基于谷胱甘肽/谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4軸探討雷公藤甲素引起肝細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制

王偉艷，劉 珊，李會(huì)芳，常銀霞，欒智華，蘇越蕊，魏硯明*

?藥理與臨床?

基于谷胱甘肽/谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4軸探討雷公藤甲素引起肝細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制

王偉艷1，劉 珊1，李會(huì)芳1，常銀霞1，欒智華2，蘇越蕊1，魏硯明1*

1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619 2. 山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理中心，山西 晉中 030619

觀察雷公藤甲素對(duì)鐵代謝和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響，探討雷公藤甲素引起肝細(xì)胞鐵死亡的可能機(jī)制。利用雷公藤甲素處理人正常肝細(xì)胞HL7702和C57BL/6J小鼠，或利用鐵死亡抑制劑（ferrostatin-1，F(xiàn)er-1）和雷公藤甲素共同處理HL7702細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率；普魯士藍(lán)染色觀察鐵沉積；試劑盒檢測(cè)鐵離子、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性；qRT-PCR或Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）的表達(dá)。雷公藤甲素顯著降低細(xì)胞存活率（＜0.05），引起鐵沉積，升高血清中ALT、AST活性（＜0.05），增加HL7702細(xì)胞和小鼠肝組織中鐵離子、MDA含量（＜0.05），降低GSH含量、SOD活性和GPX4表達(dá)（＜0.05），上調(diào)TFR1、PTGS2及ACSL4表達(dá)（＜0.05）。Fer-1顯著上調(diào)細(xì)胞存活率和GPX4表達(dá)量（＜0.05），顯著下調(diào)鐵離子含量、TFR1、PTGS2及ACSL4表達(dá)（＜0.05）。雷公藤甲素可能通過(guò)GSH/GPX4軸引起鐵代謝異常和脂質(zhì)過(guò)氧化，誘導(dǎo)肝細(xì)胞鐵死亡。

雷公藤甲素；鐵死亡；肝細(xì)胞毒性；鐵超載；脂質(zhì)過(guò)氧化；谷胱甘肽/谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4軸

雷公藤作為傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)通絡(luò)、舒筋活血、消腫止痛、殺蟲(chóng)止血等作用，臨床上對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及自身免疫性肝炎等疾病具有獨(dú)特療效，然而其嚴(yán)重的肝臟毒性制約了臨床應(yīng)用[1]。作為一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物，雷公藤甲素是雷公藤的主要藥理活性成分之一，亦是引起肝臟毒性反應(yīng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。雷公藤甲素可導(dǎo)致斑馬魚(yú)、小鼠及大鼠肝細(xì)胞水樣變性、核萎縮，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)灶狀壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高、膽汁淤積等癥狀[3]。體外條件下，雷公藤甲素可降低肝巨噬細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞活力，引起肝細(xì)胞死亡[4-5]。研究表明，雷公藤甲素導(dǎo)致肝損傷主要涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞色素P450超家族代謝異常、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、免疫穩(wěn)態(tài)失衡、腸道菌群失調(diào)等多種機(jī)制[6]。

鐵死亡是一種新型調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，其特征是鐵依賴性的脂質(zhì)過(guò)氧化引發(fā)的細(xì)胞膜氧化損傷，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜外膜起泡破裂、線粒體膜密度增加、嵴密度減少或消失等[7]。鐵死亡參與了多種疾病的病理發(fā)生過(guò)程，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、急性腎衰竭、心臟缺血再灌注等[8]。多種藥物引起的肝毒性也與其干擾鐵離子代謝過(guò)程導(dǎo)致鐵死亡密切相關(guān)。解熱鎮(zhèn)痛藥對(duì)乙酰氨基酚可減低體外培養(yǎng)原代小鼠肝細(xì)胞中抗氧化物谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，抑制谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）表達(dá)，而鐵死亡抑制劑（ferrostatin-1，F(xiàn)er-1）則能夠明顯降低對(duì)乙酰氨基酚的肝細(xì)胞毒性作用，提高細(xì)胞存活率[9]；體內(nèi)條件下，F(xiàn)er-1可改善小鼠肝組織中鐵代謝紊亂，抑制鐵死亡相關(guān)基因長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，）和前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，）的高表達(dá)，減輕對(duì)乙酰氨基酚引起的小鼠肝組織損傷[10]。川楝素在激活蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）-真核起始因子2α亞基（eukaryotic initiation factor 2α subunit，eIF2α）-激活轉(zhuǎn)錄因子4（activation transcription factor 4，ATF4）信號(hào)通路，引起ATF3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，可明顯抑制鐵輸出蛋白溶質(zhì)載體家族40成員1（solute carrier family 40 member 1，SLC40A1）的表達(dá)，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)鐵超載，并通過(guò)下調(diào)GPX4的表達(dá)，引起肝細(xì)胞鐵死亡[11]。雷公藤甲素可呈劑量相關(guān)性地引起鐵離子聚集，導(dǎo)致大鼠肝組織損傷，表明鐵死亡可能是雷公藤甲素導(dǎo)致肝損傷的關(guān)鍵機(jī)制[12]。然而，目前對(duì)于雷公藤甲素調(diào)節(jié)肝細(xì)胞鐵死亡的作用途徑及鐵死亡在雷公藤甲素肝毒性中的功能仍有待闡明。

本研究擬在體外和體內(nèi)條件下觀察雷公藤甲素對(duì)肝細(xì)胞鐵代謝和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響，探討雷公藤甲素對(duì)鐵死亡的調(diào)控途徑，以期為揭示雷公藤甲素肝毒性的作用機(jī)制，尋找抑制雷公藤甲素肝毒性的作用靶點(diǎn)提供線索。

1 材料

1.1 細(xì)胞及動(dòng)物

人源正常肝細(xì)胞HL7702購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量16～18 g，6周齡，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。小鼠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度55%～65%，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2021DW207）。

1.2 藥品與試劑

雷公藤甲素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)230903）購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；鐵死亡抑制劑Fer-1（批號(hào)149105）購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；RPMI 1640完全培養(yǎng)基（批號(hào)2305002）、PBS稀釋液（批號(hào)20230517JH）、胰酶（批號(hào)2305002）、普魯士藍(lán)染色試劑盒（批號(hào)20220316）、BCA蛋白濃度試劑盒（批號(hào)2307001）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)MA0218-2-Mar-29H）、飛克特超敏ECL發(fā)光液（批號(hào)MA0186-Apr-041）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；鐵離子含量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20220321）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20231020）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)20231018）、GSH檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20231016）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C009-2-1）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號(hào)C010-2-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；胎牛血清（批號(hào)J825FC0251）、Trizol試劑（批號(hào)G921KA7072）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)J804AA0007）購(gòu)自上海生工生物工程公司；MonScriptTM RTIII AII-in-One Mix試劑盒（批號(hào)140713）、MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix試劑盒（批號(hào)00007547-110721）均購(gòu)自莫納生物科技有限公司；GPX4抗體（批號(hào)10026631）、ACSL4抗體（批號(hào)00108861）、PTGS2抗體（批號(hào)00104008）均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；TFR1抗體（AF8136）、蛋白酶抑制劑（批號(hào)CR2303056）、RIPA蛋白裂解液（批號(hào)011921210824）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（批號(hào)090523231228）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體（批號(hào)AC220227004）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器

Galaxy 170s型CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Eppendorf公司）；Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；QuickDrop微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Molecular Devices公司）；Powercycler 普通PCR儀（英國(guó)Analylik Jena公司）；Archimed X4型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（北京鯤鵬基因科技有限責(zé)任公司）；ImageQuant LAS 500型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）；Allegra X-30R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40DN型轉(zhuǎn)印槽、DYY-7C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HL7702細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組和處理

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL7702細(xì)胞，以1.5×105個(gè)/孔接種于96孔板或以3×106個(gè)/mL接種于6孔板中，加入25、50、100 nmol/L的雷公藤甲素，處理細(xì)胞24 h，或者加入50 nmol/L雷公藤甲素處理12、24、48 h，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入不含藥物的培養(yǎng)基），采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，利用鐵離子含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定鐵離子含量，普魯士藍(lán)染色觀察鐵沉積情況，qRT-PCR檢測(cè)、和mRNA表達(dá)，Western blotting檢測(cè)TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表達(dá)，試劑盒檢測(cè)GSH、MDA含量和SOD活性。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL7702細(xì)胞，以1.5×105個(gè)/孔接種于96孔板或以3×106個(gè)/mL接種于6孔板中，設(shè)置對(duì)照組（加入不含藥物的培養(yǎng)基）、雷公藤甲素組、Fer-1組、雷公藤甲素＋Fer-1組，用Fer-1（2 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞24 h后，再用50 nmol/L的雷公藤甲素處理細(xì)胞24 h。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，利用鐵離子含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定鐵離子含量，Western blotting檢測(cè)TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表達(dá)。

2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

為了觀察雷公藤甲素不同濃度和不同處理時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響，按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各孔吸光度（）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(給藥－空白)/(對(duì)照－空白)

2.4 普魯士藍(lán)染色觀察鐵沉積情況

按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用Perls染色液染色30 min，充分沖洗，再用伊紅染色液染色15 s，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察鐵沉積。參照文獻(xiàn)方法[13]用Image J軟件分析普魯士藍(lán)染色藍(lán)色區(qū)域面積占總面積的百分比。

2.5 鐵離子、GSH、MDA含量及SOD活性測(cè)定

按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定鐵離子、GSH、MDA含量和SOD活性。

2.6 qRT-PCR檢測(cè)TFR1、PTGS2和ACSL4 mRNA表達(dá)

按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.7 Western blotting檢測(cè)TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表達(dá)。

按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，經(jīng)PBS漂洗后，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解15 min后，23號(hào)針頭反復(fù)吹打破碎細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將上清液與SDS上樣緩沖液混勻，95 ℃加熱5 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST，室溫封閉1 h，按照1∶1 000的稀釋比例分別加入TFR1、GPX4、PTGS2、ACSL4及β-actin一抗，4 ℃孵育過(guò)夜后，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下進(jìn)行曝光，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件定量目的條帶。

2.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組、給藥及指標(biāo)檢測(cè)

C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和雷公藤甲素（0.8 mg/kg）[2,14]組，每組10只，雷公藤甲素組ip雷公藤甲素，對(duì)照組ip等體積的生理鹽水，每隔2天注射1次，連續(xù)注射3次，末次給藥24 h后，眼眶取血，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中ALT、AST、SOD活性和鐵離子、GSH、MDA含量。取相同部位的肝臟，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片經(jīng)脫蠟、蘇木素-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)變化。qRT-PCR檢測(cè)肝組織、和mRNA表達(dá)，Western blotting檢測(cè)肝組織TFR1、GPX4、PTGS2和ACSL4蛋白表達(dá)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 雷公藤甲素抑制HL7702細(xì)胞存活率

HL7702細(xì)胞經(jīng)25、50、100 nmol/L的雷公藤甲素處理24 h后，隨著給藥濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸下降（＜0.05，圖1-A）。HL7702細(xì)胞經(jīng)50 nmol/L雷公藤甲素處理12、24、48 h后，細(xì)胞存活率隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低（＜0.05，圖1-B）。

3.2 雷公藤甲素引起HL7702細(xì)胞鐵超載

鐵代謝紊亂是鐵死亡發(fā)生的必要條件[15]。TFR1作為鐵代謝過(guò)程中關(guān)鍵的細(xì)胞表面受體，通過(guò)內(nèi)吞作用負(fù)責(zé)鐵離子的攝取[16]。HL7702細(xì)胞經(jīng)不同濃度雷公藤甲素處理24 h后，隨著給藥濃度升高，細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量逐漸增加（＜0.05，圖2-A），并且對(duì)照組未觀察到明顯的鐵沉積，而雷公藤甲素可使鐵沉積面積明顯增加（圖2-B）。此外，qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著雷公藤甲素給藥濃度升高，mRNA和蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加（＜0.05，圖2-C、D）。

與對(duì)照組或0 h比較：*P＜0.05，圖2～4、6同。

圖2 雷公藤甲素對(duì)HL7702細(xì)胞中鐵離子含量(A)、鐵沉積(B，×200) 和TFR1表達(dá)(C、D) 的影響(, n = 3)

3.3 雷公藤甲素引起HL7702細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化損傷

脂質(zhì)過(guò)氧化損傷作為鐵死亡的主要特征之一，是鐵死亡檢測(cè)的重要指標(biāo)。GSH和SOD是體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化劑，MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的副產(chǎn)物，可以間接反映過(guò)氧化損傷程度[8]。HL7702細(xì)胞經(jīng)不同濃度雷公藤甲素處理24 h后，雷公藤甲素可顯著降低GSH的含量，抑制SOD活性，提高M(jìn)DA含量，且呈現(xiàn)濃度相關(guān)性（＜0.05，圖3）。

3.4 雷公藤甲素對(duì)HL7702細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

GPX4是構(gòu)成應(yīng)對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵抗氧化酶[8]；PTGS2和ACSL4被認(rèn)為是鐵死亡的生物標(biāo)志物。PTGS2負(fù)責(zé)將花生四烯酸代謝為前列腺素，細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)PTGS2表達(dá)明顯上調(diào)[17]。ACSL4是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，可激活花生四烯酸和腎上腺素等多不飽和脂肪酸生成酰基輔酶A，后者進(jìn)入質(zhì)膜磷脂中促使細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[18]。HL7702細(xì)胞經(jīng)不同濃度雷公藤甲素處理24 h后，雷公藤甲素可顯著抑制GPX4的表達(dá)（＜0.05，圖4-A），促進(jìn)PTGS2和ACSL4表達(dá)（＜0.05，圖4-B、C）。

圖3 雷公藤甲素對(duì)HL7702細(xì)胞GSH、MDA含量和SOD活性的影響(, n = 3)

3.5 Fer-1逆轉(zhuǎn)雷公藤甲素引起的HL7702細(xì)胞鐵死亡

為了觀察Fer-1對(duì)雷公藤甲素肝細(xì)胞毒性的影響，采用雷公藤甲素與Fer-1共同處理HL7702細(xì)胞。結(jié)果顯示，與雷公藤甲素組比較，F(xiàn)er-1與雷公藤甲素聯(lián)合處理組細(xì)胞存活率和GPX4表達(dá)量顯著升高（＜0.05，圖5-A、C），鐵離子含量、TFR1、PTGS2及ACSL4蛋白表達(dá)量顯著降低（＜0.05，圖5-B、C）。

圖4 雷公藤甲素對(duì)HL7702細(xì)胞中GPX4(A)、PTGS2和ACSL4(B、C) 表達(dá)的影響(, n = 3)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與雷公藤甲素組比較：#P＜0.05。

3.6 雷公藤甲素引起小鼠肝組織鐵死亡

課題組前期研究與本研究結(jié)果均表明，小鼠ip雷公藤甲素后，肝組織結(jié)構(gòu)受損明顯，細(xì)胞腫脹、壞死，局部可見(jiàn)炎癥浸潤(rùn)，血清ALT、AST活性明顯升高[2,14]（＜0.05，圖6-A、B）。體內(nèi)觀察雷公藤甲素對(duì)肝細(xì)胞鐵死亡的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，雷公藤甲素組GSH含量、SOD活性和GPX4表達(dá)量顯著降低（＜0.05，圖6-C、F），鐵離子、MDA含量及TFR1、PTGS2、ACSL4表達(dá)量顯著升高（＜0.05，圖6-C～F）。

圖6 雷公藤甲素對(duì)小鼠肝功能(A)、肝組織病理形態(tài)(B，×200)、氧化損傷指標(biāo)(C)、鐵離子含量(D) 及鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)(E、F) 的影響(, n = 3)

4 討論

本研究中，雷公藤甲素在降低肝細(xì)胞活性的同時(shí)，能夠明顯提高正常肝細(xì)胞和小鼠肝組織中的鐵離子含量，引起鐵代謝紊亂，導(dǎo)致鐵超載，這可能與雷公藤甲素能夠增加TFR1表達(dá)有關(guān)。TFR1的過(guò)量表達(dá)可促進(jìn)鐵離子向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，大量的鐵離子則通過(guò)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基和氫過(guò)氧自由基等大量活性氧，驅(qū)動(dòng)破壞性的過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[16]。本研究還觀察到雷公藤甲素可明顯降低肝細(xì)胞中GSH含量，抑制SOD活性，下調(diào)GPX4表達(dá)量，提高脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量，促進(jìn)肝細(xì)胞鐵死亡，導(dǎo)致鐵死亡標(biāo)記物ACSL4、PTGS2的表達(dá)明顯升高。GPX4是一種清除脂質(zhì)過(guò)氧化物的關(guān)鍵酶，在GSH存在的條件下，將其轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽并將有毒的脂質(zhì)過(guò)氧化物還原為無(wú)毒的脂質(zhì)醇以防止鐵死亡的發(fā)生[19]。GPX4失活或表達(dá)量下調(diào)可誘導(dǎo)鐵死亡，常作為鐵死亡的參考標(biāo)記物[20]。Fer-1作為人工合成的自由基捕獲劑，可有效清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，阻斷鐵死亡[21]。體外條件下，F(xiàn)er-1處理可以逆轉(zhuǎn)雷公藤甲素引起的鐵超載，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化，明顯緩解雷公藤甲素引起的肝細(xì)胞鐵死亡和細(xì)胞毒性。因此，雷公藤甲素可能通過(guò)GSH/GPX4軸干預(yù)鐵代謝和脂質(zhì)過(guò)氧化，引起肝細(xì)胞鐵死亡，導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。Fer-1則通過(guò)下調(diào)TFR1和上調(diào)GPX4表達(dá)抑制鐵死亡。然而，本研究?jī)H在體外條件下觀察了Fer-1對(duì)雷公藤甲素肝細(xì)胞毒性的改善作用，今后將嘗試?yán)枚喾N動(dòng)物模型和包括Fer-1在內(nèi)的不同類型鐵死亡調(diào)節(jié)劑，如RSL3、索拉非尼、Liproxstatin-1、去鐵胺等[22]，進(jìn)一步驗(yàn)證鐵死亡對(duì)雷公藤甲素肝毒性的調(diào)控效應(yīng)和作用途徑。

鐵死亡存在高度復(fù)雜和精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，多種信號(hào)通路直接或間接影響鐵代謝或脂質(zhì)過(guò)氧化影響鐵死亡過(guò)程，參與雷公藤甲素藥理作用[6]。溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）作為多通道跨膜蛋白負(fù)責(zé)將細(xì)胞外的胱氨酸和細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸等比例輸入或輸出，輸入的胱氨酸隨即被還原成半胱氨酸，用于GSH的合成。雷公藤甲素一方面可通過(guò)干預(yù)心肌細(xì)胞鐵離子代謝，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵超載，并抑制抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧累積；另一方面，雷公藤甲素直接結(jié)合SLC7A11，導(dǎo)致GSH耗竭，從而抑制SLC7A11/GPX4信號(hào)軸，最終引起脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA水平升高，觸發(fā)心肌細(xì)胞鐵死亡[23]。雷公藤甲素可抑制體內(nèi)抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的表達(dá)，上調(diào)活性氧和脂質(zhì)過(guò)氧化水平，降低GPX4表達(dá)，從而促進(jìn)白血病細(xì)胞鐵死亡，克服對(duì)阿霉素的耐藥性[24]。另外，雷公藤甲素還可同時(shí)抑制Nrf2和SLC7A11表達(dá)，引起活性氧聚集和鐵離子超載，與鐵死亡促進(jìn)劑Erastin共用協(xié)同促進(jìn)頭頸部腫瘤細(xì)胞鐵死亡[25]。納米材料包裹的雷公藤甲素可通過(guò)抑制Nrf2表達(dá)，導(dǎo)致活性氧累積和GSH耗竭，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化，引起黑色素瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞鐵死亡[26-27]。后續(xù)工作將探討上述分子機(jī)制或信號(hào)通路是否在雷公藤甲素引起肝細(xì)胞鐵死亡過(guò)程中發(fā)揮作用。

全基因組芯片分析結(jié)果顯示，雷公藤甲素可明顯改變氧化應(yīng)激途徑中多種關(guān)鍵基因表達(dá)，表明氧化應(yīng)激與雷公藤甲素藥理作用密切相關(guān)[28]。除了肝毒性和心臟毒性外[23]，氧化應(yīng)激也是雷公藤甲素導(dǎo)致其他多種器官毒性的關(guān)鍵機(jī)制。雷公藤甲素能夠降低大鼠腎臟中抗氧化酶活性，引起體內(nèi)活性氧累積和脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量異常升高，誘發(fā)腎臟氧化應(yīng)激損傷[29]。雷公藤甲素可引起卵母細(xì)胞線粒體功能障礙，導(dǎo)致活性氧過(guò)度累積，降低抗氧化酶活性，影響卵母細(xì)胞發(fā)育[30]。雷公藤甲素還可通過(guò)破壞雄性生殖系統(tǒng)氧化還原平衡，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致睪丸組織損傷[31]。另外，雷公藤甲素能夠通過(guò)明顯降低食管癌細(xì)胞Nrf2的表達(dá)，抑制其進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件的結(jié)合，改變細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[32]。雷公藤甲素可升高鼻咽癌細(xì)胞中活性氧水平，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而抑制蛋白激酶B的表達(dá)與活化，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[33]。由于氧化應(yīng)激引起的脂質(zhì)過(guò)氧化是引起鐵死亡的關(guān)鍵機(jī)制，未來(lái)有必要觀察在上述病理生理?xiàng)l件下氧化應(yīng)激能否引起鐵死亡，以及鐵死亡是否在上述藥理作用中發(fā)揮相似作用。

綜上，本研究觀察了雷公藤甲素對(duì)正常肝細(xì)胞和小鼠肝組織中鐵死亡途徑相關(guān)指標(biāo)的影響，結(jié)果驗(yàn)證了雷公藤甲素可能通過(guò)GSH/GPX4軸引起鐵代謝異常和脂質(zhì)過(guò)氧化，誘導(dǎo)肝細(xì)胞鐵死亡，抑制鐵死亡則可在體外條件下有效緩解肝細(xì)胞毒性，為揭示雷公藤甲素肝毒性的作用機(jī)制及鐵死亡作為抑制雷公藤甲素肝毒性的潛在靶點(diǎn)提供了依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Zhang Y Q, Mao X, Li W J,.: An inspiring resource for rheumatoid arthritis treatment [J]., 2021, 41(3): 1337-1374.

[2] 張彩霞, 王偉艷, 李會(huì)芳, 等. MiR-20a通過(guò)ATG16L1影響細(xì)胞自噬并參與調(diào)節(jié)雷公藤甲素肝毒性 [J]. 中草藥, 2023, 54(13): 4214-4223.

[3] 周國(guó)梁, 宿樹(shù)蘭, 華永慶, 等. 雷公藤肝毒性機(jī)制及配伍減毒研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2023, 54(24): 8263-8272.

[4] Han C Y, Pei H Y, Sheng Y J,. Toxicological mechanism of triptolide-induced liver injury: Caspase3-GSDME-mediated pyroptosis of Kupffer cell [J]., 2023, 258: 114963.

[5] 林嘉偉, 楊依霏, 夏冰, 等. 基于雷公藤和雷公藤多苷片提取物肝毒性檢測(cè)的微流控肝器官芯片技術(shù)研究[J]. 中草藥, 2023, 54(24): 8105-8116.

[6] Hu Y Q, Wu Q G, Wang Y L,. The molecular pathogenesis of triptolide-induced hepatotoxicity [J]., 2022, 13: 979307.

[7] 陳晨, 程卓安, 王存, 等. 鐵死亡調(diào)控在肝臟疾病治療中的研究進(jìn)展 [J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2023, 43(3): 365-373.

[8] Jiang X J, Stockwell B R, Conrad M. Ferroptosis: Mechanisms, biology and role in disease [J]., 2021, 22(4): 266-282.

[9] L?rincz T, Jemnitz K, Kardon T,. Ferroptosis is involved in acetaminophen induced cell death [J]., 2015, 21(4): 1115-1121.

[10] 蔣慰贏, 秦明強(qiáng), 張程, 等. Ferrostatin-1保護(hù)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷 [J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 56(10): 1584-1589.

[11] Liang Y H, Chen S X, Han S Q,. Toosendanin induced hepatotoxicity via triggering PERK-eIF2α-ATF4 mediated ferroptosis [J]., 2023, 377: 51-61.

[12] 劉春彤. 鐵死亡在雷公藤甲素所致肝損傷中的作用 [D]. 石家莊: 河北醫(yī)科大學(xué), 2021.

[13] 韓志強(qiáng), 巴圖德力根, 薛蘭, 等. 蒙藥德都紅花-7味散對(duì)大鼠慢性肝損傷保護(hù)機(jī)制 [J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2022, 38(21): 2596-2599.

[14] 張彩霞, 杜晨暉, 周琨, 等. 抑制細(xì)胞自噬加劇雷公藤甲素所致小鼠肝毒性的研究 [J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2023, 39(8): 1122-1126.

[15] 王福俤. 鐵科學(xué) (Ferrology): 充滿魅力的新型交叉學(xué)科 [J]. 中國(guó)科學(xué): 生命科學(xué), 2023, 53(10): 1331-1344.

[16] Cheng Y F, Zak O, Aisen P,. Structure of the human transferrin receptor-transferrin complex [J]., 2004, 116(4): 565-576.

[17] Zhu L, Yang F G, Wang L W,. Identification the ferroptosis-related gene signature in patients with esophageal adenocarcinoma [J]., 2021, 21(1): 124.

[18] Shui S F, Zhao Z L, Wang H,. Non-enzymatic lipid peroxidation initiated by photodynamic therapy drives a distinct ferroptosis-like cell death pathway [J]., 2021, 45: 102056.

[19] 管文斌, 劉新光, 趙煒. 鐵死亡與衰老 [J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2024, 40(1): 28-37.

[20] Zhao T M, Yu Z H, Zhou L,. Regulating Nrf2-GPx4 axis by bicyclol can prevent ferroptosis in carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice [J]., 2022, 8(1): 380.

[21] Scarpellini C, Klejborowska G, Lanthier C,. Beyond ferrostatin-1: A comprehensive review of ferroptosis inhibitors [J]., 2023, 44(12): 902-916.

[22] 張海林, 陳勇, 巴永峰, 等. 鐵死亡調(diào)節(jié)劑及其在腦卒中中的作用研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2021, 26(11): 1320-1327.

[23] Liu X, Chen C, Han D,. SLC7A11/GPX4 inactivation-mediated ferroptosis contributes to the pathogenesis of triptolide-induced cardiotoxicity [J]., 2022, 2022: 3192607.

[24] Wu X, Chen S Q, Huang K C,. Triptolide promotes ferroptosis by suppressing Nrf2 to overcome leukemia cell resistance to doxorubicin [J]., 2023, 27(1): 17.

[25] Cai J, Yi M, Tan Y X,. Natural product triptolide induces GSDME-mediated pyroptosis in head and neck cancer through suppressing mitochondrial hexokinase-ΙΙ [J]., 2021, 40(1): 190.

[26] Fang K, Sun Y T, Yang J X,. A dual stimuli-responsive nanoplatform loaded PtIV-triptolide prodrug for achieving synergistic therapy toward breast cancer [J]., 2023, 12(28): e2301328.

[27] Wang S M, Guo Q Y, Xu R B,. Combination of ferroptosis and pyroptosis dual induction by triptolide nano-MOFs for immunotherapy of Melanoma [J]., 2023, 21(1): 383.

[28] Wang J Y, Jiang Z Z, Ji J Z,. Gene expression profiling and pathway analysis of hepatotoxicity induced by triptolide in Wistar rats [J]., 2013, 58: 495-505.

[29] Yang F, Ren L, Zhuo L,. Involvement of oxidative stress in the mechanism of triptolide-induced acute nephrotoxicity in rats [J]., 2012, 64(7/8): 905-911.

[30] Hao Q Q, Xu Z R, Nie H,. Triptolide exposure induces oxidative stress and decreases oocyte quality in mouse [J]., 2023, 221: 106964.

[31] Wang K, Hu H N, Cui W B,. Palliative effects of metformin on testicular damage induced by triptolide in male rats [J]., 2021, 222: 112536.

[32] 徐俊偉, 秦寧, 白宇, 等. 雷公藤甲素對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響 [J]. 中藥材, 2019, 42(1): 208-211.

[33] 王秀, 張競(jìng)競(jìng), 張配, 等. 雷公藤甲素誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡作用 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2014, 30(8): 1147-1150.

Mechanism of triptolide-induced ferroptosis in liver cells based on glutathione/ glutathione peroxidase 4 axis

WANG Weiyan1, LIU Shan1, LI Huifang1, CHANG Yinxia1, LUAN Zhihua2, SU Yuerui1, WEI Yanming1

1.College of Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China 2.Experimental Management Center, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China

To investigate the effect of triptolide on iron metabolism and lipid peroxidation and evaluate the underlying mechanism of triptolide-induced ferroptosis in hepatic cells.HL7702 cells and C57BL/6J mice were treated with triptolide, or HL7702 cells were co-treated with ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 (Fer-1) and triptolide, and then cell survival rate was detected by CCK-8 method; Iron deposition was detected by Prussian blue staining; Iron, glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA) contents and superoxide dismutase (SOD), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) activities were detected by kit; Transferrin receptor 1 (TFR1), glutathione peroxidase 4 (GPX4), prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), acyl-CoA synthetase long-chain family member 4 (ACSL4) expressions were detected by qRT-PCR or Western blotting.Triptolide significantly decreased cell viability (< 0.05), increased ALT and AST activities in serum (< 0.05), and resulted in iron deposition, increased iron, MDA contents (< 0.05), decreased GSH content, SOD activity and GPX4 expression (< 0.05), and up-regulated TFR1, PTGS2 and ACSL4 expressions in HL7702 cells and liver tissues (< 0.05). Fer-1 significantly reversed the decreased cell viability induced by triptolide, and increased GPX4 expression (< 0.05), as well as down-regulated iron content, TFR1, PTGS2 and ACSL4 expressions (< 0.05).Triptolide may induce iron overload and lipid peroxidation via GSH/GPX4 axis which ultimately leading to ferroptosis in hepatic cells.

triptolide; ferroptosis; hepatotoxicity; iron overload; lipid peroxidation; GSH/GPX4 axis

R285.5

A

0253 - 2670(2024)09 - 2967 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.011

2023-11-20

山西省科技廳基礎(chǔ)研究課題資助項(xiàng)目（202103021224295）；山西中醫(yī)藥大學(xué)毒效關(guān)系研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2022TD1016）；山西省衛(wèi)生健康委科研課題（2022133）；山西中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新能力培養(yǎng)計(jì)劃“基礎(chǔ)研究專項(xiàng)”課題資助項(xiàng)目（2020PY-JC-17）

王偉艷，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幣R床藥學(xué)與藥事管理。E-mail: 1686880829@qq.com

通信作者：魏硯明，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥藥理與毒理研究。Tel: (0351)3179717 E-mail: weiyanming2005@aliyun.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]