8種蜀葵花型花粉形態(tài)1)

陳曦 李意峰 劉才磊 賈茵 潘遠(yuǎn)智 姜貝貝 李秀 朱章順 李方文 劉曉莉

(成都市植物園,成都,610083) (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)) (成都市植物園)

蜀葵(Alcearosea)為錦葵科(Malvaceae)蜀葵屬(Alcea)多年生直立草本[1],原產(chǎn)于我國四川地區(qū),又名棋盤花、一丈紅、餅子花等,其觀賞價(jià)值極高,在世界各地廣泛栽植。由于蜀葵屬于兼性異交型植物[2],極易雜交,因此表現(xiàn)出豐富多彩的表型變異,如株型上可分為高桿型和矮生型;花色有白、黃、粉、橙、紅、紫、黑等色系;花型有單瓣型、復(fù)瓣型、疏球型、密球型、托桂型、玉蕊型、皇冠型、繡球型等[3]。豐富的表型變異也使得蜀葵不同品種之間親緣關(guān)系不明,品種分類模糊不清,不利于對其進(jìn)一步開發(fā)利用。

目前,蜀葵的研究主要集中在非生物脅迫[4-6]、化學(xué)成分提取[7-9]等方面,而蜀葵花粉形態(tài)的相關(guān)研究未見報(bào)道。植物的花粉形態(tài)特征受外界環(huán)境影響較小,主要由基因控制,并且有著很強(qiáng)的遺傳保守性和穩(wěn)定性[10]。彭煥文等[11]對錦葵科15個(gè)屬下26個(gè)分類群體的花粉形態(tài)進(jìn)行研究,認(rèn)為花粉形態(tài)及外壁形貌特征等對錦葵科不同物種的劃分有很大的分類學(xué)意義。近年來,對同一種內(nèi)不同品種間的花粉形態(tài)差異也開展了一系列研究,如錦葵科的木芙蓉(Hibiscusmutabilis)[12]與木槿(H.syriacus)[13]等,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同品種間花粉形態(tài)也具有一定的差異,可以作為品種劃分以及品種間親緣關(guān)系研究的重要依據(jù)。

為了探究蜀葵不同花型間的差異及其親緣關(guān)系,本試驗(yàn)以8種花型的蜀葵花粉為研究對象,利用掃描電鏡對花粉形態(tài)特征及表面紋飾進(jìn)行觀測,探究其孢粉差異,通過聚類分析和主成分分析探討蜀葵不同花型種質(zhì)間的親緣關(guān)系,旨在為蜀葵花型多樣性研究及親緣關(guān)系研究提供孢粉學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

植物材料:以栽植于成都市植物園(104°8′11.274″E,30°46′13.573″N)8種花型的粉紫色(RHS2019 75B Light Purple)矮生型蜀葵為供試材料,8種花型分別為單瓣型(S)、星火型(L)、復(fù)瓣型(D)、疏球型(B)、火炬型(F)、托桂型(T)、錦蕊型(X)、玉蕊型(Y,圖1)。

S為單瓣型;D為復(fù)瓣型;B為疏球型;L為星火型;F為火炬型;T為托桂型;X為錦蕊型;Y為玉蕊型。圖1 8種蜀葵花型

花粉采集和處理:參考張璐等[12]的方法,2022年6月在蜀葵盛花期選取健康植株中部花朵,用剪刀取下完整雄蕊柱,從雄蕊柱上剝離花粉囊后混合均勻,硫酸紙包裹后在烘箱中60 ℃烘干24 h,收集自然散粉,保存于離心管中備用待測。

電鏡制樣及花粉形態(tài)觀察:用授粉筆蘸取適量干燥后的花粉輕刷于導(dǎo)電膠上,真空噴金鍍膜30 s,在ZEISS Gemini 300型掃描電子顯微鏡下選取有代表性的視野,觀察花粉粒形態(tài)和外壁紋飾特征,選取放大200倍視野拍攝花粉粒的直徑,選取放大1 400倍視野拍攝單個(gè)花粉粒的外壁紋飾特征,分別選取5 000倍和15 000倍放大倍數(shù)拍攝花粉細(xì)節(jié)及刺的形態(tài)。參考彭煥文等[11]、劉金蘭等[14]對錦葵科植物花粉的觀測方法,花粉形態(tài)術(shù)語參考Christensen[15]、王開發(fā)等[16]研究進(jìn)行描述。每個(gè)樣品隨機(jī)選取20粒花粉,對蜀葵花粉粒的直徑、刺長、刺基寬、刺數(shù)量(單面)、突起數(shù)量(單面)等指標(biāo)進(jìn)行測量。

數(shù)據(jù)處理:試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件制表,使用SPSS 26軟件進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05),SPSS 26對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析、R型聚類分析和Q型聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉形態(tài)及紋飾特征

花粉特征和大小:由圖2、圖3和表1可知,8種花型的蜀葵花粉粒均為單粒近球形。不同花型的花粉(不含刺)直徑為102.93～114.20 μm,平均為110.52 μm,變異系數(shù)為3.40%,屬于很大型花粉粒。其中,火炬型花粉直徑最大,為114.20 μm,疏球型最小,為102.93 μm,變異系數(shù)分別為2.75%、4.61%。

表1 蜀葵花粉形貌特征

S為單瓣型;D為復(fù)瓣型;B為疏球型;L為星火型;F為火炬型;T為托桂型;X為錦蕊型;Y為玉蕊型。圖2 蜀葵花粉群體形態(tài)

外壁紋飾:蜀葵8種花型花粉外壁均有刺狀紋飾(圖4、圖5),具體表現(xiàn)為二型刺,其突起(第二型刺)明顯短于第一型刺,形似瘤狀突起,先端圓滑。測量其第一型刺的長度,8種花型的刺長為8.11～10.30 μm,平均為9.39 μm,變異系數(shù)為6.94%。復(fù)瓣型的刺最長,為10.30 μm,托桂型的刺最短,為8.11 μm,變異系數(shù)分別為16.55%、10.19%。刺基寬為4.01～4.80 μm,平均為4.32 μm,變異系數(shù)為5.97%。其中,單瓣型最寬,為4.80 μm,錦蕊型最窄,為4.01 μm,變異系數(shù)分別為16.06%、16.20%。刺間距為12.96～16.33 μm,平均值為14.96 μm,變異系數(shù)為6.47%。其中,復(fù)瓣型的刺間距最大,為16.33 μm,疏球型的刺間距最小,為12.96 μm,變異系數(shù)分別為11.95%、16.40%。錦蕊型和玉蕊型的刺長、刺基寬比最大,為2.39,說明刺狀紋飾表現(xiàn)為細(xì)長型;托桂型的刺長、刺基寬比最小,為1.82,說明刺狀紋飾表現(xiàn)為粗短型。刺的數(shù)量(單面)為88.50～103.75枚,平均為96.69枚,變異系數(shù)為4.85%。其中,疏球型的刺數(shù)量最多,為103.75枚,復(fù)瓣型的刺數(shù)量最少,為88.50枚。突起數(shù)量(單面)為140.75～200.75枚,平均為170.95枚,變異系數(shù)為11.54%。其中,托桂型最多,為200.75枚,疏球型的最少,為140.75枚。

S為單瓣型;D為復(fù)瓣型;B為疏球型;L為星火型;F為火炬型;T為托桂型;X為錦蕊型;Y為玉蕊型。圖4 蜀葵花粉外壁紋飾形態(tài)

S為單瓣型;D為復(fù)瓣型;B為疏球型;L為星火型;F為火炬型;T為托桂型;X為錦蕊型;Y為玉蕊型。圖5 蜀葵花粉刺部形態(tài)

萌發(fā)孔:蜀葵花粉具有大量散孔,孔呈圓形,密布于整個(gè)花粉表面。復(fù)瓣型、疏球型具有十分明顯的萌發(fā)孔(圖6),且單面觀測到的萌發(fā)孔在140枚左右;玉蕊型在眾多花粉粒中僅觀察到一粒含有157枚萌發(fā)孔的花粉粒;單瓣型、星火型、火炬型、托桂型、錦蕊型等并未發(fā)現(xiàn)有明顯的萌發(fā)孔,但星火型、錦蕊型在萌發(fā)孔位置處發(fā)現(xiàn)一些輕微的坑狀形態(tài),推測可能是由于萌發(fā)孔被某些物質(zhì)堵塞,所以觀察不到。

S為單瓣型;D為復(fù)瓣型;B為疏球型;L為星火型;F為火炬型;T為托桂型;X為錦蕊型;Y為玉蕊型。圖6 蜀葵花粉萌發(fā)孔形態(tài)

2.2 蜀葵花粉形貌特征聚類分析

為分析所選指標(biāo)之間的相關(guān)性,先進(jìn)行R型聚類分析,選取代表性強(qiáng)的指標(biāo)進(jìn)行下一步分析[14]。由蜀葵花粉形貌特征R型聚類分析圖(圖7)可知,刺長和刺長刺基寬比、刺基寬和突起數(shù)量、直徑和刺間距相關(guān)性較大,整體所選取的各性狀指標(biāo)較為分散,說明選取指標(biāo)較為合理。此外,為確保所選指標(biāo)的有效性與相關(guān)性,對花粉直徑、刺長、刺基寬、刺間距、刺數(shù)量、突起數(shù)量、刺長刺基寬比7個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。由表2、3結(jié)果可知,2個(gè)主成分可以包含蜀葵花粉形態(tài)的大部分信息,累計(jì)貢獻(xiàn)率為82.37%,且各主成分所含指標(biāo)具有代表性。其中,第一主成分主要包括突起數(shù)量、刺長刺基寬比、刺基寬、刺長、花粉直徑;第二主成分為刺數(shù)量、刺間距。雖然R型聚類發(fā)現(xiàn)刺長和刺長刺基寬比、刺基寬和突起數(shù)量、直徑和刺間距等指標(biāo)相關(guān)性較強(qiáng),但在主成分分析中發(fā)現(xiàn)它們都具有很強(qiáng)的貢獻(xiàn)率,故都予以保留,綜合R型聚類分析和主成分分析結(jié)果用于下一步Q型聚類分析。

表2 蜀葵花粉形貌特征主成分分析得分

表3 蜀葵花粉形貌特征主成分分析結(jié)果

以花粉直徑、刺長、刺基寬、刺間距、刺數(shù)量、突起數(shù)量、刺長刺基寬比為指標(biāo),對蜀葵的8種花型采用瓦爾德法進(jìn)行Q型聚類分析。結(jié)果(圖8)表明,當(dāng)遺傳距離為15時(shí),8個(gè)花型可分為3大類,類型Ⅰ包含星火型、玉蕊型、錦蕊型、復(fù)瓣型4種花型,該類型突起數(shù)量中等(155～180枚)、刺表現(xiàn)為細(xì)長(刺長、刺基寬比≥2.29)的特征;類型Ⅱ僅有疏球型1種花型,該類型表現(xiàn)為花粉粒直徑最小(直徑<103 μm)、刺間距最小(刺間距<13 μm)、刺數(shù)量最多(刺數(shù)量>103枚)、突起數(shù)量最少(突起數(shù)量<141枚)等特征;類型Ⅲ有單瓣型、火炬型、托桂型3種花型,該類型突起數(shù)量最多(突起數(shù)量>182枚)、刺長最短(刺長<9.20 μm)、刺基部最寬(刺基寬>4.40 μm),刺表現(xiàn)為短而粗(刺長、刺基寬比≤2.01)的特征。

圖8 蜀葵花粉形貌特征Q型聚類分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

花粉形態(tài)及表面紋飾具有特異性,且包含有大量信息,這些特征主要受基因控制,因此,遺傳穩(wěn)定性和保守性較強(qiáng)[17]。目前,已有龍膽科(Gentianaceae)[10]、薔薇屬(Rosa)[18]、杜鵑屬(Rhododendron)[19]、葡萄屬(Vitis)[20]等許多植物利用花粉形態(tài)進(jìn)行種屬間分類和親緣關(guān)系分析的相關(guān)研究。還有研究表明,植物花粉形態(tài)及表面紋飾不僅在種屬上具有差異,在種下品種分類中也起到了關(guān)鍵作用,如木芙蓉[12]、木槿[13]、小蒼蘭(Freesiarefracta)[21]、玉蘭(Yulaniadenudata)[22]等植物利用品種間的花粉形態(tài)差異進(jìn)行了分類和親緣關(guān)系研究。

據(jù)研究,錦葵科植物花粉進(jìn)化方向?yàn)榛ǚ郾砻娲逃啥痰介L,由鈍至尖[11-12]。本研究中,第Ⅲ類包含單瓣型、火炬型和托桂型3種花型,刺長、刺基寬比最小(刺長、刺基寬比≤2.01),說明刺表現(xiàn)為短粗的特征,推斷這3種花型親緣關(guān)系更近,且屬于較為原始的花型,也印證了重瓣花是由單瓣花演變而來的結(jié)論。類型Ⅰ中,錦蕊型和玉蕊型的刺長、刺基寬比(2.39)最大,說明它們的刺最為細(xì)長,可能是8種花型中最進(jìn)化的類群,這兩種花型的雌蕊都發(fā)生了瓣化,表型亦反映出其屬于更為進(jìn)化的花型。通過Q型聚類分析圖可見,當(dāng)遺傳距離為15時(shí),疏球型單獨(dú)聚為一類,該花型的雄蕊大量退化,只在花瓣中夾雜少量花粉,由圖2B可見,許多花粉粒干癟且刺凌亂,這種現(xiàn)象應(yīng)該與雄蕊大部分退化導(dǎo)致花粉形態(tài)受損有關(guān),因此,孢粉與花的表型表現(xiàn)一致。

本研究中,蜀葵花粉粒的萌發(fā)孔數(shù)量(單面)為139～157枚,但花粉粒直徑、刺長同彭煥文等[11]觀測到的數(shù)據(jù)有一定出入,原因是其采用鮮活花粉粒直接噴金鍍膜后進(jìn)行觀測,鮮活花粉粒會(huì)比干燥脫水后的更加膨大。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),有些花型的蜀葵花粉萌發(fā)孔不明顯,呈現(xiàn)輕微的坑狀,這種現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在不同花型中,還出現(xiàn)在同種花型的不同花粉粒之間,該現(xiàn)象也在木芙蓉的研究中被發(fā)現(xiàn),據(jù)研究,木芙蓉一些品種的萌發(fā)孔含有孔蓋[12],另外,萌發(fā)孔會(huì)分泌一些物質(zhì)將孔堵塞。萌發(fā)孔可以分為簡單孔和復(fù)雜孔,復(fù)雜孔外壁兩層在孔處分離形成孔室,蜀葵部分花型的萌發(fā)孔不易被觀察到,是否由于含有孔蓋,或者因不同花粉粒所處發(fā)育時(shí)期不同而分泌的物質(zhì)將孔室堵塞還有待進(jìn)一步探討。

已有研究表明,花粉外壁包含柱狀層和覆蓋層,二者排列方式和加厚程度不同,導(dǎo)致了花粉外表各種紋飾的差異[16]。透射電子顯微鏡(TEM)可以觀察花粉內(nèi)部結(jié)構(gòu)及花粉外壁層次構(gòu)造,孫京田等[23]利用透射電鏡對蜀葵等7種錦葵科植物花粉壁進(jìn)行觀察,結(jié)果表明,不同種之間花粉內(nèi)外壁厚度等存在顯著差異,蜀葵花粉外壁厚約為7.36 μm,蜀葵的刺狀紋飾由覆蓋層加厚形成,柱狀層基本不參與刺的形成。因此,在后續(xù)的研究中可以利用透射電鏡對蜀葵花粉壁超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀測,結(jié)合掃描電鏡觀測孢粉表面形態(tài),更加深入地探討不同花型間的孢粉差異。此外,張良英等[24]利用掃描電鏡對懸鉤子屬(Rubus)野生種及栽培品種進(jìn)行花粉形態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)二者外壁紋飾存在差異,且野生種的外壁紋飾更加豐富。為了更好探究蜀葵花型之間的親緣關(guān)系,后續(xù)研究中可以對野生蜀葵展開孢粉學(xué)研究,這對于探討蜀葵花型間的親緣關(guān)系及演化進(jìn)程十分重要。

本研究通過對蜀葵8種不同花型的花粉形態(tài)進(jìn)行觀測發(fā)現(xiàn),蜀葵8種花型花粉直徑平均為110.52 μm,刺長平均為9.39 μm,刺基寬平均為4.32 μm,刺數(shù)量(單面)平均為96.69枚,突起數(shù)量(單面)平均為170.95枚。通過聚類分析發(fā)現(xiàn),8種花型可以分為3大類,類型Ⅰ包含星火型、玉蕊型、錦蕊型和復(fù)瓣型;類型Ⅱ僅疏球型;類型Ⅲ含單瓣型、火炬型和托桂型。這為今后蜀葵花型鑒定以及品種分類提供了孢粉學(xué)依據(jù),在蜀葵新品種的培育及蜀葵資源的開發(fā)利用等方面具有重要意義。