附子理中丸大蜜丸、水蜜丸和濃縮丸3種劑型的化學(xué)特征關(guān)鍵質(zhì)量屬性辨識(shí)研究

楊莎莎，林 夏，郝怡雯，周 航，張 月，高子希，謝福玉，張 星，傅超美，張 臻

附子理中丸大蜜丸、水蜜丸和濃縮丸3種劑型的化學(xué)特征關(guān)鍵質(zhì)量屬性辨識(shí)研究

楊莎莎，林 夏#，郝怡雯，周 航，張 月，高子希，謝福玉，張 星，傅超美*，張 臻*

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

建立附子理中丸（Fuzi Lizhong Pills，F(xiàn)LP）處方的大蜜丸（Dami Pills，F(xiàn)LP-D）、水蜜丸（Shuimi Pills，F(xiàn)LP-S）及濃縮丸（Nongsuo Pills，F(xiàn)LP-N）的HPLC指紋圖譜，同時(shí)測(cè)定7種藥效成分含量，尋找FLP處方與劑型關(guān)聯(lián)的化學(xué)特征關(guān)鍵質(zhì)量屬性。采用分層抽樣法結(jié)合研究實(shí)際，隨機(jī)抽取市售FLP-D 30批，F(xiàn)LP-S 12批，F(xiàn)LP-N 12批，建立以上54批FLP的HPLC指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、10-姜酚7種有效成分含量；利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）方法對(duì)FLP-D、FLP-S和FLP-N各自的HPLC指紋圖譜特征峰及7種有效成分進(jìn)行分析。FLP-D、FLP-S和FLP-N的HPLC指紋圖譜分別標(biāo)定出20、25、20個(gè)特征峰，通過PCA和PLS-DA，篩選出14個(gè)差異性標(biāo)志物，其中8、9、12、17、18、25號(hào)峰來自甘草，29、32號(hào)峰來自干姜，22號(hào)峰來自白術(shù)。含量測(cè)定結(jié)果表明，甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I在FLP-D、FLP-S和FLP-N中的含量差異顯著，其中6-姜酚為變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值＞1.0的差異性標(biāo)志物。建立的HPLC指紋圖譜與多成分同時(shí)測(cè)定方法能有效評(píng)價(jià)FLP-D、FLP-S和FLP-N的化學(xué)成分差異；識(shí)別出的14個(gè)差異性標(biāo)志物可作為區(qū)分FLP-D、FLP-S和FLP-N的潛在化學(xué)特征關(guān)鍵質(zhì)量屬性；甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I可作為區(qū)分FLP-D與FLP-N或區(qū)分FLP-S與FLP-N的化學(xué)特征關(guān)鍵質(zhì)量屬性，6-姜酚可作為同時(shí)區(qū)分FLP-D、FLP-S和FLP-N 3種不同劑型的化學(xué)特征關(guān)鍵質(zhì)量屬性。為進(jìn)一步完善FLP系列制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考，同時(shí)為解決同方異劑中藥的質(zhì)控指標(biāo)同質(zhì)化問題提供了新思路。

附子理中丸；HPLC；指紋圖譜；甘草苷；苯甲酰新烏頭原堿；黨參炔苷；6-姜酚；白術(shù)內(nèi)酯III；白術(shù)內(nèi)酯I；10-姜酚；劑型差異；化學(xué)特征關(guān)鍵質(zhì)量屬性；主成分分析；偏最小二乘法-判別分析；差異性標(biāo)志物

中醫(yī)藥是中華民族幾千年的臨床經(jīng)驗(yàn)與智慧的結(jié)晶，是中華文明的瑰寶。隨著制劑技術(shù)的快速發(fā)展，中藥方劑被不斷開發(fā)成丸劑、片劑、口服液等多種劑型，相同方劑具備多樣劑型（同方異劑）的現(xiàn)象越來越常見，《中國(guó)藥典》2020年版一部中有245首方劑形成了623個(gè)同方異劑中成藥品種[1]。但由于中藥的化學(xué)成分眾多，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜，使得同方異劑中藥的質(zhì)控指標(biāo)趨于同質(zhì)化，同一方劑中藥的劑型不同但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)類似，這種忽略不同劑型的制劑工藝特征背景下的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)不能全面反映藥品的質(zhì)量特征，不利于中藥的現(xiàn)代開發(fā)與臨床應(yīng)用。

不同劑型中藥的制備工藝不同，現(xiàn)代研究表明，制劑工藝影響化學(xué)成分的屬性、有無、多寡與相對(duì)比例等，從而影響中藥的質(zhì)量與療效[2]。關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs）是反映產(chǎn)品質(zhì)量的特征參數(shù)，化學(xué)特征CQAs主要關(guān)注與制劑質(zhì)量密切相關(guān)的化學(xué)成分，是反映藥物安全性與有效性的重要標(biāo)準(zhǔn)[3]。白鋼等[4]提出應(yīng)以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，選取能體現(xiàn)中藥臨床優(yōu)勢(shì)和產(chǎn)品特色的CQAs特征參數(shù)，為中藥復(fù)方的高質(zhì)量發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)與方法借鑒。因此，辨識(shí)能夠充分體現(xiàn)同方異劑中藥劑型特色的化學(xué)特征CQAs，有利于解決同方異劑中藥存在的質(zhì)控指標(biāo)同質(zhì)化問題，從而推動(dòng)中藥的高質(zhì)量發(fā)展。

附子理中丸（Fuzi Lizhong Pills，F(xiàn)LP）出自第一部官方制劑規(guī)范《太平惠民和劑局方》，由附子、黨參、干姜、白術(shù)、甘草5味中藥組成，全方配伍得宜，堪稱溫中健脾、溫腎助陽(yáng)之經(jīng)典名方[5]。目前全國(guó)共有176個(gè)廠家生產(chǎn)的約262種FLP，主要有FLP大蜜丸（Dami Pills，F(xiàn)LP-D）、FLP水蜜丸（Shuimi Pills，F(xiàn)LP-S）和FLP濃縮丸（Nongsuo pill，F(xiàn)LP-N）3種上市劑型。FLP-D與FLP-S收載于《中國(guó)藥典》2020年版一部，F(xiàn)LP-N收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中成藥成方制劑第七冊(cè)》，3者制劑工藝不同，質(zhì)控指標(biāo)卻同質(zhì)化且單一，其臨床定位也完全一致，F(xiàn)LP-D與FLP-S僅選擇甘草苷作為含量測(cè)定指標(biāo)成分，F(xiàn)LP-N無任何含量測(cè)定指標(biāo)。中藥復(fù)方通過多種成分相互作用發(fā)揮藥效[6]，僅用單一成分同時(shí)作為3種劑型的含量測(cè)定指標(biāo)，既不符合中藥復(fù)方療效發(fā)揮的特點(diǎn)，也不能體現(xiàn)3種丸劑不同的劑型特征。且有研究表明[7]，附子理中蜜丸與濃縮丸含有的6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯I等9種體外藥效成分含量存在明顯差異。可見，F(xiàn)LP作為“同方異劑”中藥的代表之一，其臨床定位與質(zhì)控指標(biāo)同質(zhì)化問題亟待解決。

基于此，本研究根據(jù)目前FLP-D、FLP-S和FLP-N市售品種生產(chǎn)廠家的不同占比（10∶3∶2）同時(shí)結(jié)合指紋圖譜研究中樣本的譜圖數(shù)量需10批及以上的實(shí)際需要，采用分層抽樣法隨機(jī)抽取來自10、4、4個(gè)廠家，每個(gè)廠家各3批次的市售FLP-D樣品30批，F(xiàn)LP-S樣品12批，F(xiàn)LP-N樣品12批；采用HPLC方法，建立FLP-D、FLP-S和FLP-N 3種不同劑型的指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、10-姜酚7種有效成分含量；結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等分析方法，對(duì)比研究3種不同劑型FLP所含化學(xué)成分的差異，辨識(shí)其與劑型相關(guān)的化學(xué)特征CQAs，為進(jìn)一步完善FLP的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、保證其臨床合理應(yīng)用提供參考，為解決同方異劑中藥質(zhì)控指標(biāo)同質(zhì)化問題提供新思路。

1 儀器與材料

UltiMate 3000型高效液相色譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；XM-P221H型超聲波處理器，小美超聲儀器（昆山）有限公司；ARSS4CN型十萬(wàn)分之一分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司。

對(duì)照品甘草苷（批號(hào)AF21030904）購(gòu)自成都埃法科技有限公司；對(duì)照品苯甲酰新烏頭原堿（批號(hào)MUST-22102410）、10-姜酚（批號(hào)MUST-22073004），均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；對(duì)照品白術(shù)內(nèi)酯I（批號(hào)RFS-B03302201010）、白術(shù)內(nèi)酯III（批號(hào)RFS-B03502201004）、黨參炔苷（批號(hào)RFS-D02602204021）和6-姜酚（批號(hào)RFS-J01902111009）均購(gòu)自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司；各對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98.00%。水為純化水；乙腈、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純。附子、干姜、白術(shù)、甘草、黨參飲片均購(gòu)自四川國(guó)強(qiáng)中藥飲片有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)裴瑾教授鑒定，分別為毛茛科烏頭屬植物烏頭Debx.的子根炮制加工品，姜科姜屬植物姜Rosc.的干燥根莖，菊科蒼術(shù)屬植物白術(shù)Koidz.的干燥根莖的炮制加工品，豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖，桔?？泣h參屬植物黨參(Franch.) Nannf.的干燥根。

為保證抽取樣本具有良好的代表性與盡可能小的抽樣誤差，本研究采用分層抽樣法中的比例分配法，根據(jù)3種劑型FLP的生產(chǎn)廠家占比（FLP-D∶FLP-S∶FLP-N＝10∶3∶2），同時(shí)結(jié)合指紋圖譜研究中樣本的HPLC譜圖數(shù)量需10批及以上的實(shí)際需要，隨機(jī)抽取來自10、4、4個(gè)廠家，每個(gè)廠家各3批次的FLP-D、FLP-S和FLP-N的30、12、12批次的市售FLP樣品。樣品信息見表1。

表1 54批FLP的樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil Gold C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～2 min，0～15%乙腈；2～10 min，15%～20%乙腈；10～17 min，20%～35%乙腈；17～22 min，35%～40%乙腈；22～32 min，40%～50%乙腈；32～42 min，50%乙腈；42～52 min，50%～70%乙腈；52～70 min，70%乙腈；體積流量為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm；進(jìn)樣體積10 μL。

2.2 樣品的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、10-姜酚對(duì)照品，精密稱定，加入適量含0.05%鹽酸的甲醇溶液，制成含甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、10-姜酚各成分質(zhì)量濃度分別為1.37、0.25、0.24、0.78、0.24、0.16、0.20 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 結(jié)合文獻(xiàn)方法[8-9]與本研究前期對(duì)提取方法的考察結(jié)果，分別取3種不同劑型的市售FLP（大蜜丸6 g，水蜜丸4 g，濃縮丸8丸，3種丸劑的生藥量相等），置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，密塞，25 ℃下超聲（250 W）提取45 min，放冷，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 單味藥材樣品溶液的制備 分別取附子、黨參、白術(shù)、干姜、甘草藥材適量，粉碎，過6號(hào)篩，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法，制備單味藥材樣品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 參照《中國(guó)藥典》2020年版一部項(xiàng)下FLP制法，分別制備缺附子、黨參、白術(shù)、干姜、甘草的大蜜丸與水蜜丸，參照《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第七冊(cè)》FLP制法，制備缺附子、黨參、白術(shù)、干姜、甘草的濃縮丸。按照“2.2.2”項(xiàng)下方法，制備各陰性樣品溶液。

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批市售FLP（D30）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，以13號(hào)峰6-姜酚為參照峰，計(jì)算得各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批市售FLP（D30），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，以13號(hào)峰6-姜酚為參照峰，計(jì)算得各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批市售FLP（D30）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在制備后0、4、8、12、6、20、24 h進(jìn)樣分析，以13號(hào)峰6-姜酚為參照峰，計(jì)算得各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 3種劑型FLP的HPLC指紋圖譜建立 將54批FLP樣品按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2012版，分別設(shè)定D30、S8、N7為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正和Mark峰匹配，分別得到FLP-D、FLP-S與FLP-N的疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜（圖1）。FLP-D共標(biāo)定了20個(gè)特征峰（圖1-A），經(jīng)與混合對(duì)照品的色譜結(jié)果進(jìn)行比較分析，鑒定出其中6個(gè)色譜峰，分別為4號(hào)峰甘草苷、5號(hào)峰黨參炔苷、13號(hào)峰6-姜酚、15號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯III、26號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯I、28號(hào)峰10-姜酚；FLP-S共標(biāo)定了25個(gè)特征峰（圖1-B），經(jīng)與混合對(duì)照品的色譜結(jié)果進(jìn)行比較分析，鑒定出其中5個(gè)色譜峰，分別為4號(hào)峰甘草苷、5號(hào)峰黨參炔苷、13號(hào)峰6-姜酚、15號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯III、28號(hào)峰10-姜酚；FLP-N共標(biāo)定了20個(gè)特征峰（圖1-C），經(jīng)與混合對(duì)照品的色譜結(jié)果進(jìn)行比較分析，鑒定出其中4個(gè)色譜峰，分別為4號(hào)峰甘草苷、5號(hào)峰黨參炔苷、13號(hào)峰6-姜酚、15號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯III。

2.4 不同劑型FLP的HPLC指紋圖譜差異性分析

2.4.1 聚類分析 將FLP-D、FLP-S與FLP-N 3種劑型各自的指紋圖譜中的特征峰峰面積作為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1分析軟件，進(jìn)行聚類分析。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)組間距離為4時(shí)，54批樣品聚為4類，S1～S7、S9～S12聚為一類，D1～30聚為一類，N1～N12聚為一類，S8聚為一類，以上結(jié)果說明FLP-D、FLP-S與FLP-N各自聚為一類，不同類別之間的化學(xué)成分的相對(duì)含量有較大差異。

2.4.2 PCA 采用SIMCA 14.1分析軟件對(duì)FLP-D、FLP-S以及FLP-N 3種劑型的特征峰進(jìn)行PCA，結(jié)果見圖3。由PCA得分圖可知，F(xiàn)LP-D、FLP-S和FLP-N能夠較好地分開，說明不同劑型FLP的化學(xué)成分存在較大差異。

2.4.3 PLS-DA 為進(jìn)一步分析FLP-D、FLP-S以及FLP-N所含化學(xué)成分的差異，采用有監(jiān)督的PLS-DA模型進(jìn)行分析。以FLP-D、FLP-S以及FLP-N 3種劑型的特征峰數(shù)據(jù)為變量，利用SIMCA14.1軟件對(duì)FLP-D、FLP-S與FLP-N進(jìn)行PLS-DA。結(jié)果如圖4-a～c所示，可知FLP-D、FLP-S與FLP-N存在一定差異，能夠分為3類。由變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）圖（圖4-c）可知，VIP＞1.0的差異化合物有14個(gè)，說明3種不同劑型FLP所含的化學(xué)成分相差較大。

2.4.4 3種劑型FLP的差異峰歸屬 制備缺附子、缺干姜、缺黨參、缺白術(shù)以及缺甘草陰性樣品溶液及單味藥材樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)合各色譜峰的保留時(shí)間，通過對(duì)比分析，對(duì)PLS-DA中識(shí)別出的14個(gè)差異成分進(jìn)行峰歸屬，色譜圖對(duì)比結(jié)果如圖5所示。差異峰中的第8、9、12、17、18、25號(hào)峰來自甘草，第29、32號(hào)峰來自干姜，第22號(hào)峰來自白術(shù)，第2、20、26、27、31號(hào)峰未識(shí)別出藥材來源。

2.5 多成分含量測(cè)定

2.5.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)混合對(duì)照品溶液、FLP供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果表明樣品中各成分的分離度較好，陰性無干擾，HPLC色譜圖見圖6。

圖1 FLP-D (D1～D30, A)、FLP-S (S1～S12, B) 和FLP-N (N1～N12, C) 樣品的HPLC指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜(DR,SR,NR)

圖2 FLP-D (D1～D30)、FLP-S (S1～S12) 和FLP-N (N1～N12) 樣品聚類分析圖

圖3 FLP-D (D1～D30)、FLP-S (S1～S12) 和FLP-N (N1～N12) 樣品的PCA統(tǒng)計(jì)分析圖

2.5.2 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，采用二倍稀釋法，分別稀釋0、2、4、8、16、32、64、128倍，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得7個(gè)成分的回歸方程與線性范圍，結(jié)果分別為甘草苷＝366.9＋1.993 7，2＝0.999 4，線性范圍4.68～600.00 μg/mL；苯甲酰新烏頭原堿＝206.1＋0.258 6，2＝0.999 7，線性范圍0.78～100.00 μg/mL；黨參炔苷＝58.518＋0.045 6，2＝0.999 8，線性范圍0.86～110.00 μg/mL；6-姜酚＝140.8＋0.468 8，2＝0.999 4，線性范圍2.66～340.00 μg/mL；白術(shù)內(nèi)酯III＝262.6＋0.236 3，2＝0.999 5，線性范圍0.86～110.00 μg/mL；白術(shù)內(nèi)酯I＝134.93＋0.070 7，2＝0.999 5，線性范圍0.55～70.00 μg/mL；10-姜酚＝125.02＋0.086 9，2＝0.999 6，線性范圍0.70～90.00 μg/mL。

a-PLS-DA得分矩陣；b-PLS-DA載荷散點(diǎn)圖；c-PLS-DA的VIP值。

圖5 FLP-D (a)、FLP-S (b) 和FLP-N (c) 樣品指紋圖譜的差異峰歸屬色譜圖

1-甘草苷；2-苯甲酰新烏頭原堿；3-黨參炔苷；4-6-姜酚；5-白術(shù)內(nèi)酯III；6-白術(shù)內(nèi)酯I；7-10姜酚。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取同一批市售FLP（D30）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。計(jì)算得甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、10-姜酚峰面積的RSD分別為0.07%、0.44%、2.41%、0.28%、0.55%、0.10%、0.36%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批市售FLP（D30），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。計(jì)算得甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、10-姜酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為2.20%、0.51%、1.39%、0.52%、2.10%、0.70%、0.33%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批市售FLP（D30）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在制備后0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積。計(jì)算得甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、10-姜酚峰面積的RSD分別為0.78%、0.50%、0.88%、1.17%、0.72%、1.06%、1.13%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定指標(biāo)成分含量的同一批市售FLP（D30）6份，每份3.0 g，分別按樣品中各成分含量的100%水平，每份加入各對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。計(jì)算得甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、10-姜酚的平均加樣回收率分別為95.60%、99.47%、104.08%、101.64%、98.63%、103.40%、103.78%，RSD分別為2.94%、1.31%、1.26%、1.25%、0.64%、2.84%、0.17%，結(jié)果表明該方法的回收率符合要求。

2.5.7 樣品含量測(cè)定 54批FLP樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各批次樣品中甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、10-姜酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為FLP-S＞FLP-D＞FLP-N，6-姜酚和10-姜酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為FLP-S＞FLP-N＞FLP-D。采用SPSS 26.0對(duì)FLP-D、FLP-S和FLP-N中的指標(biāo)成分含量進(jìn)行單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），＜0.05即為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果如表4所示，F(xiàn)LP-S中的6-姜酚的含量顯著高于FLP-D；FLP-S中的甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、6-姜酚、白術(shù)內(nèi)酯III及白術(shù)內(nèi)酯I的含量均顯著高于FLP-N；FLP-D中的甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、白術(shù)內(nèi)酯III與白術(shù)內(nèi)酯I的含量均顯著高于FLP-N；黨參炔苷、10-姜酚在FLP-D、FLP-S及FLP-N中的含量無顯著差異。進(jìn)一步將以上數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PLS-DA，結(jié)果如表5所示，VIP＞1.0的差異化合物有1個(gè)，為6-姜酚。

3 討論

3.1 FLP-D、FLP-S和FLP-N的成分差異性分析

3.1.1 HPLC指紋圖譜差異性分析 在FLP-D、FLP-S和FLP-N的指紋圖譜差異性研究中發(fā)現(xiàn)：（1）3種劑型特征峰數(shù)量為FLP-S＞FLP-D＞FLP-N；（2）除各自特有成分外，大部分成分的相對(duì)含量為FLP-S＞FLP-D＞FLP-N。以上結(jié)果初步表明，F(xiàn)LP-S所含成分的種類與相對(duì)含量在3種劑型中最多，F(xiàn)LP-N最少。其原因可能是：一方面，大蜜丸與水蜜丸均為藥材原粉入藥，而濃縮丸中的部分藥材經(jīng)過滲濾煎煮，提取總量相較于原粉入藥時(shí)相對(duì)含量較低；另一方面，蜂蜜黏合性較強(qiáng)，會(huì)延緩蜜丸的釋藥速度[10]。蜂蜜中含有3/4的糖類[11]，這些糖類化合物含有大量的羧基、羥基等親水基團(tuán)，具有很強(qiáng)的吸濕性[12-13]，使得蜜丸在溶解時(shí)存在“吸水-浸潤(rùn)-溶解”的反復(fù)過程，形成親水性屏障作用的浸膏層，會(huì)限制水分子向內(nèi)滲透與藥物向外擴(kuò)散，導(dǎo)致蜜丸釋藥緩慢[14]。FLP-D的煉蜜添加量是水蜜丸的近3倍，因此，在相同的提取方法下，本研究在相同時(shí)間點(diǎn)取樣，檢測(cè)到的FLP-D的成分溶出少于FLP-S。

表3 54批FLP樣品含量測(cè)定結(jié)果

“?”表示該成分未在樣品中檢出。

“?” means this component is not detected in samples.

表4 FLP-D、FLP-S和FLP-N樣品中的指標(biāo)成分含量比較()

與FLP-D比較：*＜0.05**＜0.01；與FLP-S比較：##＜0.01。

*< 0.05**< 0.01FLP-D;##< 0.01FLP-S.

表5 FLP-D、FLP-S和FLP-N樣品中各指標(biāo)成分含量VIP值

PLS-DA共識(shí)別出14個(gè)差異化合物（VIP＞1.0），第2、8、27、32號(hào)峰為FLP-S特有，第17、20、26、31號(hào)峰為FLP-D特有，第29號(hào)峰為FLP-N特有。以上結(jié)果說明，不同劑型FLP所含化學(xué)成分存在明顯不同，以上成分可作為區(qū)分FLP-D、FLP-S和FLP-N的劑型關(guān)聯(lián)的潛在化學(xué)特征CQAs。14個(gè)差異化合物的峰歸屬結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第29、32號(hào)峰來自干姜，第22號(hào)峰來自白術(shù)，第8、9、12、17、18、25號(hào)峰來自甘草。FLP以溫陽(yáng)祛寒、益氣健脾之功效見長(zhǎng)，方中干姜、白術(shù)為臣藥，發(fā)揮溫運(yùn)中陽(yáng)、健脾燥濕的功效，甘草起到補(bǔ)中扶正、調(diào)和諸藥的作用[15-16]。化學(xué)成分是復(fù)方發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，3種劑型FLP存在的明顯化學(xué)成分差異說明FLP-S、FLP-D與FLP-N在溫運(yùn)中陽(yáng)、健脾燥濕、益氣補(bǔ)中等方面的功效發(fā)揮可能存在差異，雖然有研究[7,17]表明不同劑型FLP的體內(nèi)外藥效成分確有不同，但目前并未見相關(guān)的藥理藥效實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。此外，本研究主要通過比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品化合物與樣品中化合物的保留時(shí)間確定樣品中的化學(xué)成分，仍需進(jìn)一步通過LC-MS方法對(duì)以上化合物進(jìn)行檢測(cè)鑒定。

3.1.2 指標(biāo)成分確定 本研究參照《中國(guó)藥典》2020年版一部中，對(duì)FLP處方中單味藥材的含量測(cè)定指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇與復(fù)方功效密切相關(guān)的化學(xué)成分進(jìn)行定量分析。附子中的單酯型生物堿是其發(fā)揮藥效的主要成分之一，具有抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用[18-19]；黨參所含成分黨參炔苷是其主要藥效成分，具有健脾、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，可作為黨參的指標(biāo)成分[20]；白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯I、III等內(nèi)酯類成分是其發(fā)揮抗炎、治療泄瀉的活性成分[21]；6-姜酚、10-姜酚是干姜中的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎等藥理作用，與其回陽(yáng)通脈功效的發(fā)揮密切相關(guān)[22-23]；甘草所含黃酮類成分甘草苷等是其發(fā)揮藥效的主要成分[24]。在本研究中，附子所含烏頭堿、新烏頭堿未被HPLC檢出，苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿在樣品中難以分離。因此，綜合選擇苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯III、6-姜酚、10-姜酚、甘草苷7種藥效相關(guān)成分進(jìn)行定量分析。

3.1.3 多成分含量測(cè)定差異性分析 多成分含量測(cè)定差異研究分別對(duì)FLP-D、FLP-S和FLP-N中的7個(gè)藥效相關(guān)指標(biāo)成分同時(shí)進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表4），甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III和白術(shù)內(nèi)酯I的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為FLP-S＞FLP-D＞FLP-N，6-姜酚和10-姜酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為FLP-S＞FLP-N＞FLP-D。由此可見，水蜜丸中7個(gè)指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于大蜜丸，這進(jìn)一步說明了煉蜜的添加量對(duì)蜜丸藥效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有重要影響。且有學(xué)者研究表明[25]，煉蜜用量對(duì)附子理中丸蜜丸中生物堿、甘草酸、白術(shù)內(nèi)酯III等21個(gè)活性成分的藥代動(dòng)力學(xué)有重要影響。因此，煉蜜用量及煉蜜所含化學(xué)成分或可成為區(qū)分不同蜜丸的潛在CQAs。

單因素方差分析發(fā)現(xiàn)5種藥效成分在不同劑型中的含量差異顯著，其中甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I在2種附子理中蜜丸和濃縮丸中的含量具有顯著差異（＜0.05），可作為區(qū)分FLP-D與FLP-N或區(qū)分FLP-S與FLP-N的化學(xué)特征CQAs；6-姜酚為3種劑型的差異化合物（VIP＞1.0），可作為同時(shí)區(qū)分FLP-D、FLP-S和FLP-N 3種劑型的化學(xué)特征CQAs。黨參炔苷、10-姜酚2種藥效成分在不同劑型中的含量無顯著差異。黨參炔苷作為臣藥黨參的主要活性成分之一，與其健脾的傳統(tǒng)功效密切相關(guān)[20]；10-姜酚是代表方中臣藥干姜的傳統(tǒng)藥性的主要成分之一，具有保護(hù)脾胃、回陽(yáng)通脈等作用[23]。黨參炔苷與10-姜酚2種藥效成分作為FLP-D、FLP-S及FLP-N的共性成分，在一定程度上說明了3種FLP在臨床功效與適應(yīng)癥等方面具有共性，但其用于治療具體疾病的藥效是否有異同仍需進(jìn)一步研究。

此外，本實(shí)驗(yàn)也對(duì)君藥附子中的烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿5種生物堿進(jìn)行了測(cè)定，烏頭堿與新烏頭堿未在樣品中檢出，苯甲酰烏頭原堿與苯甲酰次烏頭原堿在樣品中與其他雜峰混合，難以分離，因此最終選擇分離度較好的苯甲酰新烏頭原堿進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)合本課題組的前期研究與參考文獻(xiàn)[17,26-27]，發(fā)現(xiàn)烏頭堿與新烏頭堿能被質(zhì)譜檢測(cè)，但含量很低，約為0.1～4.0 μg/g，因此，推測(cè)在本研究中未檢出原因可能是其在樣品中含量過低，無法達(dá)到最低檢測(cè)限度。值得注意的是，目前該方的含量測(cè)定指標(biāo)并沒有對(duì)君藥附子相關(guān)成分進(jìn)行規(guī)定，僅有烏頭堿限量作為檢查項(xiàng)之一，這既不能很好地體現(xiàn)本方療效，也不利于FLP的臨床有效運(yùn)用。本研究發(fā)現(xiàn)苯甲酰新烏頭原堿在FLP-D與FLP-N，F(xiàn)LP-S與FLP-N中含量差異顯著，因此可考慮將苯甲酰新烏頭原堿等雙酯型生物堿列入含量測(cè)定指標(biāo)，作為區(qū)分不同劑型FLP的化學(xué)特征CQAs。

3.2 同方異劑中藥含量測(cè)定指標(biāo)存在的問題

目前大多數(shù)同方異劑的中藥成方制劑的含量測(cè)定規(guī)定主要為：（1）大部分制劑含量測(cè)定指標(biāo)同質(zhì)化，表現(xiàn)為大部分同方異劑制劑使用相同指標(biāo)，且指標(biāo)成分僅針對(duì)中藥材，與劑型關(guān)聯(lián)度不大，無法體現(xiàn)劑型特征，如附子理中制劑（FLP-D、FLP-S）、祛風(fēng)止痛制劑（祛風(fēng)止痛濃縮丸、祛風(fēng)止痛片、祛風(fēng)止痛膠囊）等；（2）部分制劑含量測(cè)定指標(biāo)單一，該類中藥制劑僅使用非君藥的單一成分作為含測(cè)指標(biāo)，不符合中藥復(fù)方藥效發(fā)揮的特點(diǎn)，如：附子理中丸（大蜜丸、水蜜丸）含測(cè)指標(biāo)為佐使藥甘草的成分甘草苷，八珍丸（水蜜丸、大蜜丸、濃縮丸）含測(cè)指標(biāo)為佐藥白芍的成分芍藥苷；（3）少部分制劑無任何含量測(cè)定指標(biāo)：如龍膽瀉肝丸（小蜜丸、大蜜丸）、香附丸（大蜜丸、水蜜丸）、FLP-N等?？梢?，同方異劑中藥的質(zhì)量控制普遍存在問題。

劑型因素通過影響藥物本身所含成分的種類與含量進(jìn)而影響藥效發(fā)揮，大量研究表明[28-31]，同方異劑制劑所含化學(xué)成分的種類、含量及其體外溶出、體內(nèi)吸收等過程與最終藥效均存在明顯不同。有研究[32]發(fā)現(xiàn)止嗽散沖劑顆粒與湯劑治療喘息型支氣管炎的臨床療效不同，沖劑中有效成分含量更高可能是其療效更好的原因之一。有學(xué)者對(duì)不同劑型六味地黃丸的物質(zhì)組釋放動(dòng)力學(xué)進(jìn)行可視化表征，發(fā)現(xiàn)濃縮丸釋放最快且最完全，小蜜丸和水蜜丸次之，大蜜丸釋放速度最慢、釋藥量小[33]。

銀翹散源自《溫病條辨》，是清熱解毒的代表方劑，但將原方散劑改為丸劑、片劑、膠囊劑時(shí)，其釋藥速度變緩，且長(zhǎng)時(shí)間加熱使有效成分損失，無法達(dá)到原方療效[34]。由此可見，同方異劑中藥所含化學(xué)成分的種類、含量以及釋藥速度和程度存在差異，且最終影響方劑療效，不使用指標(biāo)成分、使用單一指標(biāo)成分，或使用完全相同成分對(duì)同方異劑中成藥進(jìn)行質(zhì)量控制，均無法體現(xiàn)不同劑型的制劑特征，缺乏合理性。

綜上，本研究通過采用“中藥指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分含量測(cè)定”的方法，對(duì)同方異劑中藥所含化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比研究，能夠從定性與定量?jī)煞矫娣治霾煌瑒┬偷闹饕瘜W(xué)成分，同時(shí)關(guān)注重要藥效成分，辨識(shí)與劑型密切關(guān)聯(lián)的化學(xué)特征CQAs，充分體現(xiàn)了同方異劑中藥的劑型特色，為解決同方異劑中藥的質(zhì)控指標(biāo)單一、無法體現(xiàn)劑型特征的同質(zhì)化問題提供了一種參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification of critical quality attributes with chemical characteristics of three dosage forms of Fuzi Lizhong Dami Pills, Shuimi Pills and Nongsuo Pills

YANG Shasha, LIN Xia, HAO Yiwen, ZHOU Hang, ZHANG Yue, GAO Zixi, XIE Fuyu, ZHANG Xing, FU Chaomei, ZHANG Zhen

State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To find the chemical critical quality attributes (CQAs) associated with the dosage form characteristics of Fuzi Lizhong Pills (FLP, 附子理中丸) by establishing HPLC fingerprints of Dami Pills (FLP-D), Shuimi Pills (FLP-S) and Nongsuo Pills (FLP-N) and determining contents of seven effective components.According to the stratified sampling method and research requirement, 30 batches of FLP-D, 12 batches of FLP-S and 12 batches of FLP-N were randomly selected from the market. The HPLC HPLC fingerprints of 54 batches of FLP were establishe. The contents of seven effective components, including liquiritin, benzoylmesaconine, lobetyolin, 6-gingerol, atractylenolide III, atractylenolide I, and 10-gingerol were simultaneously determined. Principal component analysis (PCA) and partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) were used to analyze the HPLC fingerprint characteristic peaks of FLP-D, FLP-S and FLP-N and seven active components.There were 20 characteristic peaks in the fingerprints of FLP-D, 25 characteristic peaks in FLP-S, and 20 characteristic peaks in FLP-N. A total of 14 differential markers were determined by PCA and PLS-DA. Among them, peaks 8, 9, 12, 17, 18 and 25 originated from Gancao (et), peaks 29 and 32 originated from Ganjiang (), and peak 22 originated from Baizhu (). The contents of liquiritin, benzoylmesaconine, 6-gingerol, atractylenolide III and atractylenolide I in FLP-D, FLP-S and FLP-N were significantly different. The compound 6-gingerol was a differential marker with variable importance in projection (VIP) value > 1.0.The established HPLC fingerprint and multi-component simultaneous determination method can effectively evaluate the chemical composition differences of FLP-D, FLP-S and FLP-N. The identified14 differential markers could be the potential CQAs of FLP-D, FLP-S and FLP-N. Liquiritin, benzoylmesaconine, atractylenolide III and atractylenolide I could be used as CQAs to distinguish FLP-D and FLP-N, or FLP-S and FLP-N. 6-gingerol could be used as CQAs for differentiating FLP-D, FLP-S and FLP-N simultaneously. Our research provides a reference for further enhancing the quality standards of FLP, and presents a novel idea to address the homogeneity issue in quality control for traditional Chinese medicine with the same prescription but different dosage forms.

Fuzi Lizhong Pills; HPLC; fingerprint; liquiritin; benzoylmesaconine; lobetyolin; 6-gingerol; atractylenolide III; atractylenolide I; 10-gingerol; dosage form differences; chemical critical quality attributes; PCA; PLS-DA; differential markers

R283.6

A

0253 - 2670(2024)09 - 2955 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.010

2023-10-26

四川省科技計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2020YFS0567）；四川省科技廳四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021YJ0251）；四川省中醫(yī)藥管理局科學(xué)技術(shù)研究專項(xiàng)（2023MS600）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者青基人才專項(xiàng)（QJRC2022027）

楊莎莎，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┖托聞┬脱芯?。E-mail: 1973246652@qq.com

林 夏，女，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┖托聞┬脱芯?。E-mail: 3328116305@qq.com

通信作者：張 臻，女，副教授，主要從事中藥制劑新技術(shù)新劑型、中藥復(fù)方功效與作用機(jī)制研究。E-mail: zhangzhendr@126.com

傅超美，男，教授，從事中藥新制劑和新劑型研究。E-mail: chaomeifu@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]