二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的指紋圖譜、多成分含量測(cè)定及其鎮(zhèn)痛和調(diào)節(jié)骨代謝作用研究

劉 燕，劉玉玲，沈 燚，杜金蔓，趙琦明，葉欣園，張泉龍，秦路平，張巧艷

二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的指紋圖譜、多成分含量測(cè)定及其鎮(zhèn)痛和調(diào)節(jié)骨代謝作用研究

劉 燕，劉玉玲，沈 燚，杜金蔓，趙琦明，葉欣園，張泉龍，秦路平*，張巧艷*

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

建立二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的指紋圖譜及多成分含量測(cè)定方法，為基于二仙湯的抗骨質(zhì)疏松組分中藥的研制奠定基礎(chǔ)。HPLC指紋圖譜檢測(cè)采用Agilent ZorBax Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈- 0.1%磷酸水溶液（含0.025%十二烷基硫酸鈉），梯度洗脫：0～30 min，4%～30%乙腈；30～50 min，30%～50%乙腈；50～60 min，50%～90%乙腈；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)；通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)。樣品含量測(cè)定的梯度洗脫調(diào)整為0～25 min，10%～18%乙腈；25～35 min，18%～19%乙腈；35～40 min，19%～25%乙腈；40～50 min，25%～32%乙腈；50～60 min，32%～55%乙腈；并測(cè)定8種有效成分的含量。以小鼠醋酸扭體和成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞為模型評(píng)價(jià)二仙湯有效組分的鎮(zhèn)痛和對(duì)骨代謝的調(diào)控作用。建立了二仙湯有效組分的HPLC指紋圖譜，確定了16個(gè)共有峰，16批樣品與對(duì)照指紋譜比較的相似度均在0.9以上。指認(rèn)出其中8個(gè)共有峰（1、4、10～12、13、15、16號(hào)峰），分別為新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、仙茅苷、朝藿定B、淫羊藿苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿。含量測(cè)定的線性關(guān)系、重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度及加樣回收率考察符合要求。二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分在小鼠醋酸扭體模型上具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，并可促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成和骨基質(zhì)礦化，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收。建立的二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分HPLC指紋圖譜及多成分含量測(cè)定方法可準(zhǔn)確、高效、全面的對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

二仙湯；骨質(zhì)疏松；指紋圖譜；多成分含量測(cè)定；高效液相色譜法；新芒果苷；芒果苷；阿魏酸；仙茅苷；朝藿定B；淫羊藿苷；鹽酸巴馬??；鹽酸小檗堿；鎮(zhèn)痛；質(zhì)量控制

中藥方劑是中醫(yī)臨床用藥的主要形式，是遵循中醫(yī)藥理論，將2味或2味以上的中藥飲片配伍而成的，具有多成分、多靶點(diǎn)整合調(diào)節(jié)人體機(jī)能的作用特點(diǎn)，在多因素復(fù)雜性疾病的防治中顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)[1]。然而，由于中藥材化學(xué)成分復(fù)雜，方劑的藥效物質(zhì)和作用機(jī)制不清楚，影響中藥療效的穩(wěn)定發(fā)揮和對(duì)中藥方劑作用規(guī)律的認(rèn)識(shí)，進(jìn)而阻礙中藥產(chǎn)品質(zhì)量的提升和中醫(yī)藥現(xiàn)代化的進(jìn)程。因此，闡明中藥方劑發(fā)揮作用的有效成分和機(jī)制，制備有效組分，研究有效組分的質(zhì)量控制，對(duì)于安全、有效、穩(wěn)定、可控的新型中藥的創(chuàng)制具有重要意義。

二仙湯是張伯訥教授創(chuàng)制的著名方劑，由淫羊藿、仙茅、知母、黃柏、巴戟天和當(dāng)歸組成，具有溫腎陽(yáng)、補(bǔ)腎精、瀉腎火、調(diào)理沖任之功效，用于腎陰、腎陽(yáng)不足而虛火上炎之更年期綜合征、高血壓、腎炎、腎盂腎炎，尿路感染及閉經(jīng)等病癥[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)二仙湯具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化及雌激素樣活性，常用于治療更年期綜合征、骨質(zhì)疏松癥和卵巢早衰等疾病[3-6]。前期研究發(fā)現(xiàn)二仙湯能夠調(diào)控去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝，增加骨密度，改善骨組織微結(jié)構(gòu)的退化，顯示出良好的抗骨質(zhì)疏松作用[7]。進(jìn)一步以成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞為模型，篩選其抗骨質(zhì)疏松的有效成分，發(fā)現(xiàn)二仙湯中淫羊藿黃酮、仙茅酚苷、知母黃酮和皂苷、黃柏生物堿、巴戟天蒽醌和環(huán)烯醚萜苷及當(dāng)歸阿魏酸均有顯著的調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的作用。為此，本實(shí)驗(yàn)富集制備了二仙湯抗骨質(zhì)疏松的有效組分，明確了其在去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的確切作用。本實(shí)驗(yàn)研究了二仙湯有效組分的指紋圖譜及多成分的含量測(cè)定方法，觀察其在醋酸扭體小鼠模型，體外成骨細(xì)胞和破骨的作用，為基于二仙湯的抗骨質(zhì)疏松組分中藥的研制提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器、材料和動(dòng)物

1.1 儀器

Agilent 1100型系列高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Bio-Tex ELx 800型全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀，美國(guó)Fisher公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司；MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本Sanyo生物醫(yī)學(xué)電器公司；CKX41型倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 材料

對(duì)照品新芒果苷，批號(hào)130715，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；對(duì)照品芒果苷，批號(hào)MUST-13110201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，購(gòu)于北京恒元啟天化工技術(shù)研究院；對(duì)照品阿魏酸（批號(hào)0773-9910）、仙茅苷（批號(hào)110771-201105）、鹽酸巴馬汀（批號(hào)110732-200506），質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，均由中國(guó)食品藥品鑒定研究院提供；對(duì)照品朝藿定B，批號(hào)110809，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，由四川省維克奇生物科技有限公司提供；對(duì)照品淫羊藿苷，批號(hào)145760，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，購(gòu)于南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司；對(duì)照品鹽酸小檗堿，批號(hào)20130412，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司。

二仙湯處方6味中藥飲片，購(gòu)于上海雷允上藥業(yè)有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張巧艷教授鑒定分別為小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿Maxim.的干燥葉、石蒜科仙茅屬植物仙茅Gaertn.的干燥根莖、百合科知母屬植物知母Bge.的干燥根莖、蕓香科黃檗屬植物黃皮樹(shù)Schneid.的干燥樹(shù)皮、茜草科巴戟天屬植物巴戟天How的干燥根和傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根。結(jié)合資源考證優(yōu)選藥材產(chǎn)地，最終確定6味藥材的產(chǎn)地如下：淫羊藿為甘肅隴南、仙茅為四川宜賓、知母為河北安國(guó)、黃柏為四川滎經(jīng)、當(dāng)歸為甘肅岷縣、巴戟天為廣東肇慶。

制備指紋圖譜研究的16批樣品由3批藥材制備而成，其中1～5批樣品由第1批藥材制備而成，6味藥材的批號(hào)分別為淫羊藿20180501、仙茅20180502、知母20180503、黃柏20180504、當(dāng)歸20180505、巴戟天20180506；6～11批樣品由第2批藥材制備而成，6味藥材的批號(hào)分別為淫羊藿20180601、仙茅20180602、知母20180603、黃柏20180604、當(dāng)歸20180605、巴戟天20180606；12～16批樣品由第3批藥材制備而成，6味藥材的批號(hào)分別為淫羊藿20180701、仙茅20180702、知母20180703、黃柏20180704、當(dāng)歸20180705、巴戟天20180706。16批樣品依次編號(hào)為S1～S16。

制備3批含量測(cè)定樣品的藥材批號(hào)分別為淫羊藿20200601、仙茅20200602、知母20200603、黃柏20200604、當(dāng)歸20200605、巴戟天20200606。所有藥材參照《中國(guó)藥典》2020年版進(jìn)行鑒定，均符合要求。參考本課題組前期研究[8]，制備二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分，用于指紋圖譜和主要化學(xué)成分的含量測(cè)定研究。

UMR-106細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；特級(jí)胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；RANK-L、M-CSF、考馬斯亮藍(lán)G-250和地塞米松均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲醇，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水，娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、甲醛、固藍(lán)BB、硝酸銀、硫代硫酸鈉等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 動(dòng)物

雌性ICR小鼠50只，購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（浙）2020-0061，動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，室溫（25±2）℃，相對(duì)濕度45%～50%，可自由進(jìn)食飲水。本研究中所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用嚴(yán)格遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理規(guī)定（批準(zhǔn)號(hào)：IACUC-20200420-04）。

2 方法與結(jié)果

2.1 二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的制備

6味中藥按處方比例混勻，按每克藥材加8 mL 50%乙醇提取3次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，即為粗提液。提取液減壓濃縮到相對(duì)密度為1.23 g/mL，濾過(guò)，濾液加蒸餾水稀釋到相對(duì)密度為1.08 g/mL，即為待上柱純化樣品液。將樣品液按1個(gè)樹(shù)脂床體積倍數(shù)（BV）的上樣量通入裝有ZTC-1大孔樹(shù)脂的色譜柱中，依次用水、50%乙醇和95%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫部分，減壓濃縮成相對(duì)密度為1.25 g/mL的浸膏，60 ℃干燥，粉碎，得棕黃色粉末，即為二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分。

2.2 二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 Agilent ZorBax Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（含0.025%十二烷基硫酸鈉），梯度洗脫：0～30 min，4%～30%乙腈；30～50 min，30%～50%乙腈；50～60 min，50%～90%乙腈；進(jìn)樣量20 μL；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取新芒果苷16.20 mg、芒果苷10.00 mg、阿魏酸3.50 mg、仙茅苷1.60 mg、朝藿定B 1.25 mg、朝藿定C 3.00 mg、淫羊藿苷3.38 mg，鹽酸小檗堿5.00 mg和鹽酸巴馬汀5.00 mg分別置于5 mL的量瓶中，新芒果苷、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀分別用50%甲醇定容，其他均用甲醇定容至刻度，搖勻，分別配制成質(zhì)量濃度為3.24 mg/mL的新芒果苷、2.00 mg/mL的芒果苷、0.70 mg/mL的阿魏酸、0.32 mg/mL的仙茅苷、0.25 mg/mL的朝藿定B、0.60 mg/mL的朝藿定C、0.675 mg/mL的淫羊藿苷、1.00 mg/mL的鹽酸小檗堿和1.00 mg/mL的鹽酸巴馬汀儲(chǔ)備液，經(jīng)0.45mm微孔濾膜濾過(guò)，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取二仙湯有效組分約50 mg，精密稱定后置于5 mL量瓶中，加入4%乙腈-0.1%磷酸水溶液（含0.025%十二烷基硫酸鈉）定容，超聲溶解后微孔濾膜濾過(guò)，備用。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以對(duì)照品淫羊藿苷作為參照峰，計(jì)算16個(gè)主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果16個(gè)主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0%，各色譜圖的相似度值不低于0.99，表明儀器的精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行檢測(cè)，以對(duì)照品淫羊藿苷作為參照峰，計(jì)算16個(gè)主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果16個(gè)主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0%，各色譜圖的相似度值不低于0.99，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行檢測(cè)，以對(duì)照品淫羊藿苷作為參照峰，計(jì)算16個(gè)主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果16個(gè)主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0%，各色譜圖的相似度值不低于0.99，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 指紋圖譜的建立、共有峰標(biāo)記及其歸屬 利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012版）”以S1為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度0.1 min，經(jīng)多點(diǎn)校正，生成二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分色譜疊加圖及共有模式對(duì)照指紋圖譜（圖1）。分析得到16批供試品的色譜峰，按照色譜峰的保留時(shí)間從小到大，選取16個(gè)峰面積較大的為共有峰。

圖1 16批二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的HPLC指紋圖譜疊加圖及其對(duì)照指紋圖譜(R)

通過(guò)加入對(duì)照品，觀察對(duì)應(yīng)峰面積的變化，指認(rèn)出8個(gè)色譜峰，結(jié)合各藥材化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)資料[9]，確定1號(hào)峰為新芒果苷，4號(hào)峰為芒果苷，1、4號(hào)峰歸屬于知母藥材；10號(hào)峰為阿魏酸，歸屬于當(dāng)歸藥材；11號(hào)峰為仙茅苷，歸屬于仙茅藥材；12號(hào)峰為朝藿定B，13號(hào)峰為淫羊藿苷，12、13號(hào)峰歸屬于淫羊藿藥材；15號(hào)峰為鹽酸巴馬汀，16號(hào)峰為鹽酸小檗堿，15、16號(hào)峰歸屬于黃柏藥材。

2.2.8 相似度評(píng)價(jià) 將16批二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版軟件分別對(duì)16批樣品的指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，生成對(duì)照指紋圖譜，16批二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分與對(duì)照指紋圖譜比較的相似度分別為0.979、0.962、0.968、0.970、0.971、0.986、0.981、0.987、0.986、0.986、0.974、0.971、0.928、0.918、0.971、0.962，從上述結(jié)果可以看出，各批次二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分間化學(xué)成分的差異較小。

2.3 二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZorBax Extend C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水（含有0.025%十二烷基硫酸鈉），梯度洗脫：0～25 min，10%～18%乙腈；25～35 min，18%～19%乙腈；35～40 min，19%～25%乙腈；40～50 min，25%～32%乙腈；50～60 min，32%～55%乙腈；進(jìn)樣量20 μL，體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm?；旌蠈?duì)照品和樣品的色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下的各對(duì)照品溶液適量于5 mL量瓶中，加入初始流動(dòng)相定容得混合對(duì)照品溶液（新芒果苷162.0 μg/mL，芒果苷200.0 μg/mL，阿魏酸35.0 μg/mL，仙茅苷64.0 μg/mL，朝藿定B 50.0 μg/mL，淫羊藿苷135.0 μg/mL，鹽酸巴馬汀20.0 μg/mL，鹽酸小檗堿20.0 μg/mL），等比例稀釋成6個(gè)質(zhì)量濃度梯度。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程新芒果苷＝9.074 8－21.982，2＝0.999 4，線性范圍5.1～162.0 μg/mL；芒果苷＝11.109－41.696，2＝0.999 6，線性范圍6.3～200.0 μg/mL；阿魏酸＝29.101＋9.421 4，2＝0.999 4，線性范圍1.1～35.0 μg/mL；仙茅苷＝12.065＋1.485 1，2＝0.999 8，線性范圍2.0～64.0 μg/mL；朝藿定B＝25.743＋8.830 3，2＝0.999 8，線性范圍1.6～50.0 μg/mL；淫羊藿苷＝24.081－8.375 8，2＝0.999 6，線性范圍4.2～135.0 μg/mL；鹽酸巴馬?。?2.459－23.380，2＝0.998 6，線性范圍0.6～20.0 μg/mL；鹽酸小檗堿＝63.802－8.101 5，2＝0.999 2，線性范圍0.6～20.0 μg/mL。

1-新芒果苷；2-芒果苷；3-阿魏酸；4-仙茅苷；5-朝藿定B；6-淫羊藿苷；7-鹽酸巴馬??；8-鹽酸小檗堿。

2.3.3 檢測(cè)限和定量限實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，采用倍比稀釋的方法，檢測(cè)限按照信噪比（/）大于3，定量限按照/大于10的要求檢測(cè)。新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、仙茅苷、朝藿定B、淫羊藿苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的檢測(cè)限分別為0.96、0.87、0.23、0.56、0.35、0.48、0.23、0.20 μg/mL，定量限分別為2.60、3.12、0.86、1.60、1.20、1.42、0.56、0.53 μg/mL。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密量取已知濃度的混合對(duì)照品溶液。按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，同一天連續(xù)進(jìn)樣6針測(cè)定日內(nèi)精密度，每天進(jìn)樣1針，連續(xù)進(jìn)樣6 d，測(cè)定日間精密度，所得樣品峰面積RSD＜3%，表明日內(nèi)精密度和日間精密度符合要求。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分，分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、仙茅苷、朝藿定B、淫羊藿苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的峰面積RSD分別為2.78%、0.75%、2.91%、2.78%、1.04%、0.90%、3.90%、3.75%，表明在12 h內(nèi)樣品溶液中上述各化合物較為穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分，分別配制6份供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，記錄各對(duì)照品峰面積，計(jì)算新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、仙茅苷、朝藿定B、淫羊藿苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.25%、4.08%、0.88%、3.57%、1.71%、2.78%、2.08%、1.96%，表明本測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取6份等量的已知含量的二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分，加入不同量的對(duì)照品，按樣品制備方法操作制備供試品，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定8種指標(biāo)成分的含量，計(jì)算新芒果苷、芒果苷、阿魏酸、仙茅苷、朝藿定B、淫羊藿苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為102.2%、98.9%、99.4%、100.8%、100.0%、99.4%、101.2%、98.1%，RSD分別為2.37%、1.33%、2.84%、1.64%、1.89%、3.27%、2.10%、2.54%，表明本法回收率良好，符合要求。

2.3.8 含量測(cè)定 取各供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，每份樣品平行測(cè)3份，記錄色譜峰面積，計(jì)算二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分中各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表1、2。從表1可以看出，3批二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分中新芒果苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.29%，芒果苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.63%，阿魏酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.32%，仙茅苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.84%，朝藿定B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.91%，淫羊藿苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.64%，鹽酸巴馬汀的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.94%，鹽酸小檗堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.85%。表2為室溫放置24個(gè)月的樣品，16批樣品中二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分中主要有效成分的含量都有不同程度的降低，以黃柏小檗堿類成分的含量降低的最為明顯。

表1 3批二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分中主要成分的含量測(cè)定結(jié)果

表2 16批二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分放置24月后主要成分的含量測(cè)定結(jié)果

2.4 二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的鎮(zhèn)痛作用

抑制率＝(對(duì)照組小鼠扭體數(shù)－給藥組小鼠扭體數(shù))/對(duì)照組小鼠扭體數(shù)

結(jié)果如表3所示，消炎痛組小鼠扭體次數(shù)比對(duì)照組小鼠顯著降低（＜0.01），抑制率為68.5%。二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分低、中、高劑量組小鼠扭體次數(shù)均比正常對(duì)照組減少，抑制率分別為17.1%、26.9%和35.4%，中、高劑量組小鼠扭體次數(shù)與對(duì)照組比較有顯著性差異（＜0.05、0.01），表明二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分具有較好的鎮(zhèn)痛作用。

表3 二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用(, n = 10)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01。

*< 0.05**< 0.01control group.

2.5 二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分對(duì)成骨細(xì)胞的作用

將UMR-106成骨細(xì)胞用含l0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制成濃度為3×104/mL的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL的體積接種于96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后給藥，陰性對(duì)照組只加含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，其余各組分別加入含二仙湯提取物5、10、20 μg/mL的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h和72 h，MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖。按照上述方案處理成骨細(xì)胞，培養(yǎng)至6 d時(shí)，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的活性，以每孔中每mg蛋白釋放的對(duì)硝基苯酚的nmol數(shù)表示ALP的活性。

UMR-106成骨細(xì)胞按每孔1×105的細(xì)胞數(shù)接種于24孔板內(nèi)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，換含0.1% BSA的新鮮DMEM使細(xì)胞適應(yīng)，12 h后換終濃度為1.0 nmol/L的含藥骨結(jié)節(jié)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（0.1%白蛋白，10.0 nmol/L地塞米松，0.01 mol/L β-甘油磷酸鈉和50 μg/mL抗壞血酸以及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基），其中二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的質(zhì)量濃度分別為5、10、20 μg/mL，每3天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)觀察14 d后進(jìn)行骨結(jié)節(jié)染色。倒置相差顯微鏡200倍下觀察并計(jì)數(shù)每孔內(nèi)20個(gè)隨機(jī)視野內(nèi)骨結(jié)節(jié)的數(shù)量，以紅色結(jié)節(jié)和邊界清晰為準(zhǔn)，取平均值，結(jié)果以骨結(jié)節(jié)數(shù)目/孔表示[10]。骨形成受2個(gè)不同的過(guò)程調(diào)控，即新的成骨細(xì)胞的形成和成骨細(xì)胞產(chǎn)生骨基質(zhì)的活性。堿性磷酸酶是骨重建過(guò)程中的關(guān)鍵酶，能夠促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化[11-12]。如表4所示，二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分在5、10、20 μg/mL的質(zhì)量濃度下作用48 h和72 h，顯著促進(jìn)UMR-106成骨細(xì)胞的增殖；作用6 d后，顯著增加成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性；作用12 d后，顯著增加成骨細(xì)胞骨鈣結(jié)節(jié)的形成，這些結(jié)果表明二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分通過(guò)增加成骨細(xì)胞的數(shù)目、成骨細(xì)胞的活性和促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化增加骨質(zhì)的形成。

表4 二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分對(duì)成骨細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性和骨鈣結(jié)節(jié)形成的影響(, n = 8)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01。

*< 0.05**< 0.01control group.

2.6 二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分對(duì)破骨細(xì)胞的作用

將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)在含25 ng/mL的核刺激因子-κB受體配體（receptor activator for nuclear factor kappa B ligand，RANKL）和30 ng/mL的巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage-stimulating factor，MCSF）的DMEM培養(yǎng)基中72 h，即分化為多核的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞。將1×105/mL RAW264.7細(xì)胞懸浮于含25 ng/mL RANKL和30 ng/mL MCSF的DMEM培養(yǎng)基中，接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，換含質(zhì)量濃度為5、10、20 μg/mL的二仙湯提取物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h和72 h，進(jìn)行破骨細(xì)胞增殖測(cè)定，以評(píng)價(jià)二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分對(duì)破骨細(xì)胞是否有細(xì)胞毒作用。

破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶的活性與破骨細(xì)胞的骨吸收活性直接相關(guān)[13]。如表5所示，二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的質(zhì)量濃度在5～20 μg/mL內(nèi)抑制破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶的活性，在10、20 μg/mL的質(zhì)量濃度下作用72 h時(shí)，抑制率分別達(dá)到30.9%和47.4%。

RAW264.7細(xì)胞在RANKL和MCSF的誘導(dǎo)下分化為破骨細(xì)胞，成熟破骨細(xì)胞吸收骨基質(zhì)，在骨片上形成吸收陷窩。用5、10、20 μg/mL的二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分處理破骨細(xì)胞12 d，與對(duì)照組相比，骨片表面形成的骨吸收陷窩的面積分別減少21.4%、24.8%和36.9%。這些結(jié)果表明二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分在5、10、20 μg/mL的質(zhì)量濃度下，劑量相關(guān)性降低破骨細(xì)胞的骨吸收作用。

表5 二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分對(duì)由RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性和骨吸收陷窩面積的影響(, n = 8)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01。

*< 0.05**< 0.01control group.

3 討論

二仙湯是臨床治療婦女更年期綜合征和骨質(zhì)疏松癥的常用方劑[14-16]。本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)其抗骨質(zhì)疏松有效成分和有效組分研究的基礎(chǔ)上，研究了二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的化學(xué)指紋圖譜和主要有效成分的含量測(cè)定方法，并進(jìn)一步明確了其鎮(zhèn)痛和對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的調(diào)控作用，為二仙湯方劑的質(zhì)量控制及將其研制成抗骨質(zhì)疏松的創(chuàng)新藥物奠定了基礎(chǔ)。本研究建立了二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的指紋圖譜，對(duì)流動(dòng)相（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水溶液洗脫能力較好，色譜分離較好；采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)下對(duì)二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分樣品進(jìn)行掃描，270 nm波長(zhǎng)下出峰數(shù)量較多且峰形良好；對(duì)柱溫進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)柱溫在23～25 ℃時(shí)分離度良好；對(duì)體積流量、不同酸濃度等耐用性進(jìn)行了考察，體積流量在0.8～1.2 mL/min，酸濃度在0.8%～1.2%對(duì)色譜峰無(wú)明顯影響，最后優(yōu)選甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，柱溫25 ℃，體積流量1 mL/min，波長(zhǎng)270 nm的色譜條件。

中藥指紋圖譜技術(shù)是目前公認(rèn)的天然藥物質(zhì)量控制的有效方式之一，突破以單一指標(biāo)或幾個(gè)化學(xué)成分評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量的局限，可以較為全面的反映中藥所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量[17-19]。骨質(zhì)疏松癥是由于參與骨重建的成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收的平衡被破壞，使得骨吸收大于骨形成，導(dǎo)致骨丟失和骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[20-21]。

二仙湯由淫羊藿、仙茅、知母、黃柏、當(dāng)歸和巴戟天6味中藥組成[22]。淫羊藿黃酮、仙茅酚苷、知母黃酮和皂苷、黃柏小檗堿和當(dāng)歸有機(jī)酸、巴戟天蒽醌和環(huán)烯醚萜苷為其相應(yīng)藥材的活性成分，也有研究表明上述化學(xué)成分對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能均有顯著的調(diào)控作用，為二仙湯抗骨質(zhì)疏松的有效成分[23-26]。本研究在前期制備二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的基礎(chǔ)上，研究建立了其指紋圖譜，并進(jìn)一步建立了多成分的含量測(cè)定方法，為二仙湯有效組分的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分指紋圖譜研究中，確認(rèn)了16個(gè)共有峰，以表征有效組分的含量，并通過(guò)加入對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了8個(gè)共有峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)，明確了其歸屬藥材。我們也試圖進(jìn)一步明確16個(gè)共有峰中其余8個(gè)共有峰的歸屬，但是由于6味藥材所含化學(xué)成分復(fù)雜，采用相同的色譜方法和條件獲得的6味藥材單獨(dú)HPLC圖譜，與對(duì)照指紋圖譜比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)不同的藥材會(huì)具有相同色譜保留時(shí)間，尚沒(méi)有明確每個(gè)共有峰的確切的歸屬藥材。

另外，由于HPLC-DAD分析技術(shù)在靈敏度和對(duì)無(wú)紫外吸收的皂苷類成分檢測(cè)方面的不足，本研究所建立的指紋圖譜和含量測(cè)定方法尚不能表征二仙湯中含量較低的化學(xué)成分及知母皂苷類成分的結(jié)構(gòu)類型和含量。因此，后續(xù)有必要進(jìn)一步應(yīng)用UPLC-MS等技術(shù)鑒定共有峰所代表的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，以明確每個(gè)共有峰的歸屬藥材，并對(duì)含量較低及無(wú)紫外吸收的皂苷類成分進(jìn)行定性和定量分析，以全面控制二仙湯有效組分的質(zhì)量。

骨質(zhì)疏松癥是由于骨代謝紊亂導(dǎo)致的骨丟失，其臨床表現(xiàn)為腰腿疼痛。課題組前期研究表明二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分能夠增加維甲酸和去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度，改善骨組織微結(jié)構(gòu)，顯示出良好的抗骨質(zhì)疏松作用。

本研究進(jìn)一步觀察了二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分在醋酸扭體小鼠的鎮(zhèn)痛作用及對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的調(diào)控作用，結(jié)果表明二仙湯有效組分能夠有效緩解醋酸扭體小鼠的疼痛反應(yīng)，增加成骨細(xì)胞的形成、分化和骨礦化結(jié)節(jié)形成，抑制破骨細(xì)胞的形成、分化和骨吸收作用，進(jìn)一步確證了其對(duì)骨代謝的調(diào)控作用及對(duì)骨質(zhì)疏松臨床癥狀的緩解作用。后續(xù)有必要深入研究二仙湯抗骨質(zhì)疏松有效組分的化學(xué)組成、多成分多靶點(diǎn)調(diào)控骨代謝的機(jī)制及其臨床應(yīng)用的安全性，為將其研制成新型抗骨質(zhì)疏松癥的組分中藥奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Establishment of fingerprint and content determination of multi-components for antiosteoporotic active fraction from Er-xian decoction and research on its analgesic and bone metabolism regulating effects

LIU Yan, LIU Yuling, SHEN Yi, DU Jinman, ZHAO Qiming, YE Xinyuan, ZHANG Quanlong, QIN Luping, ZHANG Qiaoyan

School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

To establish the fingerprint and multi-component content determination method of antiosteoporotic active fraction from Er-xian decoction, and lay a foundation for the development of antiosteoporotic component Chinese medicine based on Er-xian decoction.A Agilent ZorBax Extend C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was selected for HPLC fingerprint detection; the mobile phase is consist of acetonitrile-0.1% aqueous phosphoric acid solution (containing 0.025% sodium dodecyl sulfate); gradient elution: 0—30 min, 4%—30% acetonitrile; 30—50 min, 30%—50% acetonitrile; 50—60 min, 50%—90% acetonitrile; flow rate is 1 mL/min; column temperature is 25 ℃; detection wavelength is 270 nm. The “” was used to evaluate the similarity; the common peaks were identified by comparison with reference compounds. The gradient elution for content determination was adjusted to: 0—25 min, 10%—18% acetonitrile; 25—35 min, 18%—19% acetonitrile; 35—40 min, 19%—25% acetonitrile; 40—50 min, 25%—32% acetonitrile; 50—60 min, 32%—55% acetonitrile and the contents of eight active components were determined. The analgesic effect of the effective components of Er-xian decoction and the regulation of bone metabolism were evaluated in mice with acetic acid twist body, osteoblasts and osteoclasts.The HPLC fingerprints of active fraction from Er-xian decoction were established, and 16 common peaks were identified. The similarity of 16 batches of samples comparison with reference fingerprint was more than 0.9. Eight common peaks (peaks 1, 4, 10—12, 13, 15, 16) were identified as neomangiferin, mangiferin, ferulic acid, curculigoside, epimedin B, icariin, palmatine hydrochloride and berberine hydrochloride. The linear relationship, repeatability, stability, precision and recovery in content determination meet the requirements. The antiosteoporotic active fraction from Er-xian decoction had a significant analgesic effect in the mouse acetate twist body model, and increased the formation of osteoblasts and mineralization of bone matrix, and inhibited the bone resorption of osteoclasts.The established HPLC fingerprint and multi-component content determination method of antiosteoporotic active fraction from Er-xian decoction could accurately, efficiently and comprehensively evaluate its quality, and provide a basis for its quality control.

Er-xian decoction; osteoporosis; fingerprint; multicomponent determination; high-performance liquid chromatography; neomangiferin; mangiferin; ferulic acid; curculigoside; epimedin B; icariin; palmatine hydrochloride; berberine hydrochloride; analgesia; quality control

R283.6

A

0253 - 2670(2024)09 - 2923 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.007

2023-10-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82374099）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81973534）

劉 燕，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞旨捌渥饔谩-mail: 2587175184@qq.com

通信作者：張巧艷，教授，從事中藥活性成分及其作用機(jī)制研究。E-mail: zqy1965@163.com

秦路平，教授，從事中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)和資源開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]