的一大瓶頸[6]。

采用現(xiàn)代技術(shù)闡述中醫(yī)證候病理機(jī)制，有助于中醫(yī)藥科學(xué)內(nèi)涵的闡釋。轉(zhuǎn)錄組測序（transcriptome，RNA-seq）是在總體水平上研究細(xì)胞中所有基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，是基因組遺傳信息和生物功能之間的重要橋梁[7]，其有利于解釋疾病發(fā)展過程中某一階段病理概括的發(fā)生發(fā)展機(jī)制[8]。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single cell transcriptome sequencing，scRNA-seq）已經(jīng)成為一種研究單細(xì)胞分辨率的復(fù)雜生物系統(tǒng)的強(qiáng)大技術(shù)，其出現(xiàn)使得在單細(xì)胞水平上對特定細(xì)胞群進(jìn)行分析成為可能[9]。單細(xì)胞測序用于中醫(yī)辨證分型的研究，不僅能闡釋其科學(xué)性，還能使其更加規(guī)范化與標(biāo)準(zhǔn)化[10]。因此，借助現(xiàn)代科技手段深入研究UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證的發(fā)生發(fā)展，了解其潛在分子機(jī)制，對于發(fā)現(xiàn)新的UC臨床治療方案具有重要意義。

為探討UC緩解期脾虛濕困證與活動(dòng)期濕熱阻滯證之間的潛在關(guān)聯(lián)機(jī)制，本研究綜合分析了UC相關(guān)RNA-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)，以期找到UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子，并對這些分子在疾病進(jìn)程中的作用進(jìn)行深入探討，同時(shí)關(guān)聯(lián)了核心基因相關(guān)的中醫(yī)癥狀和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀，并且得到其潛在靶向中藥，為UC的臨床治療和中藥新藥開發(fā)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與處理

從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/）下載了3個(gè)UC相關(guān)RNA-seq數(shù)據(jù)集GSE75214[11]、GSE53306[12]和GSE38713[13]。GSE75214包括74個(gè)UC活動(dòng)期樣本、23個(gè)UC緩解期樣本和11個(gè)正常對照樣本；GSE53306包括16個(gè)UC活動(dòng)期樣本、12個(gè)UC緩解期樣本和12個(gè)正常對照樣本；GSE38713包括15個(gè)UC活動(dòng)期樣本、15個(gè)UC緩解期樣本和13個(gè)正常對照樣本。其中，GSE75214作為訓(xùn)練集，GSE53306和GSE38713作為驗(yàn)證集。另外，檢索得到UC相關(guān)scRNA-seq數(shù)據(jù)集GSE231993[14]，該數(shù)據(jù)集包含4個(gè)UC患者炎癥反應(yīng)活躍處的腸黏膜樣本、4個(gè)上述UC患者其自身非炎癥反應(yīng)活躍處的腸黏膜樣本和4個(gè)正常對照的腸黏膜樣本，將炎癥反應(yīng)活躍處的腸黏膜樣本作為活動(dòng)期樣本、非炎癥反應(yīng)活躍處的腸黏膜樣本作為緩解期樣本進(jìn)行后續(xù)分析。使用R 4.2.1中的“Seurat”[15]R包對GSE231993進(jìn)行處理，使用CreateSeuratObject創(chuàng)建seurat對象，檢測到200＜基因＜4 000且線粒體基因＜20%的細(xì)胞被保留用于后續(xù)分析。為了可視化和統(tǒng)計(jì)分析scRNA-seq數(shù)據(jù)集，該研究測試了26個(gè)主成分并將其用于均勻流形逼近和投影圖（uniform manifold approximation and projection，UMAP）分析。使用聚類分辨率為0.5的FindNeighbors和FindClusters函數(shù)進(jìn)行細(xì)胞簇聚類分析。通過“singleR”包及人工校正的方式對細(xì)胞簇進(jìn)行注釋。

1.2 UC緩解期脾虛濕困證與UC活動(dòng)期濕熱阻滯證之間潛在共享基因的鑒定

使用“l(fā)imma”[16]R包對UC緩解期與正常對照樣本進(jìn)行差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）分析，UC緩解期DEGs篩選標(biāo)準(zhǔn)為＜0.05和|log2FC|＞0.585。同理得到UC活動(dòng)期DEGs。通過中醫(yī)證候本體及多維定量關(guān)聯(lián)計(jì)算平臺(tái)（SoFDA，http://www.tcmip.cn/Syndrome/front/#/）[17]分別搜集脾虛濕困證和濕熱阻滯證的主次癥狀相關(guān)基因集，共獲得脾虛濕困證相關(guān)基因558個(gè)和濕熱阻滯證相關(guān)基因608個(gè)。SoFDA是一個(gè)中醫(yī)證候本體論、證候分類工具以及與疾病相關(guān)的特征關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫，可用于研究病理聯(lián)系和治療機(jī)制[17]。將UC緩解期DEGs與脾虛濕困證相關(guān)基因取交集得到UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因；將UC活動(dòng)期DEGs與濕熱阻滯證相關(guān)基因取交集得到UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因。將UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因與UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因取交集，得到UC緩解期脾虛濕困證與UC活動(dòng)期濕熱阻滯證之間潛在共享基因（以下稱“對話基因”）。

1.3 功能富集分析

為進(jìn)一步探討UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因和UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因的功能，分別對其進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，校正后＜0.05被認(rèn)為具有顯著性?；蚣儺惙治觯╣ene set variation analysis，GSVA）是一種非參數(shù)和非線性的算法，可用于評估基因表達(dá)微陣列中的富集數(shù)據(jù)?；贕SVA包，使用GSVA定量通路和生物學(xué)過程的活性[18]，并比較UC活動(dòng)期、UC緩解期和正常對照樣本之間的通路活性。為進(jìn)一步理解UC緩解期脾虛濕困證與UC活動(dòng)期濕熱阻滯證之間的潛在發(fā)展機(jī)制，將對話基因與差異通路活性評分進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。

1.4 UC緩解期/活動(dòng)期各類型細(xì)胞對脾虛濕困證/濕熱阻滯證表型的作用活性評分

利用“Seurat”包中的“AddModuleScore”功能定量每個(gè)細(xì)胞中特定基因組的活性[19]?；赨C緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因，對UC緩解期中的每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行打分并比較各類細(xì)胞對UC緩解期脾虛濕困證的作用貢獻(xiàn)；相同的方法用于分析UC活動(dòng)期中各類細(xì)胞對UC活動(dòng)期濕熱阻滯證的作用貢獻(xiàn)。

1.5 CD55+B細(xì)胞和CD55?B細(xì)胞的細(xì)胞通訊及細(xì)胞代謝分析

使用“CellChat”[20]包分別在UC緩解期和UC活動(dòng)期樣本中進(jìn)行細(xì)胞通訊分析，比較CD55+B細(xì)胞和CD55?B細(xì)胞與其他微環(huán)境細(xì)胞之間的串?dāng)_，使用CellChatDB.huma作為配體-受體相互作用參考數(shù)據(jù)庫。＜0.05被認(rèn)為細(xì)胞-細(xì)胞相互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算簇中平均受體表達(dá)水平和相互作用簇中平均配體表達(dá)水平，使用點(diǎn)圖來說明配體-受體相互作用的平均值之間的差異。同時(shí)，在單細(xì)胞水平上使用“scMetabolism”包[21]評估細(xì)胞的代謝特征。“scMetabolism”包可在單細(xì)胞水平量化代謝，該包以常規(guī)單細(xì)胞矩陣文件為基礎(chǔ)，采用VISION算法對每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評分，從而得到細(xì)胞在每條代謝通路中的活性得分[21]。

1.6 外部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證

基于2個(gè)外部數(shù)據(jù)集GSE53306和GSE38713驗(yàn)證對話基因在UC活動(dòng)期、UC緩解期和正常對照樣本之間的表達(dá)水平，使用箱圖和小提琴圖實(shí)現(xiàn)可視化。

1.7 UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的構(gòu)建及驗(yàn)證

綜合上述分析，最后基于對話基因進(jìn)行循環(huán)算法分析，以確定最佳的UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型[22-23]。在每個(gè)循環(huán)中，從16個(gè)特征基因中隨機(jī)選擇15個(gè)基因的組合。然后，使用“Cancerclass”[24]R包來估計(jì)合并數(shù)據(jù)集中的曲線下面積（area under curve，AUC），并檢查每種組合的預(yù)測準(zhǔn)確度。在16種組合中，將具有最高AUC（genelistmax AUC）的基因組合進(jìn)行篩選并應(yīng)用于下一個(gè)周期。重復(fù)該循環(huán)，直到剩下不超過3種不同的基因組合。最后，選擇所有循環(huán)中AUC值最高且值最顯著的基因組來構(gòu)建預(yù)測模型，其中GSE75214作為訓(xùn)練集，GSE53306和GSE38713作為驗(yàn)證集。

1.8 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測基因在UC與正常組織中的表達(dá)情況分析

1.8.1 儀器與試劑 衰變加速因子（decay-accelerating factor，CD55）、神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)化酶1（neuroendocrine convertase 1，PCSK1）、血漿蛋白酶C1抑制劑（plasma protease C1 inhibitor，SERPING1）、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1（acetyl-CoA acetyltransferase 1，ACAT1）、溶質(zhì)載體系列26成員2（solute carrier family 26 member 2，SLC26A2）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶2（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2，HMGCS2）PCR引物由美國Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）購自美國MP Biomedical公司（批號S8634）。電泳儀及電泳槽（Bio-rad公司）；RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.8.2 動(dòng)物模型制備 10只SPF級雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京維通利華有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2021-0006。飼養(yǎng)環(huán)境濕度保持在（55±2）%，12 h黑夜和12 h白天循環(huán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)方案進(jìn)行，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批號ZYD-2023-153。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將10只小鼠隨機(jī)分為正常組與模型組，每組5只。模型組連續(xù)7 d自由飲用3% DSS制備UC模型，正常組予正常飲用水。

1.8.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）分析 RT-PCR檢測風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測基因在模型組結(jié)腸黏膜組織與正常組結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)水平。使用TRIzol試劑提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；使用TBgreen（RR420）染料按照10 μL體系進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，引物序列見表1。通過2???Ct方法測定基因相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，）為管家基因。

1.9 “基因-中醫(yī)癥狀/現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀”和“基因-中藥”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將對話基因?qū)隨oFDA平臺(tái)[17]，對其相關(guān)中醫(yī)癥狀與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀進(jìn)行富集分析，以挖掘其對應(yīng)的UC相關(guān)中醫(yī)癥狀及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀。通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)v2.0（TCMIP，http://www.tcmip. cn/TCMIP/index.php/Home/）[25]尋找靶向?qū)υ捇虻闹兴?。由于CD55在TCMIP數(shù)據(jù)庫中沒有找到靶向中藥，故在COREMINE數(shù)據(jù)庫（https://www. coremine.com/）中預(yù)測相關(guān)靶向中藥，＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。使用Cytoscape軟件構(gòu)建“基因-中醫(yī)癥狀/現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀”和“基因-中藥”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

表1 基因引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因和UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因的鑒定及功能富集分析

共鑒定出UC緩解期DEGs 582個(gè)，其中上調(diào)基因289個(gè)，下調(diào)基因293個(gè)，見圖1-A。將UC緩解期DEGs與脾虛濕困證相關(guān)基因取交集得到31個(gè)UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因，見圖1-C。共鑒定出UC活動(dòng)期DEGs 2 780個(gè)，其中上調(diào)基因1 557個(gè)，下調(diào)基因1 223，見圖1-B。將UC活動(dòng)期DEGs與濕熱阻滯證相關(guān)基因取交集得到160個(gè)UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因，見圖1-D。KEGG富集分析顯示，UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因主要富集在代謝相關(guān)通路，包括過氧化物酶體增殖物活化受體（peroxisome proliferator activates receptor，PPAR）信號通路，脂肪酸降解，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，脂肪酸代謝，萜類骨架生物合成、丁酸代謝等，見圖1-E；UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因主要富集在免疫相關(guān)通路，包括炎性腸病、輔助性T細(xì)胞1型（T helper cell 1，Th1）和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、原發(fā)性免疫缺陷、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和腸道免疫網(wǎng)絡(luò)等，見圖1-F。

2.2 UC緩解期脾虛濕困證與UC活動(dòng)期濕熱阻滯證之間潛在對話基因的鑒定及功能相關(guān)性分析

將31個(gè)UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因與160個(gè)UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因取交集，得到22個(gè)兩者潛在對話基因，其中11個(gè)上調(diào)對話基因和11個(gè)下調(diào)對話基因，見圖2，差異表達(dá)情況見表2。GSVA結(jié)果顯示，相比于正常對照和UC緩解期，代謝相關(guān)通路在UC活動(dòng)期中明顯下調(diào)，包括甘油脂代謝，花生四烯酸酸代謝，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝和組氨酸代謝等，見圖3-A；相比于正常對照和UC緩解期，炎癥免疫相關(guān)通路在UC活動(dòng)期中明顯上調(diào)，包括B細(xì)胞受體信號通路、系統(tǒng)性狼瘡紅斑、自身免疫甲狀腺疾病、利什曼感染、趨化因子信號通路和抗原處理和呈現(xiàn)等，見圖3-B。Spearman相關(guān)性分析顯示，、白細(xì)胞介素7受體（interleukin 7 receptor，）和補(bǔ)體成分4A（complement component 4A，）等上調(diào)基因與炎癥免疫相關(guān)通路呈顯著正相關(guān)，見圖4-A；ATP結(jié)合盒亞家族B成員11（ATP binding cassette subfamily B member 11，ABCB11）、酰基輔酶A脫氫酶中鏈（acyl-CoA dehydrogenase medium chain，ACADM）和肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyl-transferase 1A，CPT1A）等下調(diào)基因與代謝相關(guān)通路呈顯著正相關(guān)，見圖4-B。

2.3 B細(xì)胞可能是UC緩解期脾虛濕困證向UC活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展的關(guān)鍵免疫細(xì)胞

分析來自GSE231993數(shù)據(jù)集的單細(xì)胞測序樣本，通過質(zhì)量控制排除低質(zhì)量線粒體細(xì)胞后，選擇45 579個(gè)細(xì)胞用于后續(xù)分析。通過UMAP算法對細(xì)胞進(jìn)行聚類得到26個(gè)細(xì)胞簇。進(jìn)一步通過“singleR”包及人工注釋將26個(gè)細(xì)胞簇分為8種細(xì)胞類型：B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肥大細(xì)胞，見圖5-A。細(xì)胞類型占比分析顯示，相比于正常對照及UC緩解期，UC活動(dòng)期中B細(xì)胞占比上調(diào)，見圖5-B。為探討UC緩解期各類型細(xì)胞對脾虛濕困證表型的作用活性，基于31個(gè)UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因，使用“Seurat”包的AddModuleScore功能對UC緩解期中的每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評分并對各類型細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果顯示B細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞的得分較低，上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的得分較高；同理，基于160個(gè)UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因，對UC活動(dòng)期中每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評分并對各類型細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果顯示B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的得分較高，而其他細(xì)胞的得分較低，見圖6。進(jìn)一步比較了B細(xì)胞受體信號通路活性在UC緩解期B細(xì)胞和UC活動(dòng)期B細(xì)胞的差異，結(jié)果顯示UC活動(dòng)期B細(xì)胞的受體信號通路活性明顯高于UC緩解期，見圖7。因此，推測B細(xì)胞可能在UC緩解期脾虛濕困證向UC活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

A-UC緩解期vs正常對照火山圖；B-UC活動(dòng)期vs正常對照火山圖；C-UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因的鑒定；D-UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因的鑒定；E-UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因的KEGG富集分析；F-UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因的KEGG富集分析。

圖2 對話基因的鑒定

A-相對于正常對照組，UC緩解期與UC活動(dòng)期上調(diào)的通路；B-相對于正常對照組，UC緩解期與UC活動(dòng)期下調(diào)的通路。

2.4 CD55+B細(xì)胞和CD55?細(xì)胞的細(xì)胞通訊及細(xì)胞代謝分析

在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中，分析了11個(gè)上調(diào)對話基因在各類型細(xì)胞的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CD55在B細(xì)胞中高表達(dá)，見圖8-A。接著，分別在UC緩解期和UC活動(dòng)期單細(xì)胞樣本中對CD55+B細(xì)胞和CD55?B細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞通訊及細(xì)胞代謝分析。細(xì)胞通訊結(jié)果顯示，在UC緩解期樣本中，CD55+B細(xì)胞和CD55?B細(xì)胞的細(xì)胞通訊較為一致，見圖8-B；而在UC活動(dòng)期樣本中，相比于CD55?B細(xì)胞，CD55+B細(xì)胞在免疫細(xì)胞微環(huán)境中與其他類型細(xì)胞的交互通訊更為密切且強(qiáng)度更大，見圖8-C。細(xì)胞代謝結(jié)果顯示，UC活動(dòng)期中的B細(xì)胞代謝相關(guān)途徑活性明顯高于UC緩解期，且在UC緩解期和活動(dòng)期中，CD55+B細(xì)胞代謝相關(guān)途徑活性明顯高于CD55?B細(xì)胞，見圖9。由此，推測CD55可能通過影響代謝相關(guān)途徑，促進(jìn)B細(xì)胞活性，從而促進(jìn)UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展。

圖4 11個(gè)上調(diào)對話基因與炎癥免疫相關(guān)通路活性(A) 和11個(gè)下調(diào)對話基因與代謝相關(guān)通路活性(B) 的相關(guān)性分析

圖5 UC活動(dòng)期、UC緩解期和正常對照樣本之間所有細(xì)胞數(shù)據(jù)的UMAP散點(diǎn)圖(A) 和細(xì)胞亞群占比圖(B)

圖6 不同類型細(xì)胞對UC緩解期脾虛濕困證和UC活動(dòng)期濕熱阻滯證表型的作用活性評分及比較

圖7 UC活動(dòng)期與UC緩解期之間B細(xì)胞受體信號通路活性的比較

2.5 外部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證

基于2個(gè)外部數(shù)據(jù)集GSE53306和GSE38713驗(yàn)證了22個(gè)對話基因，發(fā)現(xiàn)除了窖蛋白-1（caveolin 1，）、細(xì)絲蛋白A（filamin A，）、、原癌基因蛋白（MYC proto-oncogene, BHLH transcription factor，）以外，其他基因的表達(dá)水平均與訓(xùn)練集一致：相對于正常對照，在UC緩解期和活動(dòng)期中、、、、、轉(zhuǎn)錄因子4（transcription factor 4,）、絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 1型（serine peptidase inhibitor kazal type 1，）、線粒體RNA加工的RNA組分核糖核酸內(nèi)切酶（RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，）存在不同程度的上調(diào)趨勢，而、、琥珀酰輔酶A: 戊二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶（succinyl-CoA: glutarate-CoA transferase，）、、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白脫氫酶（electron transfer flavoprotein dehydrogenase，）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B（cyclin dependent kinase inhibitor 2B，）、3β-羥基-δ5-類固醇脫氫酶2型（3β-hydroxy-δ5-steroid dehydrogenase type 2，）、溶質(zhì)載體家族22成員5（solute carrier family 22 member 5，）、和存在不同程度的下調(diào)趨勢，見圖10、11。

圖8 11個(gè)上調(diào)潛在對話基因在不同類型細(xì)胞的表達(dá)水平(A) 及UC緩解期(B) 和UC活動(dòng)期(C) 中CD55+B細(xì)胞和CD55?B細(xì)胞的細(xì)胞通訊分析

圖9 UC緩解期(A) 和UC活動(dòng)期(B) 中CD55+B細(xì)胞和CD55?B細(xì)胞的細(xì)胞代謝分析

2.6 UC緩解期脾虛濕困證向UC活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的構(gòu)建

綜合上述分析，對16個(gè)UC緩解期脾虛濕困證與UC活動(dòng)期濕熱阻滯證之間潛在關(guān)鍵對話基因（、、、、、、、、、、、、、、、）進(jìn)行循環(huán)算法分析，以確定最佳的預(yù)測模型，循環(huán)算法流程見圖12-A。納入循環(huán)算法構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的基因是訓(xùn)練數(shù)據(jù)集與驗(yàn)證數(shù)據(jù)集共有的基因，且這些基因經(jīng)過訓(xùn)練數(shù)據(jù)集與驗(yàn)證數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證，在UC活動(dòng)期樣本中均存在上調(diào)/下調(diào)趨勢。在GSE75214中，6個(gè)基因（、、、、、）的組合呈現(xiàn)AUC峰值，見圖12-B。6個(gè)基因的組合可以較為準(zhǔn)確預(yù)測UC緩解期脾虛濕困證向UC活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展，AUC為0.99，95% CI：0.98～1.00，＝1.4×10?6，見圖12-C。在GSE53306中6個(gè)基因的組合AUC為0.78，95% CI：0.69～0.86，＝0.11，見圖12-D。在GSE38713中6個(gè)基因的組合AUC為0.99，95% CI：0.96～1.00，＝0.003 8，見圖12-E。

*P?＜?0.05 **P?＜?0.01 ***P?＜??0.001

圖11 基于GSE38713數(shù)據(jù)集驗(yàn)證22個(gè)對話基因的表達(dá)水平

A-循環(huán)算法流程；B-條形圖，顯示基因組合的AUC，每個(gè)循環(huán)的最大AUC（不同的基因數(shù)目組合）；C～E-6基因組合對于預(yù)測UC緩解期脾虛濕困證向UC活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展具有較高的預(yù)測性能。

2.7 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測基因在UC和正常對照組織中的表達(dá)驗(yàn)證

對疾病組與正常組的結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色以確保模型復(fù)刻成功。由結(jié)腸病理圖所示，正常組小鼠的結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，腸腺整齊排列，上皮細(xì)胞之間緊密相連。與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)明顯潰瘍，結(jié)腸上皮細(xì)胞大量脫落，腺體排列紊亂，黏膜層和黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤，見圖13。RT-PCR結(jié)果顯示，、、在UC組織中表達(dá)顯著升高（＜0.05），、、在UC組織中表達(dá)顯著降低（＜0.05），見圖14。6個(gè)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測基因與上述分析結(jié)果一致。

2.8 “基因-中醫(yī)癥狀/現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀”和“基因-中藥”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

22個(gè)對話基因與5個(gè)UC相關(guān)中醫(yī)癥狀和5個(gè)UC相關(guān)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀密切相關(guān)，見圖15、16。通過TCMIP和COREMINE數(shù)據(jù)庫共獲得人參、黃芪、枸杞子等45味中藥，靶向8個(gè)UC緩解期脾虛濕困證與UC活動(dòng)期濕熱阻滯證之間潛在對話基因，見圖17。

3 討論

3.1 代謝和炎癥免疫相關(guān)途徑在UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要作用

KEGG富集分析顯示，UC緩解期脾虛濕困證相關(guān)基因主要富集在脂肪酸降解，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，脂肪酸代謝，萜類骨架生物合成，丁酸代謝等代謝相關(guān)途徑。Wu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，IBD脾虛證與IBD濕熱證之間存在多種顯著血漿差異代謝物，包括甘油磷脂、脂肪酰基和宿主共生腸道菌群氨基酸等。前期研究表明，脂質(zhì)代謝物在IBD炎癥過程中起著關(guān)鍵作用[27]。氨基酸是幾乎所有類型細(xì)胞的基本代謝產(chǎn)物，在維持腸道健康方面發(fā)揮著重要作用。在IBD患者中，氨基酸在腸道屏障和抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生中具有突出的地位，它們還與緊密連接蛋白、氧化應(yīng)激、腸上皮細(xì)胞凋亡和消化道炎癥中產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子有關(guān)[28]。UC活動(dòng)期濕熱阻滯證相關(guān)基因主要富集在炎性腸病、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和腸道免疫網(wǎng)絡(luò)等炎癥免疫相關(guān)途徑。UC起源于宿主黏膜免疫和腸道細(xì)菌菌群之間平衡的破壞，導(dǎo)致對共生非致病菌的異常免疫反應(yīng)[1]。與健康對照組相比，IBD患者的腸黏膜和固有層中含有更高水平的Th17細(xì)胞、IL-17和IL-23。在UC模型小鼠中，IL-17A和IL-17F的缺陷顯示對結(jié)腸炎具有保護(hù)作用[29]。CD4+T細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞可促進(jìn)Th2相關(guān)細(xì)胞因子和Th17相關(guān)促炎細(xì)胞因子的釋放，加重UC腸道炎癥反應(yīng)[1]。越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞因子及趨化因子信號在UC中的作用[30]。脾虛濕困證是指脾氣不足、運(yùn)化失健、聚濕生痰、濕濁內(nèi)蘊(yùn)導(dǎo)致的一系列證候，濕郁日久易化熱，濕邪和熱邪相互交織，導(dǎo)致身體內(nèi)濕與熱同時(shí)存在，并形成阻滯的一種病理狀態(tài)。炎癥反應(yīng)是指身體對外部刺激或病原體進(jìn)行防御反應(yīng)的過程。一方面，濕邪和熱邪都會(huì)刺激身體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生；另一方面，濕熱阻滯證可能會(huì)影響身體內(nèi)部的代謝過程，導(dǎo)致身體內(nèi)部的炎癥反應(yīng)加劇。

*P?＜?0.05 **P?＜?0.01 ***P?＜0.001 ****P＜0.000 1

圖15 “基因-中醫(yī)癥狀”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

圖16 “基因-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

圖17 “基因-中藥”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

3.2 B細(xì)胞在UC緩解期脾虛濕困證向UC活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展過程中扮演重要角色

研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞對UC緩解期脾虛濕困證表型的作用貢獻(xiàn)較小，而對UC活動(dòng)期濕熱阻滯證表型的作用貢獻(xiàn)較大，且UC活動(dòng)期B細(xì)胞受體信號通路活性明顯上調(diào)，提示B細(xì)胞可能在UC緩解期脾虛濕困證向UC活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。B細(xì)胞在UC炎癥發(fā)生期間大幅擴(kuò)增[31]，成為結(jié)腸組織中最主要的免疫細(xì)胞類型，是UC腸道炎癥發(fā)作和進(jìn)展相關(guān)的適應(yīng)性免疫疾病的標(biāo)志[32]。抗原激活記憶B細(xì)胞，促使它們向漿細(xì)胞分化并產(chǎn)生引發(fā)UC發(fā)病機(jī)制的抗原特異性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）[33]。B細(xì)胞在炎癥性腸病組織愈合中同樣發(fā)揮重要作用，活化的B細(xì)胞在一定程度上干擾了基質(zhì)-上皮細(xì)胞間的相互作用，不利于腸黏膜的修復(fù)過程[31]，B細(xì)胞耗竭在炎癥性腸病的黏膜愈合前期具有積極作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)對話基因，在B細(xì)胞中表達(dá)水平較高，且與B細(xì)胞信號通路活性呈正相關(guān)，CD55+B細(xì)胞在免疫細(xì)胞微環(huán)境中與其他類型細(xì)胞的交互通訊更為密切且強(qiáng)度更大，CD55+B細(xì)胞代謝相關(guān)途徑活性明顯高于CD55?B細(xì)胞。CD55是保護(hù)自身免疫細(xì)胞免受補(bǔ)體介導(dǎo)裂解的關(guān)鍵分子，作為一種免疫調(diào)節(jié)分子，在炎癥免疫反應(yīng)中，CD55可以與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮其作用[34-35]。因此，本研究推測CD55在介導(dǎo)B細(xì)胞活化過程中發(fā)揮重要作用，CD55可能通過影響炎癥免疫和代謝相關(guān)途徑，促進(jìn)B細(xì)胞活性，從而促進(jìn)UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展，但仍需通過實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步挖掘其潛在機(jī)制。

3.3 6個(gè)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測基因可預(yù)測UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)生發(fā)展

本研究使用循環(huán)算法以構(gòu)建更準(zhǔn)確的UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)生發(fā)展的預(yù)測模型，結(jié)果顯示，6個(gè)基因（、、、、、）的組合呈現(xiàn)AUC峰值且值最顯著，提示其在疾病發(fā)展中的重要意義。既往研究顯示，UC患者疾病活動(dòng)性糞便、結(jié)腸黏膜和外周血白細(xì)胞中的表達(dá)增加[36-38]，其與黏膜炎癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)酮體相關(guān)限速酶基因和在UC組織中下調(diào)，酮體在腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，外源性補(bǔ)充β-羥基丁酸（機(jī)體含量最多的酮體）可有效緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[39]。阻斷UC的“炎-癌”轉(zhuǎn)化是臨床防治UC的核心問題[40]，綜合前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于正常組織，在UC和結(jié)直腸癌中均明顯上調(diào)，高表達(dá)的直腸癌患者具有較差的疾病特異性生存期、局部無復(fù)發(fā)生存期和無轉(zhuǎn)移生存期[41]；在UC和結(jié)直腸癌中均明顯下調(diào)[42-43]，低表達(dá)與體外結(jié)腸癌細(xì)胞增殖快速發(fā)展有關(guān)[44]，同時(shí)對于腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)組織中遷移也十分重要[42]。在UC組織中顯著上調(diào)，目前沒有直接證據(jù)表明基因與UC有聯(lián)系，但發(fā)現(xiàn)其與炎癥免疫相關(guān)途徑呈正相關(guān)，可能在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

3.4 靶向預(yù)測的中藥是干預(yù)UC緩解期脾虛濕困證向活動(dòng)期濕熱阻滯證發(fā)展的潛在藥物

本研究對22個(gè)對話基因進(jìn)行了靶向中藥預(yù)測，其中人參、黃芪、枳殼、半夏、枸杞子等中藥在“基因-中藥”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的連接度較高。人參-黃芪藥對重在益氣健脾，UC的發(fā)病與脾虛關(guān)系密切，而脾虛往往與氣虛有關(guān)，因此，治療UC需要從補(bǔ)氣、健脾、利濕等方面入手。人參和黃芪的主要成分為皂苷類化合物，其具有抗炎及調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)的作用，尤其是對于與腸道炎癥相關(guān)的消化系統(tǒng)疾病而言[45]。人參皂苷Rg3可通過抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體激活和調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)來改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[46]。黃芪皂苷IV通過重塑Th17/Treg細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和抗氧化應(yīng)激有效預(yù)防和減輕UC[47]。半夏降逆止嘔、散結(jié)除痞，為燥濕化痰之要藥，配伍枳殼理氣寬中、行滯消脹，可有效改善UC氣逆嘔吐、腹脹腹痛等癥狀。研究表明，半夏瀉心湯可通過降低UC患者血清炎癥因子水平、抑制UC模型大鼠細(xì)胞焦亡、改善腸道黏膜屏障功能等達(dá)到改善UC的作用[45]。枸杞子可減輕腸道杯狀細(xì)胞群受損并增強(qiáng)黏液層，枸杞子多糖對氧化應(yīng)激、炎癥和神經(jīng)退行性變具有保護(hù)作用[48]。

4 結(jié)論

本研究通過分析UC相關(guān)scRNA-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)初步揭示了UC緩解期脾虛濕困證與活動(dòng)期濕熱阻滯證之間的潛在分子機(jī)制，外部數(shù)據(jù)集和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明關(guān)鍵對話基因其具有良好的臨床辨證效能，相關(guān)結(jié)果有助于提高UC核心證候臨床精準(zhǔn)化診斷的水平和證候客觀化研究的深度。通過TCMIP和COREMINE數(shù)據(jù)庫得到了靶向?qū)υ捇虻臐撛陉P(guān)鍵中藥，后續(xù)仍需進(jìn)一步體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其干預(yù)機(jī)制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Revelation of potential molecular mechanism between spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage and damp-heat stagnation syndrome in active stage of ulcerative colitis based on multiomics analysis and prediction of targeted traditional Chinese medicine

LI Zuming1, FENG Jieni1, CHEN Xueru1, CHEN Jiankun2, LU Yue2, LI Jiqiang2, FENG Yan2

1. The Second Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China 2. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine), Guangzhou 510006, China

To explore the potential molecular mechanism between spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage and dampness-heat stagnation syndrome in active stage of ulcerative colitis (UC) by comprehensively analyzing the scRNA-seq and RNA-seq data sets related to UC, and to explore the potential intervention of traditional Chinese medicine (TCM).Differential gene expression analysis and venn diagram analysis were used to identify the related genes of spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage of UC, dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC and the crosstalk genes between them. Enrichment analysis of Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) and gene set variation analysis(GSVA) and Spearman correlation analysis were used to explore the biological processes involved in crosstalk genes and their potential functions. Based on single-cell transcriptome analysis, we explored the differences between remission and active phases of UC and the role of crosstalk genes in them. Based on the circulation algorithm, a risk prediction model for the occurrence and development of UC from spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage to dampness-heat stagnation syndrome in active stage was constructed. Extraneous data, animal experiments and real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to further verify the expression of crosstalk genes. Based on SoFDA database, we constructed “gene-TCM symptom/modern medical symptom” network. Potential target traditional Chinese medicines (TCMs) of crosstalk genes were predicted by TCMIP and COREMINE databases.A total of 31 genes related to spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage of UC were identified, which were mainly enriched in metabolism-related pathways; A total of 160 genes related to dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC were identified, which were mainly enriched in inflammatory immune-related pathways. A total of 22 crosstalk genes were identified between spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage and dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC. Upregulating crosstalk genes were significantly correlated with inflammatory immune pathways, and downregulating crosstalk genes were significantly correlated with metabolism-related pathways. Single-cell transcriptome analysis revealed the proportion of B cells in the active phase was upregulated compared to normal controls and remission phases; B cells play a greater role in dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC than that in spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage. The receptor signaling pathway activity of B cells in UC active stage was significantly higher than that in UC remission stage. CD55, an up-regulated crosstalk gene, was highly expressed in B cells. There were differences in cell-to-cell communication and cellular metabolism between CD55+B cells and CD55?B cells. Six risk predict genes (,,,,,) can accurately predict the development from spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage to dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC. Animal experiments and RT-PCR confirmed their expression. A total of 45 potential targeted TCMs such as Renshen (et), Huangqi () and Gouqizi () through database retrieval were obtained.This study identified 22 key crosstalk genes, which may induce the development of spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage to dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC by influencing inflammatory immune and metabolic related pathways. B cells play an important role in the occurrence and development process from spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage to dampness-heat stagnation syndrome in active stage of UC. CD55 may promote B cell activity by affecting inflammatory immune and metabolic pathway, thus promoting the development of spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome in remission stage of UC to dampness-heat stagnation syndrome in active stage. A total of 22 key crosstalk genes are closely related to UC-related Chinese medicine symptoms and modern medical symptoms.

ulcerative colitis; single cell transcriptome; transcriptome; remission stage; spleen deficiency and dampness-stagnation syndrome; active stage; damp-heat stagnation syndrome;et;;

R285

A

0253 - 2670(2024)09 - 3041 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.018

2023-12-11

廣州市科技計(jì)劃?市校（院）聯(lián)合資助基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2023A03J0738）；廣東省中醫(yī)院朝陽人才科研專項(xiàng)資助（ZY2022KY10，ZY2022YL04）

黎祖鳴，本科。E-mail: gzylizuming@126.com

通信作者：馮 艷，副主任醫(yī)師。E-mail: gonggongshiyongyx@163.com

李際強(qiáng)，主任醫(yī)師。E-mail: lijiqiangjizhen@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]