基于血清代謝組學(xué)探究山茱萸多糖對(duì)2型糖尿病大鼠的干預(yù)機(jī)制

崔永霞，尚子慧，侯亞迪，王利麗，孫孝亞，吳明俠*，陳隨清, 2*

基于血清代謝組學(xué)探究山茱萸多糖對(duì)2型糖尿病大鼠的干預(yù)機(jī)制

崔永霞1，尚子慧1，侯亞迪1，王利麗1，孫孝亞1，吳明俠1*，陳隨清1, 2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)豫藥全產(chǎn)業(yè)鏈研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046

基于代謝組學(xué)探究山茱萸多糖干預(yù)2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠的作用機(jī)制。取10只SD雄性大鼠作為對(duì)照組，其余大鼠采用高糖高脂飼料結(jié)合ip鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)構(gòu)建T2DM模型。造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍（200 mg/kg）組和山茱萸多糖低、中、高劑量（75、150、300 mg/kg）組，各組大鼠每天上午ig藥物，連續(xù)給藥4周。末次給藥前大鼠禁食10 h，麻醉后腹主動(dòng)脈取血并分離血清，同時(shí)取肝臟組織。采用試劑盒檢測(cè)大鼠血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝臟組織病理變化；采用超高效液相色譜-線性離子阱串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道高分辨質(zhì)譜（UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS）技術(shù)檢測(cè)大鼠血清內(nèi)源性代謝物水平，并結(jié)合主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析對(duì)差異代謝物進(jìn)行篩選和鑒定，利用MetaboAnalyst平臺(tái)進(jìn)行代謝通路分析。與模型組比較，山茱萸多糖給藥組大鼠體質(zhì)量和血糖水平均降低，肝損傷明顯改善；血清中TC、TG、LDL-C、IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA水平和AST、ALT活性均顯著降低（＜0.05、0.01），HDL-C水平和SOD活性顯著升高（＜0.05）。血清代謝組學(xué)共篩選出35個(gè)與T2DM相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，山茱萸多糖給藥組可回調(diào)29個(gè)生物標(biāo)志物，主要涉及苯丙氨酸的代謝和生物合成、?；撬岷痛闻；撬岽x、醚脂質(zhì)代謝和丙酮酸代謝等22條代謝通路。山茱萸多糖能有效改善T2DM引起的糖脂代謝紊亂，減輕肝損傷，達(dá)到治療T2DM作用，可能與調(diào)節(jié)氨基酸代謝、糖代謝、脂質(zhì)代謝等多條代謝通路有關(guān)。

山茱萸多糖；2型糖尿??；UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS；代謝組學(xué)；氨基酸代謝；糖代謝；脂質(zhì)代謝

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是以糖脂代謝紊亂為特征的慢性疾病，主要由環(huán)境及遺傳因素引起，其主要發(fā)病機(jī)制為胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙[1-2]。中醫(yī)藥防治糖尿病的應(yīng)用歷史已有數(shù)千年，尤其在T2DM及其并發(fā)癥的防控中獨(dú)具優(yōu)勢(shì)[3]。中醫(yī)學(xué)將糖尿病歸屬于“消渴癥”范疇，其主要病機(jī)是陰液虧損、燥熱偏盛，臨床表現(xiàn)為陰氣虛弱、氣火旺盛、津傷燥結(jié)、瘀積氣血等。山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，性酸、澀，微溫，歸肝、腎經(jīng)，有滋補(bǔ)活絡(luò)、澀精固脫的功效。多糖是山茱萸的主要生物活性成分之一，其降血糖的活性關(guān)注度較高，但多局限于藥效指標(biāo)的測(cè)定，未能全面闡述山茱萸多糖干預(yù)T2DM的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸多糖對(duì)鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠具有降糖、調(diào)血脂的作用，可用于治療糖尿病及其并發(fā)癥，但其潛在作用機(jī)制尚未明確[4]。本研究采用高脂飼料結(jié)合ip STZ的方法誘導(dǎo)構(gòu)建T2DM大鼠模型，通過檢測(cè)大鼠血糖、血脂、肝功能、炎癥及抗氧化水平結(jié)合肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察，初步評(píng)價(jià)山茱萸多糖對(duì)T2DM大鼠的藥效作用；并利用UHPLC-MS技術(shù)進(jìn)行血清代謝組學(xué)研究，揭示山茱萸多糖治療T2DM的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量110～130 g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（浙）2019-0001。大鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h明暗交替，大鼠自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DWLL202206094）。

1.2 藥材

山茱萸產(chǎn)自河南西峽，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王利麗副教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

高脂飼料（批號(hào)20220617）購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；STZ（批號(hào)S-0130-5G）購自美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片（國藥準(zhǔn)字H20023370，批號(hào)ACD2130）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)A111-1-1）、三酰甘油（triglyceride，TG）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)A110-1-1）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)A113-1-1）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)A112-1-1）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C009-2-1）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C010-2-1）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)H002-1-2）、IL-6檢測(cè)試劑盒（批號(hào)H007-1-2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)H052-1-2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)A001-3）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)A003-1）購自南京建成生物工程研究所；甲醇、乙腈、甲酸（色譜級(jí)）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 儀器

Ultimate 3000型超高效液相色譜儀、LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜儀、Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀、SPD2020-230型真空濃縮儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；FSU-1200型冷凍干燥機(jī)（上海愛朗儀器有限公司）；IW-3021HR型高速離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；Milli-QPOD型超純水制備儀（美國Millipore公司）；羅氏卓越金采血糖儀（羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司）。

2 方法

2.1 山茱萸多糖的制備

將適量山茱萸藥材在50～60 ℃烘箱中干燥2 h，粉碎成粗粉，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入8倍量95%乙醇，90 ℃加熱回流4 h，濾出殘?jiān)]去殘余乙醇。殘?jiān)偌?0倍量蒸餾水，90 ℃加熱回流4 h，濾過，濾液濃縮到1/4體積。取濃縮液，采用Sevag法除蛋白。將脫蛋白后的溶液，加入4倍量95%乙醇攪拌均勻，靜置12 h，濾過，收集沉淀物，冷凍干燥即得山茱萸多糖[5]。采用苯酚-硫酸法測(cè)定山茱萸多糖的含量，得山茱萸多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于60%。

2.2 T2DM大鼠模型的建立

70只SD雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組，給予普通飼料，其余60只作為造模組，連續(xù)4周給予高脂高糖飼料后，所有大鼠禁食不禁水12 h，造模組大鼠ip 30 mg/kgSTZ溶液，對(duì)照組大鼠ip等體積檸檬酸鹽緩沖液[6]。分別于注射后第3、6天，大鼠禁食不禁水8 h，尾尖采血測(cè)空腹血糖，以連續(xù)2次測(cè)定血糖值＞11.1 mmol/L同時(shí)伴有多飲、多食、多尿、體質(zhì)量下降等癥狀，視為造模成功。

2.3 分組及給藥

造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍（200 mg/kg）[7]組和山茱萸多糖低、中、高劑量（75、150、300 mg/kg）組。各給藥組大鼠每日上午ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig生理鹽水（10 mL/kg），1次/d，連續(xù)給藥4周。實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組給予普通飼料，其余各組給予高糖高脂飼料。每日觀察大鼠日常狀況。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)

2.4.1 體質(zhì)量、血糖記錄 每周稱定并記錄大鼠體質(zhì)量，并測(cè)定大鼠血糖值。末次給藥前禁食12 h，稱定各組大鼠體質(zhì)量，測(cè)定大鼠空腹血糖值。

2.4.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后1 h麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min取上層血清分裝，置于?80 ℃保存?zhèn)溆?。?80 ℃凍存的血清樣品取出，4 ℃復(fù)溶，按照試劑盒說明書測(cè)定血清中血脂指標(biāo)（TC、TG、LDL-C、HDL-C），肝功能指標(biāo)（ALT、AST），炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α），抗氧化指標(biāo)（SOD、MDA）水平。

2.4.3 肝臟指數(shù)測(cè)定 迅速取出大鼠肝臟組織，冷生理鹽水漂洗，肝臟稱定質(zhì)量后，部分組織固定于4%多聚甲醛中，計(jì)算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)＝肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量

2.4.4 肝臟組織病理學(xué)觀察 各組大鼠肝臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，乙醇脫水后石蠟包埋，切片，用蘇木素-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

2.5 代謝組學(xué)分析

2.5.1 大鼠血清樣品的制備 將儲(chǔ)存于?80 ℃冰箱中的血清取出，4 ℃解凍。精密吸取每個(gè)血清樣品各100 μL置于1.5 mL離心管中，加入900 μL甲醇-乙腈（1∶1）于混懸振蕩器上，2 000 r/min渦旋5 min，4 ℃、13 600 r/min離心10 min，取上清液900 μL，置于真空濃縮儀干燥4 h，取出，加入50 μL 80%甲醇復(fù)溶，渦旋5 min，4 ℃、13 600 r/min離心10 min，取上清液，待測(cè)。

2.5.2 質(zhì)控樣本的制備 每組抽取2個(gè)血清樣本，分別吸取100 μL置于同一離心管中，渦旋混勻，按照“2.5.1”項(xiàng)下方法處理，用于血清代謝組學(xué)樣品測(cè)定系統(tǒng)穩(wěn)定性的考察。

2.5.3 色譜及質(zhì)譜條件

（1）色譜條件：Poroshell 120 SB-Aq預(yù)柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），Poroshell 120 SB-Aq預(yù)柱（5 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～5 min，2% B；5～7 min，2%～60% B；7～12 min，60%～100% B；12～15 min，100% B；15～17 min，100%～2% B；17～20 min，2% B；柱溫35 ℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。

（2）質(zhì)譜條件：采用ESI電噴霧離子源，掃描模式Full Mass，分辨率為50 000；掃描模式Dependent-MS2，分辨率為60 000，碰撞能量為25%，掃描范圍均為/50～1 000。正離子模式：鞘氣體積流量40 arb；輔助氣體積流量10 arb；離子噴射電壓4.2 kV；離子傳輸管溫度300 ℃；毛細(xì)管電壓23 V；管鏡電壓90 V。負(fù)離子模式：鞘氣體積流量40 arb；輔助氣體積流量10 arb；離子噴射電壓3.5 kV；離子傳輸管溫度300 ℃；毛細(xì)管電壓?35 V；管鏡電壓?78.2 V。

2.5.4 系統(tǒng)穩(wěn)定性考察 系統(tǒng)穩(wěn)定性采用質(zhì)控樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)。序列進(jìn)樣前先連續(xù)進(jìn)6針質(zhì)控樣本以平衡系統(tǒng)，然后每6針樣品運(yùn)行1針質(zhì)控樣本，考察系統(tǒng)穩(wěn)定性。

2.5.5 數(shù)據(jù)處理及分析 將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入MSDIAL軟件進(jìn)行預(yù)處理，包括峰識(shí)別、峰提取、保留時(shí)間對(duì)齊、缺失值填充、歸一化以及背景扣除等，得到質(zhì)荷比、保留時(shí)間、分組信息以及歸一化峰面積的數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 14.1進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。根據(jù)差異變量權(quán)重值（variable important in projection，VIP）大于1.0、組間變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＜0.8或＞1.2且＜0.05篩選差異性代謝物。根據(jù)HMDB、Mzcloud、PubChem、MassBank數(shù)據(jù)庫鑒定差異代謝物，比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比或者精確相對(duì)分子質(zhì)量，誤差限0.01，將鑒定得到的差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0在線網(wǎng)址（https://www. metaboanalyst.ca/）中進(jìn)行代謝通路富集分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)過程中觀察大鼠，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好、毛發(fā)正常、活動(dòng)自如、飲食飲水正常且體質(zhì)量持續(xù)增加；造模后模型組大鼠精神逐漸萎靡、毛發(fā)逐漸暗黃，失去光澤，活動(dòng)量減少，進(jìn)食飲水量明顯增加，尿量增加且體質(zhì)量下降。給藥干預(yù)后，大鼠上述狀態(tài)得到明顯改善。

3.2 山茱萸多糖對(duì)T2DM大鼠體質(zhì)量和血糖的影響

如圖1所示，造模后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量有下降趨勢(shì)，血糖顯著升高（＜0.01）；連續(xù)給藥4周后，與模型組比較，各給藥組大鼠體質(zhì)量升高，血糖有所下降，但均無顯著性差異。

3.3 山茱萸多糖對(duì)T2DM大鼠血脂和肝功能的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平及AST、ALT活性均顯著升高（＜0.01），HDL-C水平顯著降低（＜0.05），肝臟指數(shù)顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，各給藥組TC、TG水平和ALT活性均顯著降低（＜0.05、0.01）；二甲雙胍組和山茱萸多糖中、高劑量組LDL-C水平和肝臟指數(shù)均顯著降低（＜0.05、0.01）；山茱萸多糖低劑量組HDL-C水平顯著升高（＜0.05）；二甲雙胍組和山茱萸多糖低、高劑量組AST活性顯著降低（＜0.05、0.01）。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；NC-對(duì)照組；MOD-模型組；MET-二甲雙胍組；L-CFP-山茱萸低劑量組；M-CFP-山茱萸中劑量組；H-CFP-山茱萸高劑量組，下圖同。

表1 山茱萸多糖對(duì)T2DM大鼠血脂和肝功能的影響(, n = 6)

與對(duì)照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，表2同。

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as Table 2.

3.4 山茱萸多糖對(duì)T2DM大鼠炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α和MDA水平顯著升高（＜0.01），SOD活性顯著降低（＜0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組血清中IL-6、IL-1β、TNF-α和MDA水平顯著降低（＜0.05、0.01），SOD水平顯著升高（＜0.05）；山茱萸多糖低劑量組血清中IL-1β、TNF-α和MDA水平顯著降低（＜0.05）；山茱萸多糖中劑量組IL-1β水平顯著降低（＜0.01）；山茱萸多糖高劑量組IL-6、IL-1β和MDA水平顯著降低（＜0.05），SOD活性顯著升高（＜0.05）。

3.5 山茱萸多糖對(duì)T2DM大鼠肝臟組織病理變化的影響

如圖2所示，對(duì)照組大鼠肝小葉組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常，輪廓清晰，肝索呈放射狀分布。模型組大鼠肝小葉和肝索結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞內(nèi)存在大量脂滴空泡，可見炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組比較，二甲雙胍組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)有明顯改善，肝細(xì)胞排列趨向整齊；山茱萸多糖各劑量組大鼠肝組織上述病變情況均得到不同程度的改善。

3.6 大鼠血清代謝組學(xué)分析

3.6.1 代謝圖譜 采用UPLC-MS進(jìn)行血清樣品的分離和數(shù)據(jù)采集，各組樣品在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖3。各組樣品總離子流圖基本相似，但各組峰形及峰面積存在一定差異，表明大鼠體內(nèi)部分代謝物發(fā)生變化。

表2 山茱萸多糖對(duì)T2DM大鼠炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響(, n = 6)

圖2 山茱萸多糖對(duì)T2DM大鼠肝臟組織病理變化的影響(HE, ×20)

圖3 血清樣本在正(A)、負(fù)(B) 離子模式下的總離子流圖

3.6.2 多元統(tǒng)計(jì)分析 PCA是一種無監(jiān)督性的模型分析方法，它可以根據(jù)數(shù)據(jù)的相似性對(duì)其進(jìn)行歸類，能夠更真實(shí)地反映組間差異，識(shí)別組內(nèi)變異。各組大鼠的血清PCA圖見圖4。在正、負(fù)離子模式下，質(zhì)控樣本均聚集良好，說明系統(tǒng)穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。各組樣本在95%的置信區(qū)間內(nèi)均可以較好地聚為一類，且各組之間有明顯的離散。

為了更直觀反映各組間的差異，進(jìn)一步進(jìn)行有監(jiān)督模式的OPLS-DA。OPLS-DA得分圖（圖5）顯示，對(duì)照組和模型組呈現(xiàn)明顯分離趨勢(shì)，說明T2DM大鼠血清代謝輪廓發(fā)生了顯著變化；山茱萸多糖各給藥組遠(yuǎn)離模型組，逐漸向?qū)φ战M趨近，說明山茱萸多糖給藥組干預(yù)的T2DM大鼠血清代謝物有向正常水平恢復(fù)的趨勢(shì)，表明山茱萸多糖對(duì)T2DM大鼠機(jī)體代謝有一定的正向調(diào)控作用。OPLS-DA模型中，2和2用于表示數(shù)據(jù)對(duì)模型的解釋能力，正離子模式下2＝0.487，2＝0.721，2＝0.592；負(fù)離子模式下2＝0.551，2＝0.869，2＝0.544，均說明模型有良好的預(yù)測(cè)能力。對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)，所有的2值均低于右側(cè)原點(diǎn)，且2的回歸線在縱坐標(biāo)上的截距小于0，可認(rèn)為模型沒有出現(xiàn)過擬合。

QC-質(zhì)控樣本。

A、B-正離子模式；C、D-負(fù)離子模式。

3.6.3 差異代謝物的篩選和鑒定 基于OPLS-DA模型，以VIP＞1.0、FC＜0.8或＞1.2且＜0.05為條件篩選差異代謝物，并繪制火山圖，見圖6。通過檢索HMDB等數(shù)據(jù)庫結(jié)合二級(jí)碎片離子信息對(duì)差異代謝物進(jìn)行鑒定。最終得到血清中有35個(gè)與T2DM風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的生物標(biāo)志物，其中正離子模式下有18個(gè)，負(fù)離子模式下有17個(gè)，結(jié)果見表3。對(duì)比山茱萸多糖給藥組與模型組中生物標(biāo)志物的含量，發(fā)現(xiàn)山茱萸低劑量組可顯著回調(diào)17種，與模型組有26個(gè)共同代謝物；山茱萸中劑量組可顯著回調(diào)14種，與模型組有28個(gè)共同代謝物；山茱萸高劑量組可顯著回調(diào)17種，與模型組有29個(gè)共同代謝物。為了更直觀地比較生物標(biāo)志物在各組的含量變化，將樣品含量轉(zhuǎn)化成可視化的熱圖見圖7。水平軸和垂直軸分別代表樣本與生物標(biāo)志物，顏色深淺反映變量值，紅色表示物質(zhì)相對(duì)含量上調(diào)，藍(lán)色表示物質(zhì)相對(duì)含量下調(diào)。

3.6.4 代謝通路分析 將T2DM大鼠血清生物標(biāo)志物，以及山茱萸多糖各給藥組可回調(diào)的生物標(biāo)志物，分別導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0網(wǎng)站進(jìn)行相關(guān)的代謝通路分析。選取Impact＞0.1的代謝通路進(jìn)行分析，見圖8，T2DM大鼠血清中苯丙氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、?；撬岷痛闻；撬岽x、醚脂質(zhì)代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、丙酮酸代謝、色氨酸代謝和糖酵解/糖異生等23條代謝通路發(fā)生紊亂，山茱萸多糖能改善其中22條代謝通路。

A～D-正離子模式；E～H-負(fù)離子模式。

表3 T2DM大鼠血清生物標(biāo)志物

↑表示上調(diào)，↓表示下調(diào)；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01；L-CFP-山茱萸低劑量組；M-CFP-山茱萸中劑量組；H-CFP-山茱萸高劑量組。

↑ means up-regulated, ↓ means down-regulated;*< 0.05**< 0.01model group; L-CFP-polysaccharides low-dose group; M-CFP-polysaccharides medium-dose group; H-CFP-polysaccharides high-dose group.

4 討論

高血糖、血脂異常和慢性低度炎癥反應(yīng)是T2DM進(jìn)展的重要因素[8]。糖尿病患者在臨床上初期表現(xiàn)為“三多一少”，后期會(huì)逐步發(fā)展成為血脂紊亂；糖脂代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致大量脂質(zhì)堆積在肝臟，從而使肝臟細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，引起肝臟損傷；同時(shí)，炎癥反應(yīng)可以通過各種轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的分子途徑、氧化應(yīng)激反應(yīng)等激活各種促炎癥介質(zhì)，這些介質(zhì)通過血液或旁分泌作用干擾胰島素信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)胰島素抵抗，導(dǎo)致糖尿病及脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)生[9-10]。而肝臟受損和胰島素抵抗可進(jìn)一步加重糖脂代謝紊亂，當(dāng)糖脂升高，胰島素分泌不足時(shí)，又可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，加速糖尿病的發(fā)展惡化，二者相互影響，導(dǎo)致惡性循環(huán)[11]，因此改善糖脂代謝紊亂對(duì)于治療T2DM有重要意義。本研究結(jié)果顯示，給藥前T2DM大鼠進(jìn)食飲水量和尿量明顯增多，體質(zhì)量下降，血糖升高。給予藥物干預(yù)后，上述癥狀均有不同程度的改善；同時(shí)檢測(cè)大鼠血清中相關(guān)生化指標(biāo)，結(jié)果顯示山茱萸多糖能顯著降低TC、TG、LDL-C、AST、ALT、IL-6、IL-1β、TNF-α和MDA水平，升高HDL-C水平，提高SOD活性；通過觀察肝臟病理切片，發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠存在肝損傷情況，給藥干預(yù)后，大鼠肝臟的病理形態(tài)有所改善。表明山茱萸多糖可以通過降低T2DM大鼠的血糖血脂水平和體內(nèi)炎癥反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及改善肝損傷情況，進(jìn)而調(diào)控大鼠體內(nèi)糖脂代謝紊亂，減輕胰島素抵抗來發(fā)揮降糖作用。

圖7 各組大鼠血清生物標(biāo)志物聚類分析熱圖

A-與T2DM相關(guān)通路；B-山茱萸多糖干預(yù)的通路。

為進(jìn)一步探究山茱萸多糖治療T2DM的作用機(jī)制，本研究采用非靶向代謝組學(xué)方法，用UHPLC-MS技術(shù)檢測(cè)對(duì)照組、模型組、二甲雙胍組和山茱萸多糖低、中、高劑量組大鼠血清內(nèi)源性代謝物的變化。與對(duì)照組比較，模型組大鼠體內(nèi)-苯丙氨酸、-色氨酸、牛磺酸、馬尿酸、溶血磷脂酰膽堿（-18∶0/0∶0）、丙酮酸、抗壞血酸、-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯等35個(gè)代謝物發(fā)生顯著性改變；給予山茱萸多糖干預(yù)后，其代謝產(chǎn)物有明顯回調(diào)趨勢(shì)，主要涉及到氨基酸代謝、糖代謝、脂質(zhì)代謝等代謝途徑。

氨基酸是T2DM的潛在生物標(biāo)志物，T2DM的發(fā)生與血漿芳香氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）水平呈正相關(guān)，胰島素抵抗可導(dǎo)致體內(nèi)芳香氨基酸水平升高[12-13]。苯丙氨酸和色氨酸均是人體必需氨基酸，苯丙氨酸的代謝特征可預(yù)測(cè)糖尿病的發(fā)展，高濃度的苯丙氨酸會(huì)破壞胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，抑制葡萄糖攝取，降低糖尿病患者的胰島素敏感性[14]。色氨酸作為抗自由基活性最強(qiáng)的氨基酸[15]，是犬尿氨酸途徑的來源，犬尿氨酸通路參與免疫激活和炎癥調(diào)節(jié)，與肥胖和胰島素抵抗有關(guān)。此外，色氨酸還被腸道菌群分解代謝，產(chǎn)生多種吲哚衍生物[16]。研究發(fā)現(xiàn)色氨酸代謝物能抑制胰島素原合成及胰島素的釋放，降低T2DM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[17]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T2DM大鼠血清的-苯丙氨酸和-色氨酸水平顯著升高，色氨酸的吲哚代謝物3-吲哚丙酸含量降低；給予山茱萸多糖干預(yù)后，代謝物均有回調(diào)趨勢(shì)，表明山茱萸多糖可能通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝發(fā)揮抗T2DM作用。

脂質(zhì)代謝異常通常表現(xiàn)為與高血脂相關(guān)的脂質(zhì)異常升高。溶血磷脂酰膽堿（-18∶0/0∶0）是甘油磷脂的代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)中間產(chǎn)物與糖尿病并發(fā)的炎癥、氧化應(yīng)激等密切相關(guān)[18]。?；撬崾且环N條件必需氨基酸，不參與蛋白質(zhì)合成，大量研究表明?；撬峥梢詮目寡趸?、抗炎、保護(hù)胰島β細(xì)胞、促進(jìn)胰島素分泌、改善胰島素抵抗等多方面發(fā)揮降血糖作[19]。佟季航[20]發(fā)現(xiàn)?；撬崮軌蚋纳品逝諸2DM大鼠糖脂代謝，減輕肝臟的脂肪變性，緩解大鼠肝臟的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。曹志龍等[21]發(fā)現(xiàn)?；撬峥赡芡ㄟ^降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、提升抗氧化酶的活性，從而減輕氧化應(yīng)激損傷和胰島素抵抗。本研究結(jié)果顯示，T2DM大鼠血清中溶血磷脂酰膽堿（-18∶0/0∶0）水平顯著升高，?；撬岷匡@著降低；山茱萸多糖干預(yù)后，代謝物水平均有回調(diào)趨勢(shì)，且大鼠血清中LDL-C顯著回調(diào)，肝組織切片結(jié)果顯示脂肪浸潤得到了明顯改善，說明山茱萸多糖對(duì)T2DM的脂質(zhì)代謝紊亂具有調(diào)節(jié)作用。

丙酮酸是糖酵解的最終產(chǎn)物，可以通過線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（mitochondrial pyruvate carrier，MPC）進(jìn)入線粒體，是線粒體氧化代謝的燃料。MPC介導(dǎo)的丙酮酸代謝在T2DM的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。Zhu等[22]發(fā)現(xiàn)在新冠病毒感染肥胖小鼠模型中，MPC抑制劑可降低血糖血脂水平、減輕肺組織炎癥反應(yīng)。抗壞血酸主要在肝細(xì)胞中合成，它能夠通過戊糖磷酸途徑在不同細(xì)胞中到達(dá)糖酵解/糖異生途徑，是糖酵解/糖異生的底物。Shen等[23]發(fā)現(xiàn)Akkermansia能通過調(diào)節(jié)抗壞血酸和醛酸代謝途徑降低糖尿病腎病大鼠的血糖，減輕炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示山茱萸多糖能顯著降低T2DM大鼠血清中丙酮酸和抗壞血酸代謝物含量，說明山茱萸多糖能通過調(diào)節(jié)糖代謝改善T2DM。

代謝組學(xué)具有系統(tǒng)性、動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn)，與中藥的“整體觀”“辯證觀”相吻合，被廣泛應(yīng)用于中藥的作用機(jī)制研究[24]。本研究首次利用UHPLC-MS的非靶向代謝組學(xué)方法對(duì)山茱萸多糖治療T2DM大鼠的作用機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明山茱萸多糖可能通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝、糖代謝、脂質(zhì)代謝等代謝途徑，從而改善糖脂代謝紊亂及肝損傷情況，達(dá)到治療T2DM的作用，為后續(xù)山茱萸多糖的臨床開發(fā)與應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

本研究雖然已篩選出與T2DM相關(guān)的生物標(biāo)志物及代謝通路，但T2DM病因復(fù)雜，僅采用非靶向血清代謝組學(xué)得出的結(jié)果缺乏特征性和專屬性，難以全面闡釋山茱萸多糖抗T2DM的作用機(jī)制，在后續(xù)的研究過程中，可以利用靶向代謝組學(xué)及腸道菌群深入探究山茱萸多糖干預(yù)T2DM的確切機(jī)制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of intervention of Corni Fructus polysaccharides in type 2 diabetes mellitus rats based on serum metabolomics

CUI Yongxia1, SHANG Zihui1, HOU Yadi1, WANG Lili1, SUN Xiaoya1, WU Mingxia1, CHEN Suiqing1, 2

1. College of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Collaborative Innovation Center of Research and Development on the Whole Industry Chain of Yu-Yao, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

To explore the mechanism of intervention of Shanzhuyu () polysaccharides in type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats based on metabolomics.A total of 10 male SD rats were selected as the control group, while the remaining rats were induced to construct a T2DM model using a high sugar and high-fat diet combined with streptozocin (STZ). The successfully modeled rats were randomly divided into model group, metformin (200 mg/kg) group, andpolysaccharides low-, medium-, and high-dose (75, 150, 300 mg/kg) groups, rats in each group were given drugs in the morning for four consecutive weeks. Before the last administration, the rats were fasted for 10 h. After anesthesia, blood was collected from the abdominal aorta and serum was separated, while liver tissue was taken. Kit was used to detect levels of total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), interleukin-1β (IL-1β), IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α), malondialdehyde (MDA) and activities of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), superoxide dismutase (SOD). Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of liver tissue. Ultra-high performance liquid chromatography linear ion trap orbital trap tandem mass spectrometry (UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS) technology was used to detect the level of endogenous metabolites in serum of rats, and principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis were used to screen and identify differential metabolites. MetaboAnalyst platform was used for metabolic pathway analysis.Compared with model group, the body weight and blood glucose levels of rats inpolysaccharides administration group were reduced, and the liver injury was significantly improved. The levels of TC, TG, LDL-C, IL-6, IL-1β, TNF-α, MDA and activities of AST, ALT in serum were decreased (< 0.05, 0.01), HDL-C level and SOD activity were increased (< 0.05). A total of 35 potential biomarkers related to T2DM were screened by serum metabolomics, and 29 biomarkers were regulated inpolysaccharides administration group, which mainly involved 22 metabolic pathways including phenylalanine metabolism and biosynthesis, taurine and hypotaurine metabolism, ether lipid metabolism and pyruvate metabolism.polysaccharides can effectively improve the glucose and lipid metabolism disorders caused by T2DM, alleviate liver damage, and achieve the effect of treating T2DM, which may be related to the regulation of amino acid metabolism, glucose metabolism, lipid metabolism and other metabolic pathways.

polysaccharides; type 2 diabetes mellitus; UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS; metabolomics; amino acid metabolism; glucose metabolism; lipid metabolism

R285.5

A

0253 - 2670(2024)09 - 2976 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.012

2023-12-22

河南省重大科技專項(xiàng)（221100310400）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（242102310524）；鄭州市科技協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目（2023XTCX053）；河南中醫(yī)藥大學(xué)博士科研基金項(xiàng)目（BSJJ2022-04）

崔永霞，副教授，從事中藥質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: 1020076356@qq.com

通信作者：吳明俠，副教授，從事中藥質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: mxwu711@163.com

陳隨清，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥品種整理與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。E-mail: suiqingchen0371@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]